Name: Développement et Validation d’une seule molécule ultrasensible de tableau numérique Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human interféron-α (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Découvrez le développement d'un assay digital ELISA par single molecule array pour la détection ultra-sensible de l'interféron-alpha humain. Cette méthode permet la découverte de biomarqueurs dans les maladies auto-immunes et infectieuses.

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DD et CJJ souligner le soutien de l’ANR (projet IFNX, aucun. CE17001002) et ImmunoQure AG pour la fourniture des anticorps monoclonaux. Nous remercions Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki et Pierre Quartier de fournir des échantillons cliniques. CJJ reconnaît l’European Research Council (GA 309449 : bourse pour CJJ) et une subvention d’Etat géré par l’Agence nationale de la recherche (France) en vertu du programme « Investissements pour l’avenir », portant la référence ANR-10-IAHU-01.

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons décrit dans les présentes, le développement et la validation d’une molécule hautement reproductible, ultrasensible tableau numérique ELISA pour la quantification directe de protéine IFN-α dans des échantillons humains (étapes résumées dans le tableau 1). Une des étapes plus critiques dans le développement du dosage est le choix de la paire anticorps16, avec les caractéristiques en termes de cinétique et épitope liaison clé à un essai réussi. Il est important d’éviter l’utilisation d’anticorps monoclonaux appariés qui ciblent le même épitope ou qui cause empêchement stérique. Des anticorps polyclonaux pourraient servir d’anticorps de détection pour surmonter ces limitations. Si à une étape donnée la sensibilité souhaitée n’est pas atteint, possibilités d’optimisation doivent être examinées. Ceci peut inclure l’utilisation de paires de rechange anticorps, modifications des paramètres comme le type de protéine (p. ex. BSA < caséine), pH (6,0-8,5), force ionique, capacité tampon (p. ex. les concentrations de NaCl et de phosphate), perles de transporteur ou présence d’agents tensio-actifs. Une large gamme de paramètres con optimisée lors du développement d’un test de tableau seule molécule. Toutefois, dans l’ensemble, les conditions qui donnent aux ratios signal : ambiants et LODs minimes sont ceux préféré (voir la Figure 1, Figure 2et Figure 3).
Au sujet de la spécificité, le dosage de l’IFN-α a montré aucune réactivité croisée pour n’importe quel autres interférons ne testé (β, γ, λ1, λ2, ω) (Figure 4 a) et a été capable de détecter tous les sous-types d’IFN-α 13 (Figure 4 b). Toutefois, l’analyse a montré une affinité plus faible pour le sous-type de l’IFN-α2, (Figure 4 b et 4 de Table supplémentaire). Fait intéressant, des sensibilités différentes pour les différentes catégories d’IFN-α2 (a, b, c) ont aussi été observées, qui peut être due à des procédés de fabrication distinctes ou des séquences d’acides aminés différents, comme les sous-types d’IFN-α2 proviennent de différents utilitaires fournisseurs. À cette seule exception, toutes les espèces de l’IFN-α a donné des réponses très similaires. La spécificité de l’essai a été davantage démontrée par prétraitement des échantillons avec un anti-IFN-α un clone, qui a abrogé le signal (Figure 6 et supplémentaires Tableau 6).
L’un des principaux avantages de cette technologie est que toute substance d’intérêt peut être potentiellement ciblées16. En outre, différents spécimens biologiques peuvent être testés, comme le sérum, plasma, liquide céphalorachidien, lysats cellulaires, les surnageants de culture31 et même souffle32. Habituellement, une dilution de 1:3 de plasma est effectuée pour éviter l’obstruction des potentiels de l’analyseur de tableau seule molécule. Toutefois, l’analyte d’intérêt pourrait être présent en très faibles concentrations dans l’échantillon biologique pertinente et des concentrations plus élevées de l’échantillon peuvent être nécessaire (selon la sensibilité de l’éssai)33. Bien qu’il y a potentiel pour le multiplexage tout en conservant la bonne sensibilité34, c’est un processus plus difficile et des essais pour mesurer plus de 6 protéines à l’intérieur les mêmes expériences ont encore d’être mis au point35.
La capacité de détecter et de quantifier des cytokines et autres protéines biologiques pertinentes à ces faibles concentrations ouvre une toute nouvelle gamme d’applications33,,36. Il est bien connu que les nombreuses protéines exercent leurs effets même à très faibles concentrations, qui jusqu'à présent étaient inférieures au seuil de détection de la meilleure des tests ELISA37. Alors que les autres technologies d’immunoessai offrent des avantages sur les classiques ELISA19, nous démontrons ici que seule molécule tableau numérique ELISA est une plate-forme fiable et reproductible pour la détection ultrasensible des cytokines de faible concentration en échantillons humains. Par conséquent, cette technologie offre un énorme potentiel pour la découverte de biomarqueurs et une meilleure gestion de patients d’un large éventail de maladies.

Type j’ai interférons sont une famille de cytokines qui jouent un rôle central dans l’orchestration des réponses immunitaires antivirales. Ils ont été découverts par Isaacs et Lindenmann 60 ans il y a1,2 et il sait maintenant que cette famille hétérogène de polypeptides comprend 14 différentes sous-classes (13 sous-types d’IFN-α et 1 IFN-β). Type I IFNs sont essentiels à l’apurement des infections virales, mais ont également été impliqués dans la pathologie des divers États de la maladie humaine, y compris les maladies auto-immunes lupus érythémateux systémique (les), dermatomyosite juvénile (JDM), et le type J’ai interferonopathies dans quel type de comportement j’induite par l’IFN signalisation résulte en pathologie3,4,5,6,7.
Étudier la protéine IFN de type I dans les échantillons biologiques a été difficile depuis son identification initiale comme une « ingérence substance »1,2. Actuellement, "sandwich" Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) est la méthode la plus largement utilisée pour la détection de la protéine de l’IFN-α. En dépit d’être précis, simple et rapide, j’ai taper présentes limitations importantes IFN ELISA, comme la sensibilité limitée. En outre, la mesure de tous les sous-types de l’IFN-α nécessite l’utilisation de multiples essais chaque avec leur propre capacité de détection et de la sensibilité. Bien qu’il existe des tests ELISA commerciales détectant les différents sous-types de l’IFN-α, leur sensibilité est limitée (1,95 pg/mL, 12,5 pg/mL et 12,5 pg/mL, respectivement) qui est souvent insuffisant pour détecter les protéines de l’IFN-α dans des échantillons biologiques. Pour contourner cette limitation, les proxy biologique plusieurs épreuves ont été développées pour quantifier de type I NIA en mesurant l’expression des gènes induits ou activité fonctionnelle8,9,10,11, 12 , 13 , 14. Néanmoins, ces tests ne fournissent pas une mesure directe de la protéine de l’IFN-α.
Dans cette étude, seule molécule tableau numérique ELISA technologie a été utilisée pour développer un test permettant la détection de molécules de protéines uniques IFN-α. ELISA numérique utilise la même base en chimie comme ELISA classique, cependant, la réaction a lieu dans des tableaux comprenant 50 000 individuels 46 femtoliter taille puits15,16. Molécules protéiques unique sont capturés par des billes paramagnétiques revêtus d’anticorps et étiquetés avec un anticorps de détection biotinylé, suivi par la liaison d’un conjugué d’enzyme, streptavidine-β-galactosidase (SBG). Par la suite, les perles sont suspendues avec un substrat de l’enzyme fluorogène, résorufine-β-D-galactopyranoside (RGP), dans les tableaux de simple-molécule. En diminuant le volume réaction 2 milliards de fois17, une forte concentration locale de signal fluorescent est atteint et comtes de molécules simples devenus possibles, car chaque molécule génère un signal qui peut maintenant être fiable mesuré18. Essentiellement les tableaux seule molécule sont capables de compter immunocomplexes unique et de déterminer un nombre moyen d’enzymes par perle (AEB). Compter les micropuits où un signal est détecté permet de quantification/numérisation des molécules de protéines, tel qu’il existe une corrélation directe entre la concentration de protéines et le rapport entre immunocomplexed-perles et un nombre total de perles présentes dans les chambres de taille femtoliter.
Yeung et al. effectué une étude d’évaluation de multi-plateforme étendue à l’aide de neuf différentes technologies et quatre cytokine immuno-essais avec le but de comparer la précision du dosage, la sensibilité et la corrélation des données à travers les différentes plateformes19. Une des principales conclusions de l’étude était que les baies de la molécule unique et seule molécule comptage immuno-essai présenté la sensibilité la plus élevée pour la détection des cytokines dans le sérum humain dans le secteur de concentration sub-pg/mL. Tests de cytokine seule molécule tableau numériques ELISA ont été utilisés pour étudier le rôle de TNF-α et IL-6 dans la maladie de Crohn maladie20, IFN-α en interferonopathy et auto-immunes patients 7, et les différents modifiées post-traductionnellement formes de C-X-C motif chemokine 10 (CXCL10) hépatite chronique et de donneurs sains recevant la sitagliptine21,22. Autres applications incluent la mesure de la rhodopsine chez les patients atteints de rétinopathie diabétique23; l’étude des pathologies du cerveau par le biais de mesures de sérum/plasma des neurofilaments light24 et β-amyloïde 1-42 peptide25, dans le cadre de la sclérose en plaques et la maladie d’Alzheimer, respectivement. Molécule unique tableau dosages permet également meilleure détection de pathogènes tels que la caractérisation du réservoir viral du VIH26, ainsi que pour la détection d’ADN27 et micro RNAs28. Un avantage majeur de la technologie seule molécule est cette grande polyvalence, comme un test contre les analytes d’intérêt peut être développé si une paire de l’anticorps spécifique est disponible. En outre, homebrew test kits sont disponibles dans le commerce, permettant le développement de nouveaux tests, le protocole qui est détaillé dans une forme modifiée ci-dessous.
Ici, une description détaillée des étapes de développement et de validation pour un dosage de tableau seule molécule est présentée qui résulte en une sensibilité accrue pour la détection de protéines d’IFN-α. Pour seule molécule tableau des dosages des anticorps doivent être très précis, évitant une réactivité croisée avec les protéines apparentées (avec la spécificité d’espèce a examiné le cas échéant). Idéalement, les anticorps avec un plus petit que 10-9 M KD devraient être choisis ; affinité élevée assure une liaison forte, avec la production d’un signal plus élevé. La cinétique de la liaison anticorps-antigène sont également importantes et rapides Ksur et lent Klarge privilégiera assemblage complexe antigène-anticorps. Commençant par une paire d’anticorps ayant une bonne performance dans ELISA classique, avec une limite de détection (LD) de 1 à 100 pg/mL, augmente les chances d’obtenir un dosage de tableau très sensible seule molécule. Chang et ses collègues effectué des études détaillées de cinétiques des interactions biomoléculaires qui se produisent à chaque étape, proposant un ensemble d’équations pour prédire la sensibilité analytique18. Ils ont montré ce tableau unique molécule ELISA numérique semble être efficace dans un large éventail des affinités d’anticorps (KD ~ 10−11 - 10−9 M), ainsi que cette génération de signal dépend davantage de la sur-taux de ces anticorps.
Pour utiliser une affinité élevée anticorps que nous avons profité des anticorps isolées de patients atteints du syndrome de la polyendocrinopathie auto-immune de type 1/autoimmun dystrophie Polyendocrinopathie-candidose-ectodermique (APS1/APECED)29. Pour des raisons qui ne sont pas encore compris, la grande majorité des personnes déficientes en AIRE développer un ensemble de haut-avidité des anticorps contre sous-types29de l’IFN-α tous, et nous avons choisi deux clones d’anticorps anti-IFN-α des affinités de liaison complémentaire pour les différents sous-types de IFN-α, selon les estimations de valeurs50 IC. L’Association de ces anticorps de haute affinité uniques avec la technologie seule molécule à permis la quantification directe de l’IFN-α à des concentrations d’attomolar (µg/mL). Une détection ultrasensible de protéine IFN-α contribuera à une meilleure compréhension de la nature, la réglementation et l’impact biologique de la réponse induite par l’IFN dans les paramètres de différentes maladies.

<table><tbody><tr><td>Anticorps anti-IFN-&alpha ; A (clone 8H1)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Non disponible dans le commerce</td></tr><tr><td>Anticorps anti-IFN-&alpha ; B (clone 12H5)</td><td>ImmunoQure AG</td><td>NA</td><td>Non disponible dans le commerce</td></tr><tr><td>Anticorps anti-IFN-&alpha EBI-1 clone</td><td>eBioscience</td><td>BMS216C</td><td></td></tr><tr><td>Clone d’anticorps BMS216BK anti-IFN-alpha</td><td>eBioscience</td><td>BMS216BK</td><td>Pas un kit ELISA mais des abdos en vrac</td></tr><tr><td>IFN &alpha ; 2c</td><td>eBioscience</td><td>BMS305</td><td>OK</td></tr><tr><td>IFN & alpha ; I (17)</td><td>PBL</td><td>11150-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & alpha ; 2a</td><td>PBL</td><td>11100-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN et alpha ; 2a</td><td>PeproTech</td><td>N’est plus disponible</td><td></td></tr><tr><td>IFN &alpha ; 2b</td><td>PBL</td><td>11105-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN et alpha ; 1</td><td>PBL</td><td>11175-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN et alpha ; 4a (M1)</td><td>PBL</td><td>11177-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN et alpha ; 4b (a4)</td><td>PBL</td><td>11180-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN et alpha ; B2 (a8)</td><td>PBL</td><td>11115-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN et alpha ; C (a10)</td><td>PBL</td><td>11120-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN et alpha ; D (a1)</td><td>PBL</td><td>11125-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN et alpha ; G (a5)</td><td>PBL</td><td>11135-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN et alpha ; F (a21)</td><td>PBL</td><td>11130-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & alpha ; H2 (a14)</td><td>PBL</td><td>11145-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN et alpha ; J1 (a7)</td><td>PBL</td><td>11160-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & alpha ; K (a6)</td><td>PBL</td><td>11165-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN et alpha ; WA (a16)</td><td>PBL</td><td>11190-1</td><td></td></tr><tr><td>IFN & lambda ; 1</td><td>PeproTech</td><td>300-02L</td><td></td></tr><tr><td>IFN & lambda ; 2</td><td>PeproTech</td><td>300-02K</td><td></td></tr><tr><td>IFN &omega ;</td><td>PeproTech</td><td>300-02J</td><td></td></tr><tr><td>IFN &beta ;</td><td>PeproTech</td><td>300-02BC</td><td></td></tr><tr><td>IFN & gamma ;</td><td>PeproTech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IFN-&alpha ; ELISA</td><td>PBL</td><td>41115.1</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 96 puits</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>ISRE-Reporter</td><td>Qiagen</td><td>CCS-008L</td><td></td></tr><tr><td>Fu-GENE HD Réactif de transfection</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Sérum réduit Mediuem</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Essai Reporter à double luciférase</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitute</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>N’est plus disponible</td><td></td></tr><tr><td>Amicon micocentrifugeuse tubes - 0.5mL filtres</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC505096</td><td></td></tr><tr><td>Bead Conjugation Buffer</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Ne peut pas être commandé séparément</td></tr><tr><td>Non encodé Perles paramagnétiques</td><td>Quanterix</td><td>101360</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lavage de billes</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Ne peut pas être commandé séparément</td></tr><tr><td>EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>11844071</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de blocage de billes</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Ne peut pas être commandé séparément</td></tr><tr><td>Tampon de diluant de billes</td><td>Quanterix</td><td></td> 101362 <td></td></tr><tr><td>Détecteur et échantillon Diluant</td><td>Quanterix</td><td>101359</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de réaction de biotinylation</td><td>Quanterix</td><td>102040</td><td>Ne peut pas être commandé séparément</td></tr><tr><td>NHS-PEG4-Biotine</td><td>Fisher Scientific</td><td>11891195</td><td></td></tr><tr><td>diH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse pour tubes de microcentrifugation de 1,7 ml (Centrifugeuse Heraens Fresco 21)</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002478</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur vortex de laboratoire standard (MS2 Minishaker)</td><td></td>Pipettes <td>IKA MS2</td><td></td></tr><tr><td>(10, 20, 200 et 1000 &mu ; l)</td><td>Conseils Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(10, 20, 200 et 1000 &mu ; l)</td><td></td>Tubes de microcentrifugation Thermo Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>1,7 ml</td><td>Séparateur magnétique Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pouvant accueillir des tubes de microcentrifugation de 1,7 ml (Life Technologies DynaMag-2)</td>Mini centrifugeuse de paillasse <td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>(Galaxy MinisStar)</td>Mélangeur/agitateur <td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>(Eppendorf Thermomixer Comfort)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactifs à matrice de molécules uniques (Simoa)</td>SBG, Étiquettes à code-barres <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Quanterix</td><td>101652</td> 15 mL Bouteilles de réactifs Quanterix 102411 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simoa Spécimen 96 puits</td><td>Quanterix</td><td>101457</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Disques</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td>100001</tr><tr><td>Embouts conducteurs Simoa 2.0</td><td>Quanterix</td><td>101726</td><td></td></tr><tr><td>Simoa Cuvettes</td><td>Quanterix</td><td>100803</td><td></td></tr><tr><td>Simoa SBG Réactif</td><td>Quanterix</td><td>102295</td><td></td></tr><tr><td>Simoa RGP Réactif</td><td>Quanterix</td><td>101736</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 1</td><td>Quanterix</td><td>100486</td><td></td></tr><tr><td>Simoa System Buffer 2</td><td>Quanterix</td><td>100487</td><td></td></tr><tr><td>Huile d’étanchéité</td><td>Quanterix</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simoa HD-1 Analyzer</td><td>Quanterix</td><td>100032</td><td></td></tr><tr><td>Technologies</td><td></td><td></td><td></td></tr>Single <tr><td>molecule array (Simoa)</td><td>Quanterix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comptage de molécules uniques Systèmes d’immunodosage Erenna</td><td>Singluex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

développement et validation d’une seule molécule ultrasensible de tableau numérique enzyme-linked immunosorbent assay for human interféron-α

Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-&#945;

Le principal objectif du présent protocole est de décrire le développement et la validation d’un interféron (IFN)-essai de α seule molécule tableau numérique Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA). Ce système permet la quantification de la protéine humaine IFN-α avec une sensibilité sans précédent et aucune réaction croisée pour d’autres espèces de l’IFN.
La première étape clée du protocole est le choix de la paire d’anticorps, suivie par la conjugaison de l’anticorps de capture à billes paramagnétiques et biotinylation de l’anticorps de détection. Après cette étape, les différents paramètres tels que la configuration de l’épreuve, la concentration d’anticorps détecteur et composition du tampon peuvent être modifiés jusqu'à l’obtention d’une sensibilité optimale. Enfin, la spécificité et la reproductibilité de la méthode sont évalués afin d’assurer la confiance dans les résultats. Ici, nous avons développé un test de tableau IFN-α seule molécule avec une limite de détection de 0,69 µg/mL à l’aide d’auto-anticorps de grande affinité isolées de patients présentant des mutations bialléliques dans la protéine auto-immune regulator (AIRE) causant polyendocrinopathie auto-immune le syndrome type 1/autoimmun Polyendocrinopathie-candidose-ectodermique dystrophie (APS1/APECED). Ce qui est important, ces anticorps a permis la détection de tous les sous-types d’IFN-α 13.
Cette nouvelle méthode permet la détection et la quantification des protéines de l’IFN-α dans des échantillons biologiques humains à des concentrations d’attomolar pour la première fois. Un tel outil sera très utile dans la surveillance des niveaux de cette cytokine dans la santé humaine et les États de la maladie, plus particulièrement l’infection, l’auto-immunité et autoinflammation.

En résumé, un essai de tableau de pan-IFN-α seule molécule avec une limite de détection de 0,69 µg/mL, en utilisant une configuration 2-étape avec des perles de capture enduit 0,3 mg/ml d’anti-IFN-α un anti-IFN-α et l’anticorps B détection anticorps biotinylé, à un taux de biotine : anticorps de 30 a été développé. Les concentrations utilisées pour les anticorps de détection biotinylé et SBG étaient 0,3 µg/mL et 150 h, respectivement. Ce test très spécifique est capable de détecter tous les sous-types d’IFN-α 13 et ne réagit pas croisées avec d’autres type d’interférons. Ainsi, s’il n’est pas possible d’identifier et de quantifier chaque espèce individuelle d’IFN-α, chacun d’eux peut être détectée et mesurées ensemble en donnant une valeur de la concentration totale d’IFN-α, qui comprend les 13 différentes sous-classes.
Pour explorer la valeur diagnostique potentielle de ce nouveau test, protéine IFN-α dans le plasma et le sérum d’individus sains ont été mesurées et comparées avec des échantillons provenant de patients atteints de SLE et JDM. Tel qu’illustré à la Figure 7, niveaux élevés de protéine de l’IFN-α ont été détectés dans les deux cohortes de la maladie comparativement aux groupes témoins sains. La ligne pointillée indique la limite de détection d’un ELISA disponible dans le commerce classique, illustrant comment cette approche ne détecterait pas protéine IFN-α dans ces groupes de patients malgré l’association connue de cette cytokine avec ces phénotypes. En outre, IFN-α quantifiables sur 5 journaux de magnitude, illustrant la gamme dynamique de l’essai, avec des niveaux détectables entre 1 à 10 µg/mL, confirmant le caractère hautement sensible du dosage.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57421/57421fig7.jpg"> Figure 7 : Quantification des protéines d’IFN-α dans le plasma et le sérum de cohortes de patients. Ce chiffre a été modifié par Rodero et al. 2017. plasma de sujets témoins sains (n = 20) et les patients souffrant de SLE (n = 72) et JDM (n = 43) ont été testés avec le test de tableau de molécule unique pan-IFNα. L’analyse a effectué un test ANOVA monodirectionnelle (Kruskal-Wallis) et Dunn comparaison plusieurs tests entre les groupes. Médiane est représentée. Ligne pointillée indique LOD d’un référence humaine anti-IFN-α ELISA (1,95 pg/mL = 1950 µg/mL). <a href="/files/ftp_upload/57421/57421fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Étape</td>
			<td>Considérations</td>
			<td>Référence</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1. choix de paire anticorps</td>
			<td>Différents épitopes cibles</td>
			<td rowspan="3">Tableau 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Haute affinité</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rapide Ksur / lent Koff
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2. orientation de paire anticorps</td>
			<td rowspan="3">Choisir des conditions à la limite de détection le plus bas</td>
			<td rowspan="3">Figure 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>3. concentration d’anticorps de capture</td>
		</tr>
<tr>
<td>4. rapport biotine : détecteur</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. 2 vs 3 étapes configuration</td>
			<td>Choisissez condition avec le plus haut ratio Signal : fond</td>
			<td>Figure 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>6. concentration en anticorps détecteur</td>
			<td rowspan="2">Choisir des conditions à la limite de détection le plus bas</td>
			<td rowspan="2">Figure 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>7. concentration de SBG</td>
		</tr>
<tr>
<td>8. spécificité</td>
			<td>Évaluer la réactivité croisée</td>
			<td rowspan="2">Figure 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9. sensibilité</td>
			<td>Évaluer la reconnaissance des sous-types (si applicable)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10. reproductibilité</td>
			<td>Évaluer la variabilité du dosage</td>
			<td>La figure 5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Résumé des étapes de développement et l’optimisation d’un test de tableau unique molécule. Ce tableau résume les différentes étapes nécessaires à l’élaboration et l’optimisation d’un test de tableau molécule unique, depuis le choix initial de paire d’anticorps jusqu'à l’évaluation de la reproductibilité.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigène</td>
			<td>8H 1 (A)</td>
			<td>12H 5 (B)</td>
			<td>Sifalimumab</td>
			<td>Rontalizumab</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ1</td>
			<td>28,3</td>
			<td>51.3</td>
			<td>460</td>
			<td>22.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ2</td>
			<td>2563</td>
			<td>10.7</td>
			<td>9.02</td>
			<td>2.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ4</td>
			<td>5.11</td>
			<td>2.99</td>
			<td>35,35</td>
			<td>325,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ5</td>
			<td>2.01</td>
			<td>19.6</td>
			<td>93,29</td>
			<td>2.49</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ6</td>
			<td>64,7</td>
			<td>3.03</td>
			<td>4.97</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ7</td>
			<td>0,9</td>
			<td>0,63</td>
			<td>233.1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ8</td>
			<td>302</td>
			<td>0,83</td>
			<td>691</td>
			<td>10,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ10</td>
			<td>2.54</td>
			<td>0,71</td>
			<td>43,2</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ14</td>
			<td>3224</td>
			<td>2.1</td>
			<td>14,52</td>
			<td>0,9</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ16</td>
			<td>1.83</td>
			<td>32.99</td>
			<td>59,18</td>
			<td>28,65</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ17</td>
			<td>2.21</td>
			<td>0,77</td>
			<td>890,9</td>
			<td>23,86</td>
		</tr>
<tr>
<td>IFNΑ21</td>
			<td>2.78</td>
			<td>12.87</td>
			<td>1769</td>
			<td>5.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : sélection d’anticorps Pan-alpha. IC50 (ng/mL) déterminée à l’aide de l’élément de réponse stimulée par l’interféron (sier)-analyse de Luciferase neutralisation. Tableau des valeurs d’IC50 du mAbs utilisé dans essai de tableau de molécule unique pour tous les sous-types de l’IFN-α. 10 000 cellules HEK 293 MSR ont été ensemencées en plaques à 96 puits moitié-zone blanches et inverse-transfectées avec 50 ng prémélangée sier-Firefly luciferase reporter et constructions de luciférase Renilla utilisant des réactifs de transfection selon les instructions du fabricant. La construction de la luciférase exprimant a servi un contrôle interne normalisation. Cellules ont été incubées pendant la nuit dans un milieu sérum réduit additionné de 0,1 mM des acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium 1 mM, sérum de veau fœtal de 0,5 % à 37 ° C, 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée. Après une nuit d’incubation, les cellules sont stimulées pendant 24 h avec un milieu contenant des mélanges de humaine recombinante IFN-α avec ou sans anti-IFN-α mAbs ou contrôle IgG qui avait été préincubé pendant 1 h à 37 ° C. Après 24 h de stimulation, dual luciferase reporter analyses ont été effectuées selon les instructions du fabricant. «- » Non déterminé. Sifalimumab est un entièrement humain, immunoglobuline G1 κ anticorps monoclonal qui se lie à et neutralise la plupart des sous-types de l’IFN-α ; Rontalizumab est un anticorps monoclonal humanisé contre IFN-α. Adapté de Meyer et coll. 2016 et Rodero et al. 2017.
Supplémentaire tableau 1 : sélection de l’orientation de l’anticorps, capturer la concentration d’anticorps sur les perles et ratio biotinylation. Les deux configurations différentes possibles ont été testées, en utilisant l’anti-IFN-α A comme anticorps de capture et anti-IFN-α B comme détection anticorps (A) et vice versa (B). IFNα - 2C a été utilisé comme antigène. Concentrations d’anticorps de capture différents ainsi que les ratios de biotine : anticorps (B:A) ont aussi été testés pour les deux configurations. Saturation (Sat). Orange : Valeurs d’AEB qui ont été utilisés pour le calcul de LOD ; ces concentrations étaient considérées comme vierges comme valeurs AEB est demeurés stables. LOD est calculé comme le signifie vide + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_1.xlsx">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaires Tableau 2 : Test de configuration 3-étape 2 vs. Les configurations d’étape 2 et 3 - ont été évaluées à IFNα - 2C comme antigène. AEB valeurs aussi bien comme signal/fond des rations (S/B) sont indiquées pour les deux conditions. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_2.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaires Tableau 3 : optimisation de concentration détecteur et SBG. Trois concentrations différentes de biotinylé de détecteur (0,1, 0,3 et 0,6 µg/mL) avec trois concentrations différentes de SBG (50, 150 et 250 pM) ont été évaluées. AEB valeurs sont indiquées pour les neuf conditions testées. Orange : Valeurs d’AEB qui ont été utilisés pour le calcul de LOD ; ces concentrations étaient considérées comme vierges comme valeurs AEB est demeurés stables. LOD est calculé comme le signifie vide + 3SD. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_3.xlsx">s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaires Tableau 4 : spécificité et la sensibilité du dosage optimisé IFNα seule molécule tableau. Enzyme moyenne par valeurs de perles sont indiqués lorsque les IFN-β, IFN-λ1, λ2-IFN, IFN-ω et IFN-γ protéines recombinantes ont été testés (A), ainsi que les 16 sous-types d’IFN-α (B). «- » Non déterminé. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_4.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Complémentaires tableau 5 : reproductibilité du dosage optimisé IFNα seule molécule tableau. Les valeurs moyennes de la DGVE pour tous trois essais indépendants figurent vers le haut à une concentration de 10.000 µg/mL. «- » Non déterminé. Saturation (Sat). <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_5.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Supplémentaires Tableau 6 : test de concurrence protéine. Enzyme moyen par les perles, les valeurs sont indiquées pour toutes les conditions testées. Des mesures ont été effectuées en double. <a href="/files/ftp_upload/57421/Supplementary_Table_6.xlsx">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous présentons ici un protocole visant à décrire le développement et la validation d’une seule molécule tableau numérique analyse d’ELISA, qui permet la détection ultrasensible de tous les sous-types d’IFN-α dans des échantillons humains.

Développement et Validation d’une seule molécule ultrasensible de tableau numérique Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human interféron-α

The main aim of this protocol is to describe the development and validation of an interferon (IFN)-&#945; single molecule array digital Enzyme-Linked ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la nature, la régulation et l’impact biologique des réponses induites par l’interféron dans différents contextes pathologiques, y compris l’auto-immunité et l’infection. Le principal avantage de cette technique est sa propre sensibilité présidentielle. Cette technique a un grand potentiel pour la découverte de biomarqueurs afin d’améliorer la prise en charge des patients dans de nombreuses maladies, car elle permet de quantifier les cytokines avec une sensibilité sans précédent.Une étape majeure de cette approche a été de neutraliser les activités liées aux patients atteints du système polyindocrine auto-immun de type 1. Pour commencer, chargez 280 millions de billes paramagnétiques dans un tube de microfuge, en prenant note du volume. Ensuite, faites tourner les billes par impulsions et placez le tube sur un séparateur magnétique pendant une minute.Retirez et jetez la solution diluante isolant ainsi les billes. Ensuite, lavez les perles avec BWB deux fois et BCB deux fois. Pour chaque lavage, ajoutez 200 microlitres et agitez le tube pendant cinq secondes.Séparez ensuite les billes de la solution à l’aide du séparateur magnétique. Après une minute de séparation, jetez le diluant. Ensuite, ajoutez 190 microlitres de BCB par volume de bille.Ensuite, faites un bref vortex dans le tube, faites tourner le tube par impulsions et placez les perles lavées sur de la glace. Pour activer les billes, combinez un millilitre de BCB froid avec 10 milligrammes d’EDC, et faites un tourbillon jusqu’à ce que la solution soit homogène. Travaillez rapidement et en toute sécurité lors de l’utilisation d’EDC, en raison de son instabilité inhérente et de sa solution équine.Ajoutez ensuite 10 microlitres d’EDC dilué à froid par volume de bille dans la suspension de billes et agitez brièvement les billes. Ensuite, mettez les perles sur un shaker à température ambiante pendant 30 minutes. Pour conjuguer les anticorps contre les billes, il faut d’abord faire tourner les billes activées par vortex et pulsation.Ensuite, placez les billes dans un séparateur magnétique pendant une minute et jetez le surnageant BCB. Ensuite, retirez le tube de l’aimant et lavez les billes deux fois avec 200 microlitres de BCB. Ensuite, le vortex, le spin d’impulsion et la séparation magnétique des billes pour retirer le tampon.Ensuite, ajoutez rapidement 200 microlitres d’anticorps froids échangés par tampon aux billes activées. Après avoir mis les billes en solution au tourbillon, placez la suspension sur l’agitateur à température ambiante pendant deux heures à 1 000 tr/min. Commencez par donner à la suspension de billes recouvertes d’anticorps un spin pulsé, puis utilisez la colonne magnétique pour retirer le tampon.Ensuite, vérifiez la concentration de la protéine dans le tampon. Utilisez un spectraphotomètre à faible volume. À ce stade, les anticorps sont couplés aux billes et toute valeur supérieure à zéro signifie que les billes sont saturées d’anticorps.Maintenant, lavez les perles avec 200 microlitres de BWB, comme effectué lors de tous les lavages précédents. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube et vérifiez la concentration en protéines. La quantification des protéines libérées par les billes permet de mesurer le couplage des anticorps.Ensuite, lavez à nouveau les billes avec 200 microlitres de BWB. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon bloqueur de billes, agitez le tube pendant cinq secondes et transférez-le dans l’agitateur à température ambiante pendant 30 minutes. Au bout de 30 minutes, les billes seront bloquées.Ensuite, lavez-les une fois avec 200 microlitres de BWB, puis lavez-les deux fois avec 200 microlitres de tampon de diluant pour billes pour chaque lavage. Ensuite, stockez les billes enrobées et bloquées dans 200 microlitres de tampon de diluant pour billes à quatre degrés Celsius. Cette section de la vidéo suggère des stratégies pour ajuster les conditions de dosage à l’aide du logiciel d’analyse de matrice de molécules uniques dans la configuration de brassage maison.Commencez par tester différentes combinaisons d’anticorps de capture, de billes conjuguées et d’anticorps de détection de biotinylation dans les deux combinaisons d’anticorps. Ensuite, testez des combinaisons des trois concentrations différentes d’anticorps de capture avec deux rapports de biotinylation différents pour la détection et les anticorps de capture et vice versa. Choisissez ensuite la combinaison qui offre le niveau de détection le plus bas et utilisez-la pour les étapes suivantes.Dans ce cas, un rapport de 30 pour un de biotine à anticorps donne la meilleure limite de détection. Ensuite, comparez une configuration en deux étapes avec une configuration en trois étapes. Les configurations en trois étapes comportent trois étapes d’incubation différentes.L’un avec l’anticorps de capture, l’autre avec l’anticorps de détection, et un dernier, le troisième pour le marquage de l’enzyme SBG. Les configurations en deux étapes combinent les incubations de capture et de détection. Exécutez l’analyseur à matrice de molécules uniques en utilisant les concentrations et les ratios d’anticorps de capture et de détection sélectionnés dans les configurations en deux et trois étapes, préconfigurées dans l’analyseur, en suivant les instructions du fabricant.Choisissez ensuite la configuration qui permet la sensibilité la plus élevée et conservez-la pour les étapes suivantes. Dans ce cas, la configuration en deux étapes donne une sensibilité légèrement plus élevée à chaque point de test. Ensuite, optimisez les concentrations de l’anticorps du détecteur et du SBG.Testez trois concentrations différentes d’anticorps de détecteur avec trois concentrations différentes de SBG. Choisissez les concentrations qui donnent la sensibilité la plus élevée et conservez-les pour les étapes futures. Dans ce cas, 0,3 microgramme par millilitre d’anticorps et 150 pica molaire SBG ont le niveau de détection optimal avec de faibles niveaux de fond avec une amplitude moyenne fortuite.Pour des étapes d’optimisation supplémentaires, consultez le protocole texte. On y trouve des procédures d’optimisation de la spécificité et de la reproductibilité des essais, ainsi qu’un essai de compétition protéique. À l’aide d’un test optimisé pour détecter 13 sous-classes d’interféron alpha, le plasma et le sérum ont été analysés chez des patients atteints de LED, des patients atteints de JDM et des témoins sains.Des niveaux élevés de protéine interféron-alpha ont été détectés dans les deux cohortes de maladies. La ligne pointillée indique le niveau de détection d’une Eliza conventionnelle, disponible dans le commerce, qui ne détecterait pas la protéine interféron-alpha dans ces groupes de patients, malgré le rôle connu de cette cytokine dans ces maladies. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer et de valider un test de réseau à molécule unique pour l’analyse de votre choix.Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que lors du choix cellulaire des anticorps est. Depuis son développement, ce test a permis de mieux caractériser le rôle de l’interféron-alpha dans une diversité de maladies et d’infections auto-immunes. Ce test a également permis de suivre les réponses aux nouvelles thérapies et d’identifier les acteurs cellulaires responsables de certaines maladies auto-immunes.

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Immunologie et infection

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