Stomates Tape-Peel : Une méthode améliorée pour la préparation d’échantillons de cellules de garde

L’objectif global de cette expérience est de préparer des cellules de garde de stomates enrichies de haute qualité pour des analyses physiologiques, biochimiques et moléculaires, telles que la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique. Bonjour, je m’appelle Sheldon Lawrence. Je suis un étudiant diplômé dans le laboratoire du Dr Chen au Département de biologie de l’Université de Floride.

Aujourd’hui, je vais vous montrer comment isoler des cellules de garde à partir de tissus foliaires végétaux qui sont du matériel utile pour étudier à la fois la physiologie et la biologie des stomates. Cette méthode est considérée comme une nouvelle méthode pour isoler les cellules de garde. Il permet spécifiquement l’enrichissement de cellules de garde intactes et fournit des échantillons fiables pour l’étude des processus de signalisation des cellules de stomates.

L’application de cette méthode peut s’étendre aux plantes Brassicaceae et à d’autres espèces végétales avec seulement de légères modifications au protocole. La démonstration est importante car l’étape principale d’enrichissement des cellules de garde peut s’avérer difficile. Pour commencer, sélectionnez des plants d’Arabidopsis matures âgés de cinq semaines.

Retirez soigneusement une feuille avec un scalpel, en coupant la feuille à la base. Prenez deux morceaux de scotch et placez la feuille excisée entre eux. Appliquez doucement une pression des deux côtés tout en vous assurant que l’extrémité des morceaux de ruban n’adhère pas.

Cela peut être fait en insérant un doigt entre eux. Retirez délicatement les deux morceaux de ruban adhésif l’un de l’autre et faites flotter immédiatement la peau prélevée sur le côté abaxial de la feuille dans le tampon d’ouverture des stomates. Une fois que toutes les pelures ont été recueillies, placez-les sous la lumière.

Laissez-les là pendant deux heures. Prenez plusieurs peelings et placez-les sur des lames de microscope. À l’aide d’un microscope optique, ajustez les lentilles pour voir les cellules de garde et assurez-vous qu’elles sont ouvertes.

Placez les peelings dans 50 ml de solution d’enzymes de digestion de la paroi cellulaire. Flottez-les et incubez-les à 26 degrés Celsius. Après 20 minutes, retirez les pelures de la solution enzymatique et rincez-les deux brièvement à l’eau déminéralisée, puis placez-les dans un tampon d’ouverture de stomates frais.

Broyez les pelures dans un mortier avec de l’azote liquide, avec un pilon. Effectuez ensuite l’extraction du phénol comme décrit dans le texte. Après avoir broyé les pelures dans un mortier avec un pilon, transférez l’extrait, ainsi que les pelures dans un tube à centrifuger Oak Ridge, et agitez sur un shaker pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Faites précipiter les protéines extraites au phénol en ajoutant cinq volumes d’acétate d’ammonium froid à 0,1 mol dans du méthanol à 100 %. Après avoir précipité la protéine pendant la nuit à 20 degrés Celsius, récoltez la protéine par centrifugation et effectuez des lavages de granulés comme décrit dans le texte. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre d’acétone froide et transférez-la dans un microtube à centrifuger de deux millilitres.

Après la centrifugation, jetez le surnageant d’acétone et séchez la pastille pendant dix minutes. Dissoudre l’échantillon de protéines dans un tampon de dissolution. Après le vortex et la centrifugation, prélever le surnageant et mesurer la concentration en protéines.

Exécutez un gel SDS-PAGE. Visualisez les bandes protéiques séparées et observez la qualité relative des protéines. Il s’agit d’une image représentative des cellules de garde d’Arabidopsis avant et après la digestion enzymatique des cellules du mésophylle et de l’épiderme.

La viabilité des cellules de garde avant et après l’élimination des cellules du mésophylle et de l’épiderme peut être observée à l’aide du diacétate de fluorescéine, qui mesure l’activité enzymatique et l’intégrité de la membrane cellulaire. Comme vous pouvez le voir, les cellules de garde sont toujours viables après le peeling et la digestion enzymatique. Cet exemple illustre le mouvement des stomates d’Arabidopsis en réponse au traitement par ABA.

Les cellules de garde réagissent au traitement et l’ouverture des stomates diminue de plus de 50 % après 30 minutes de traitement par ABA. Voici un cours temporel du mouvement des stomates. De plus, une image représentative de l’ouverture des stomates à chaque point temporel est présentée.

La détection, la séparation et l’abondance relative des protéines sont observées par SDS-PAGE. Les bandes sont claires et distinctes. Quatre répétitions biologiques sont incluses pour souligner la reproductibilité de l’extraction des protéines à partir de cette méthode.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons essayé de corréler les changements moléculaires des cellules de garde en temps réel avec le mouvement des stomates. Une fois maîtrisé, un échantillon de protéines provenant de cellules de garde de stomates peut être préparé en quelques heures et peut être utilisé dans de multiples expériences. Il est important de se rappeler de ne pas infliger de gros dommages aux cellules de garde lors du pelage et de la manipulation.

En suivant cette méthode, d’autres techniques peuvent être appliquées pour étudier la signalisation des cellules de garde, telles que le marquage isobare pour étudier la réponse redux des protéines chez les plantes dans des conditions normales et de stress. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’enrichir des cellules de garde intactes et viables, ainsi que d’extraire des protéines de haute qualité appropriées pour les études en aval.