Développement et Validation d’une seule molécule ultrasensible de tableau numérique Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human interféron-α

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la nature, la régulation et l’impact biologique des réponses induites par l’interféron dans différents contextes pathologiques, y compris l’auto-immunité et l’infection. Le principal avantage de cette technique est sa propre sensibilité présidentielle. Cette technique a un grand potentiel pour la découverte de biomarqueurs afin d’améliorer la prise en charge des patients dans de nombreuses maladies, car elle permet de quantifier les cytokines avec une sensibilité sans précédent.

Une étape majeure de cette approche a été de neutraliser les activités liées aux patients atteints du système polyindocrine auto-immun de type 1. Pour commencer, chargez 280 millions de billes paramagnétiques dans un tube de microfuge, en prenant note du volume. Ensuite, faites tourner les billes par impulsions et placez le tube sur un séparateur magnétique pendant une minute.

Retirez et jetez la solution diluante isolant ainsi les billes. Ensuite, lavez les perles avec BWB deux fois et BCB deux fois. Pour chaque lavage, ajoutez 200 microlitres et agitez le tube pendant cinq secondes.

Séparez ensuite les billes de la solution à l’aide du séparateur magnétique. Après une minute de séparation, jetez le diluant. Ensuite, ajoutez 190 microlitres de BCB par volume de bille.

Ensuite, faites un bref vortex dans le tube, faites tourner le tube par impulsions et placez les perles lavées sur de la glace. Pour activer les billes, combinez un millilitre de BCB froid avec 10 milligrammes d’EDC, et faites un tourbillon jusqu’à ce que la solution soit homogène. Travaillez rapidement et en toute sécurité lors de l’utilisation d’EDC, en raison de son instabilité inhérente et de sa solution équine.

Ajoutez ensuite 10 microlitres d’EDC dilué à froid par volume de bille dans la suspension de billes et agitez brièvement les billes. Ensuite, mettez les perles sur un shaker à température ambiante pendant 30 minutes. Pour conjuguer les anticorps contre les billes, il faut d’abord faire tourner les billes activées par vortex et pulsation.

Ensuite, placez les billes dans un séparateur magnétique pendant une minute et jetez le surnageant BCB. Ensuite, retirez le tube de l’aimant et lavez les billes deux fois avec 200 microlitres de BCB. Ensuite, le vortex, le spin d’impulsion et la séparation magnétique des billes pour retirer le tampon.

Ensuite, ajoutez rapidement 200 microlitres d’anticorps froids échangés par tampon aux billes activées. Après avoir mis les billes en solution au tourbillon, placez la suspension sur l’agitateur à température ambiante pendant deux heures à 1 000 tr/min. Commencez par donner à la suspension de billes recouvertes d’anticorps un spin pulsé, puis utilisez la colonne magnétique pour retirer le tampon.

Ensuite, vérifiez la concentration de la protéine dans le tampon. Utilisez un spectraphotomètre à faible volume. À ce stade, les anticorps sont couplés aux billes et toute valeur supérieure à zéro signifie que les billes sont saturées d’anticorps.

Maintenant, lavez les perles avec 200 microlitres de BWB, comme effectué lors de tous les lavages précédents. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube et vérifiez la concentration en protéines. La quantification des protéines libérées par les billes permet de mesurer le couplage des anticorps.

Ensuite, lavez à nouveau les billes avec 200 microlitres de BWB. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon bloqueur de billes, agitez le tube pendant cinq secondes et transférez-le dans l’agitateur à température ambiante pendant 30 minutes. Au bout de 30 minutes, les billes seront bloquées.

Ensuite, lavez-les une fois avec 200 microlitres de BWB, puis lavez-les deux fois avec 200 microlitres de tampon de diluant pour billes pour chaque lavage. Ensuite, stockez les billes enrobées et bloquées dans 200 microlitres de tampon de diluant pour billes à quatre degrés Celsius. Cette section de la vidéo suggère des stratégies pour ajuster les conditions de dosage à l’aide du logiciel d’analyse de matrice de molécules uniques dans la configuration de brassage maison.

Commencez par tester différentes combinaisons d’anticorps de capture, de billes conjuguées et d’anticorps de détection de biotinylation dans les deux combinaisons d’anticorps. Ensuite, testez des combinaisons des trois concentrations différentes d’anticorps de capture avec deux rapports de biotinylation différents pour la détection et les anticorps de capture et vice versa. Choisissez ensuite la combinaison qui offre le niveau de détection le plus bas et utilisez-la pour les étapes suivantes.

Dans ce cas, un rapport de 30 pour un de biotine à anticorps donne la meilleure limite de détection. Ensuite, comparez une configuration en deux étapes avec une configuration en trois étapes. Les configurations en trois étapes comportent trois étapes d’incubation différentes.

L’un avec l’anticorps de capture, l’autre avec l’anticorps de détection, et un dernier, le troisième pour le marquage de l’enzyme SBG. Les configurations en deux étapes combinent les incubations de capture et de détection. Exécutez l’analyseur à matrice de molécules uniques en utilisant les concentrations et les ratios d’anticorps de capture et de détection sélectionnés dans les configurations en deux et trois étapes, préconfigurées dans l’analyseur, en suivant les instructions du fabricant.

Choisissez ensuite la configuration qui permet la sensibilité la plus élevée et conservez-la pour les étapes suivantes. Dans ce cas, la configuration en deux étapes donne une sensibilité légèrement plus élevée à chaque point de test. Ensuite, optimisez les concentrations de l’anticorps du détecteur et du SBG.

Testez trois concentrations différentes d’anticorps de détecteur avec trois concentrations différentes de SBG. Choisissez les concentrations qui donnent la sensibilité la plus élevée et conservez-les pour les étapes futures. Dans ce cas, 0,3 microgramme par millilitre d’anticorps et 150 pica molaire SBG ont le niveau de détection optimal avec de faibles niveaux de fond avec une amplitude moyenne fortuite.

Pour des étapes d’optimisation supplémentaires, consultez le protocole texte. On y trouve des procédures d’optimisation de la spécificité et de la reproductibilité des essais, ainsi qu’un essai de compétition protéique. À l’aide d’un test optimisé pour détecter 13 sous-classes d’interféron alpha, le plasma et le sérum ont été analysés chez des patients atteints de LED, des patients atteints de JDM et des témoins sains.

Des niveaux élevés de protéine interféron-alpha ont été détectés dans les deux cohortes de maladies. La ligne pointillée indique le niveau de détection d’une Eliza conventionnelle, disponible dans le commerce, qui ne détecterait pas la protéine interféron-alpha dans ces groupes de patients, malgré le rôle connu de cette cytokine dans ces maladies. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer et de valider un test de réseau à molécule unique pour l’analyse de votre choix.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que lors du choix cellulaire des anticorps est. Depuis son développement, ce test a permis de mieux caractériser le rôle de l’interféron-alpha dans une diversité de maladies et d’infections auto-immunes. Ce test a également permis de suivre les réponses aux nouvelles thérapies et d’identifier les acteurs cellulaires responsables de certaines maladies auto-immunes.