Name: Stomates Tape-Peel : Une méthode améliorée pour la préparation d’échantillons de cellules de garde (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Découvrez une méthode améliorée pour isoler des cellules de garde intactes à partir de feuilles de plantes. Cette technique permet des analyses physiologiques, biochimiques et moléculaires fiables pour étudier la signalisation stomatique.

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Nous remercions Daniel Chen du numérique vidéo Production équipe de Buchholz High School pour l’assistance au montage de la vidéo. Cette recherche sur les cellules de garde des stomates, protéomique et métabolomique dans le laboratoire de Chen a été soutenue par des subventions de la US National Science Foundation (0818051, 1158000 et 1412547). Wenwen Kong est pris en charge par le China Scholarship Council. M. Qiuying Pang est pris en charge par le China Scholarship Council et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31570396).

1. la culture de plantes
<ol><li>Faire germer les graines dans le mélange de rempotage. Faire pousser des plantes dans une chambre de croissance avec une intensité lumineuse de 140 µmol photons m−2 s −1 et une photopériode de 8 h à 22 ° C et 16 h de lumière sombre à 18 ° C pendant 2 semaines.</li>
	<li>Repiquez les plantules de tailles similaires individuellement dans 4" diamètre pots contenant du sol et de grandir pour 3 semaines dans les mêmes conditions supplémentaires décrits à l’étape 1.1. NOTE : Arroser les plantes avec l’eau du robinet deux fois par semaine pour garder le sol humide.</li>
</ol>2. préparation des stomates enrichis
<ol><li>Enlever les feuilles des plantes d’a. thaliana 5 - semaine vieux individuels avec un scalpel.</li>
	<li>Fixez chaque feuille à deux morceaux de ruban adhésif Scotch transparent, avec une seule pièce adhérant aux stomates (dessous) et l’autre pièce adhérant à adaxiale côté (supérieur) de la feuille. Laisser le ruban sur la feuille pendant 5 s.</li>
	<li>Gentle peel apart les deux morceaux de bandes à l’aide de l’index et le pouce de chaque main pour séparer le côté abaxial avec plancher et cellules stomatiques et du côté adaxial avec les cellules du mésophylle.</li>
	<li>Place les pelures de la face abaxiale des feuilles dans 60 mL de stomates ouverture tampon (50 mM de KCl, 10 mM MES-KOH, ajusté à pH 6.2 avec 1 M KOH) en taille 40 mm × 12 mm Petri plats car ils sont prélevés.<ol>
<li>Répétez les étapes ci-dessus jusqu'à ce que toutes les pelures d’échantillon sont prélevés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer les boîtes de Pétri contenant les épluchures dans la chambre de croissance dans des conditions légères, a indiqué à l’étape 1.1. Laisser les pelures sous la lumière pendant 2 h à pleine ouverture des stomates.</li>
	<li>Place les peelings en boîte de Pétri contenant 50 mL de paroi cellulaire digestion mélange d’enzymes (cellulase 0,7 % R-10, 0.025 % macerozyme R-10, 0,1 % (p/v) polyvinylpyrrolidone-40 et albumine sérique bovine de 0,25 % (p/v) en solution de base de 55 % (0,55 M sorbitol, 0,5 mM 20 mm x 150 mm CaCl2, 0,5 mM MgCl2, l’acide ascorbique 0,5 mM, 10 µM KH2PO4, 5 mM 4-morpholineethanesulfonic acid (MES) à pH 5,7 ajusté avec 1 M KOH).</li>
	<li>Agiter les pelures sur un agitateur réciproque dans un plat de Pétri à 50 tr/min pendant 20 min.</li>
	<li>Supprimer les pelures de solution enzymatique avec des pincettes après 20 min. déposer les pelures dans un Pétri de la taille de 150 x 20 mm contenant 50 mL d’eau.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de transfert, rincer les peelings pour 15 s deux fois avec 10 mL d’eau afin d’éliminer toute solution enzymatique résiduelle.</li>
	<li>Pince à épiler permet de placer des pelures dans un plat de Pétri de taille 150 x 20 mm avec 50 mL de stomates frais ouverture du tampon tel qu’utilisé à l’étape 2.4. Incuber pendant 1 heure dans des conditions légères a indiqué à l’étape 1.1 afin de permettre les stomates à récupérer.</li>
</ol>3. l’acide abscissique (ABA) traitement et analyse de mouvement de stomates
<ol><li>Dans un plat de Pétri de dimensions 150 x 20 mm. Incuber les pelures de stomates enrichi à 30° C pendant 15 min dans 50 mL de tampon ouverture stomatique ou dans 50 mL de tampon ouverture stomatique avec une concentration finale de 10 µM ABA pour le temps de traitement approprié.</li>
	<li>Placez les peelings sur un agitateur à 50 tr/min pendant 5, 15 et 30 min. Après chaque intervalle de temps enlever une peau avec des pincettes et suivez les étapes d’imagerie à l’étape 3.3.</li>
	<li>Prendre des photos des stomates avant traitement à l’ABA et aux divers points de temps après le traitement ABA avec un microscope optique.<ol>
<li>Prendre une pelle et le placer sur une lame de microscope de verre.</li>
		<li>Placer la lame sur la platine du microscope et ajuster la scène afin que l’image de la peau peut être visualisée.</li>
		<li>Régler l’amende et du cours mettant l’accent sur la loupe pour obtenir une image claire des cellules stomatiques.</li>
		<li>Prendre plusieurs images de stomates multiples à un grossissement de 40 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesurer 60 ouvertures stomatiques avec ImageJ8.</li>
	<li>Calculer l’écart-type et l’importance à une valeur p < 0,05 des 60 mesures d’ouverture des stomates.</li>
</ol>4. protein Extraction et séparation de SDS-Page
<ol><li>Moudre les pelures pour 15 s dans l’azote assez liquide pour couvrir les peelings à l’aide d’un réfrigéré de mortier et un pilon.</li>
	<li>Par 50 peelings, ajouter 3 mL de phénol Tris saturée (pH 8,8) et 3 mL de tampon d’extraction protéique (0,9 M de sucrose, 0,1 M Tris-HCl, 0,01 M EDTA, 0,4 % 2-mercaptoéthanol, 10 µL d’inhibiteur de protéase et phosphatase 1 mM) avec une pipette pour le mortier et puis moudre les pelures pour addi 5 tional minutes sous une hotte.</li>
	<li>L’extrait à l’aide d’une pipette de transfert et les peelings à l’aide de pinces métalliques pour un Oakridge Centrifuger le tube et agitent dans un agitateur à 50 tr/min pendant 1 h à 4 ° C.</li>
	<li>Retirer les pelures du tube à centrifuger Oakridge et centrifuger l’extrait à 5 000 x g pendant 10 min. Ensuite, transférer la phase phénolique haut de la page dans un nouveau tube propre micro-centrifuge à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Précipité le phénol extraites des protéines en ajoutant 5 volumes de glacé d’acétate d’ammonium 0.1 M à 100 % de méthanol. Vortex brièvement et incuber une nuit à-20 ° C.</li>
	<li>Centrifuger à 20 000 x g à 4 ° C pendant 20 min, éliminer le surnageant en le versant lentement hors du tube et de retenir le culot de protéine dans le tube.</li>
	<li>Laver le culot de protéines deux fois avec l’acétate d’ammonium 0.1 M dans le méthanol, puis deux fois avec 80 % d’acétone et une fois avec de l’acétone froid 100 %. NOTE : Lavages s’effectuent en ajoutant 10 mL de réactif spécifié au tube de protéine. Agiter dans un agitateur à 50 tr/min pendant 5 min, suivi d’une centrifugation à 15 000 x g à 4 ° C pendant 10 min. Verser ensuite le réactif du tube conservant seulement le culot de protéine.</li>
	<li>Ajouter 1 mL d’acétone froid 100 % au culot et remettre en suspension en pipettant également lentement, monter et descendre.</li>
	<li>Suspension de protéine de transfert via la pipette à un tube à centrifuger-micro 2 mL puis centrifuger à 20 000 x g à 4 ° C pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer l’acétone par la décantation du tube puis sécher le culot dans la hotte pendant 10 min.</li>
	<li>Dissoudre la protéine dans un tube à centrifuger-micro avec 200 µL de tampon de dissolution (urée 8 M, 0,5 % SDS, 30 mM Tris-HCl pH 8,5) et vortexer pendant 30 min. Centrifuger à 20 000 x g à 15 ° C pendant 20 min et le surnageant dans un nouveau tube à frais virés.</li>
	<li>Quantifier le taux protéique, suivant le protocole de quantification du protéine9.</li>
	<li>Utiliser des échantillons de protéine pour la séparation des protéines par électrophorèse sur gel, suivant le protocole n°10.</li>
</ol>

<ol><li>Acharya, B., Assmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone+interactions+in+stomatal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormone interactions in stomatal function.</a> Plant Molecular Biology. 69 (4), 451-462 (2009).</li>
<li>Schroeder, J. I., Allen, G. J., Hugouvieux, V., Kwak, J. M., Waner, D. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.arplant.52.1.627">Guard cell signal transduction.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52, 627-658 (2001).</li>
<li>Obulareddy, N., Panchal, S., Melotto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guard+Cell+Purification+and+RNA+Isolation+Suitable+for+High-Throughput+Transcriptional+Analysis+of+Cell-Type+Responses+to+Biotic+Stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Guard Cell Purification and RNA Isolation Suitable for High-Throughput Transcriptional Analysis of Cell-Type Responses to Biotic Stresses.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 26 (8), 844-849 (2013).</li>
<li>Pandey, S., Wang, X. Q., Coursol, S. A., Assmann, S. M. <a target="_blank" href="https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.0028-646X.2001.00329.x">Preparation and applications of Arabidopsis thaliana guard cell protoplasts.</a> New Phytologist. 153 (3), 517-526 (2002).</li>
<li>Schroeder, J. I., Raschke, K., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Dependence+Of+K%2B+Channels+In+Guard-Cell+Protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage Dependence Of K+ Channels In Guard-Cell Protoplasts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (12), 4108-4112 (1987).</li>
<li>Wu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich+-+a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant Methods. 5, 10(2009).</li>
<li>Svozil, J., Gruissem, W., Baerenfaller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+targeting+of+proteins+in+Arabidopsis+leaf+mesophyll%2C+epidermal+and+vascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Proteasome targeting of proteins in Arabidopsis leaf mesophyll, epidermal and vascular tissues.</a> Frontiers in Plant Science. 6, (2015).</li>
<li>Schneider, C., Rasband, W., Eliceiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Agnew, B., Murray, D., Patton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+solid-phase+fluorescence-based+protein+assay+for+quantitation+of+protein+electrophoresis+samples+containing+detergents%2C+chaotropes%2C+dyes%2C+and+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A rapid solid-phase fluorescence-based protein assay for quantitation of protein electrophoresis samples containing detergents, chaotropes, dyes, and reducing agents.</a> Electrophoresis. 25 (15), 2478-2485 (2004).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e80">Laemmli-SDS-PAGE.</a> Bio-protocol. Bio101 (80), (2011).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac0262560">Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS (vol 75, pg 1895).</a> Analytical Chemistry. 78 (12), 4235-4235 (2006).</li>
<li>Wiese, S., Reidegeld, K. A., Meyer, H. E., Warscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+labeling+by+iTRAQ%3A+A+new+tool+for+quantitative+mass+spectrometry+in+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein labeling by iTRAQ: A new tool for quantitative mass spectrometry in proteome research.</a> Proteomics. 7 (3), 340-350 (2007).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Les cellules de garde sont un système modèle pour l’étude des mécanismes de transduction de signal dans les plantes et il est important de veiller à ce que la préparation des échantillons utilisés dans l’étude est la plus appropriée pour répondre à des questions biologiques. Malgré l’intérêt croissant pour les cellules de garde au sein de la communauté de recherche plante, il n’y a aucune méthode universelle sur comment préparer les cellules stomatiques stomatiques qui permettrait à la fois le mouvement stomatique et phy...

Stomates jouent un rôle important dans la physiologie et la remise en forme de plantes ensemble. Ces structures spécifiques de plantes minuscules sont formés par deux cellules épidermiques spécialisées appelées cellules stomatiques et sont trouvent plus abondamment sur la face abaxiale des feuilles. Stomates sont nécessaires pour l’échange de gaz entre la plante et l’atmosphère, ainsi que le contrôle des pertes d’eau par transpiration. Réglementer les cellules stomatiques ouverture des stomates grâce à l’intégration de différent externe (par exemple, lumière, humidité, contact de l’agent pathogène, des niveaux de dioxyde de carbone) et internes (p. ex.., hormones endogènes) stimuli1,2. Au cours des 20 dernières années, ce type de cellule est devenu un système modèle pour étudier cellule signalisation processus chez les plantes. Ces cellules forment une petite fraction des cellules totales dans une feuille ; ainsi, afin d’étudier leur cellulaire unique, les propriétés biochimiques et moléculaires d’une manière unicellulaires, il faut les isoler des autres types de cellules de feuille. Dans le passé, études des cellules de garde ont souvent impliqué la préparation des cellules de garde des protoplastes (GCP)3,4,5. Typiquement, cela nécessite l’utilisation de grandes quantités d’enzymes dégradant la paroi cellulaire et ou rupture mécanique par mélange et a prouvé d’être coûteux et fastidieux car il faut généralement plusieurs heures pour préparer un échantillon GCP, souvent de fois avec peu de rendement. Plus important encore, parce que les cellules de garde agissent comme des paires complètes pour réguler l’ouverture des stomates, l’utilisation des BPC peut considérer comme un système artificiel à l’étude de la signalisation des cellules de garde.
Ici, nous avons développé une méthode pour préparer des stomates dans lequel les cellules de garde intactes sont enrichis et maintenir les réactions physiologiques aux stimuli. Cette méthode s’inspire d’une méthode qui a permis d’isoler du mésophylle cellule protoplastes6,7. Dans notre méthode, les stomates sont préparés selon claire ruban Scotch pour séparer tout d’abord la majorité des cellules du mésophylle jointe à la couche adaxiale de la feuille de la couche abaxiale contenant les chaussées et les cellules stomatiques. Cela se fait par l’apposition d’un morceau de ruban de chaque côté de la feuille et les peeling appart. Les cellules de la couche abaxiale sont autorisés à récupérer sous la lumière dans un tampon de l’ouverture des stomates. Plus tard, les cellules restantes de la chaussée sont supprimés à l’aide d’une petite quantité d’enzymes, laissant derrière elle des cellules de garde qui s’enrichissent sur la bande de dégradant les parois cellulaires.
Dans cette méthode simple, stomatiques cellules stomatiques qui soient viables et adaptés peuvent rapidement et efficacement être prêt, en moins d’une heure pour obtenir des cellules de garde des stomates enrichis de 50 peelings avec un coût minime. La méthode ici impose moins de dommages aux cellules végétales que les méthodes précédentes où sont préparés les protoplastes. En outre, les matières recueillies de cette méthode rendement protéines souhaitable s’élève. Surtout, parce que la feuille n’est pas soumise à la fusion ou temps de digestion longue et cellules stomatiques sont intacts, les résultats d’études sera plus étroitement des celui de la garde physique biologie d’une cellule. Avec cette méthode, stomatiques mouvements peuvent être reliées en temps réel à des changements au niveau moléculaire. Ainsi, les connaissances acquises grâce à des études à l’aide de cette méthode de préparation serait important pour une compréhension plus complète de la signalisation des cellules de garde.
Nous avons utilisé la plante Arabidopsis thaliana comme modèle ; Toutefois, le présent protocole peut être appliqué à l’enrichissement de stomatiques cellules stomatiques chez d’autres espèces végétales telles que Brassica napus avec de petites modifications dans le temps de digestion. Comme une preuve de concept, nous avons démontré que stomatiques cellules stomatiques, enrichis par l’intermédiaire de cette méthode sont viables et réactif aux stimuli comme indiqué par le dosage de fluorescéine diacétate (FDA) et les études utilisant l’hormone végétale l’acide abscissique (ABA), respectivement. En outre, nous avons démontré que les protéines de haute qualité peuvent être isolés dans ces cellules stomatiques. Nous décrivons ici un protocole détaillé de ce processus.

<table><tbody><tr><td>Scalpel chirurgical en acier inoxydable</td><td>Feather&nbsp ;</td><td>&nbsp ; </td><td></td>NC9999403</tr><tr><td>Scotch Tape (3M)</td><td>ULINE</td><td>S-9781</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR455701</td><td></td></tr><tr><td>Cellulase (Onozuka R-10)&nbsp ;</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-3</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td><td>21560003-4</td><td></td></tr><tr><td>Microscope DM6000B</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cocktails inhibiteurs de protéase et de phosphatase</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>&nbsp ; </td><td></td>PI78443</tr><tr><td>Oak Ridge Tubes à centrifuger PPCO haute vitesse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3119-0030</td><td></td></tr><tr><td>Kit de quantification des protéines EZQ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>Diacétate de fluorescéine (FDA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>Acide abscissique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4906</td><td></td></tr><tr><td>Metro Mix 500</td><td>BWI Entreprises&nbsp ;</td><td>TX-500</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon Laemmli</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Safe Comassie (G-250)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation (2mL)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td> Institut <td>national de la santé</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4017-1EA</td><td></td></tr><tr><td>12 % Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1043</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr></tbody></table>

stomates tape-peel : une méthode améliorée pour la préparation d’échantillons de cellules de garde

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

L’étude des cellules stomatiques est essentiel à la connaissance des apports spécifiques de ce type de cellule à la fonction globale de plantes. Toutefois, il est souvent difficile d’isoler, et donc les étudier souvent fournit un défi.
Cette étude établit une méthode d’enrichissement stomatique cellules de garde. Le protocole utilise le ruban Scotch pour isoler les cellules stomatiques et extraire des protéines des cellules. Cette méthode améliore l’intégrité et le rendement des cellules de garde lors de l’isolation et fournit un échantillon fiable pour l’étude des processus de signalisation cellulaire et comment elles sont corrélées aux phénotypes mouvement stomatique. Dans cette méthode, les feuilles de la plante ont été partitionnés entre deux portions de la bande et pelées part pour retirer la face abaxiale. Ce protocole a été appliqué aux tissus foliaires Arabidopsis pour isoler les cellules stomatiques. Les cellules ont été traitées avec la fluorescéine diacétate (FDA) pour déterminer la viabilité et l’acide abscissique (ABA) pour évaluer le mouvement des stomates en réponse à ABA. En conclusion, le présent Protocole s’avère utile pour la préparation des cellules de garde des stomates enrichis et isoler des protéines. La qualité des protéines et cellules obtenus ici activation physiologique et autres études biologiques.

Une image représentative des cellules stomatiques Arabidopsis avant et après que la digestion du mésophylle et des cellules épidermiques est illustrée à la Figure 1. La viabilité des cellules de garde avant et après l’enlèvement du mésophylle et les cellules épidermiques peut être observée à l’aide de FDA pour mesurer l’activité enzymatique et l’intégrité de la membrane cellulaire (Figure 1 b et 1D). <strong clas...

Ce protocole décrit une méthode de préparation des cellules de garde des stomates enrichis qui est utile pour des études biologiques physiologiques et autres.

Stomates Tape-Peel : Une méthode améliorée pour la préparation d’échantillons de cellules de garde

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

L’objectif global de cette expérience est de préparer des cellules de garde de stomates enrichies de haute qualité pour des analyses physiologiques, biochimiques et moléculaires, telles que la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique. Bonjour, je m’appelle Sheldon Lawrence. Je suis un étudiant diplômé dans le laboratoire du Dr Chen au Département de biologie de l’Université de Floride.Aujourd’hui, je vais vous montrer comment isoler des cellules de garde à partir de tissus foliaires végétaux qui sont du matériel utile pour étudier à la fois la physiologie et la biologie des stomates. Cette méthode est considérée comme une nouvelle méthode pour isoler les cellules de garde. Il permet spécifiquement l’enrichissement de cellules de garde intactes et fournit des échantillons fiables pour l’étude des processus de signalisation des cellules de stomates.L’application de cette méthode peut s’étendre aux plantes Brassicaceae et à d’autres espèces végétales avec seulement de légères modifications au protocole. La démonstration est importante car l’étape principale d’enrichissement des cellules de garde peut s’avérer difficile. Pour commencer, sélectionnez des plants d’Arabidopsis matures âgés de cinq semaines.Retirez soigneusement une feuille avec un scalpel, en coupant la feuille à la base. Prenez deux morceaux de scotch et placez la feuille excisée entre eux. Appliquez doucement une pression des deux côtés tout en vous assurant que l’extrémité des morceaux de ruban n’adhère pas.Cela peut être fait en insérant un doigt entre eux. Retirez délicatement les deux morceaux de ruban adhésif l’un de l’autre et faites flotter immédiatement la peau prélevée sur le côté abaxial de la feuille dans le tampon d’ouverture des stomates. Une fois que toutes les pelures ont été recueillies, placez-les sous la lumière.Laissez-les là pendant deux heures. Prenez plusieurs peelings et placez-les sur des lames de microscope. À l’aide d’un microscope optique, ajustez les lentilles pour voir les cellules de garde et assurez-vous qu’elles sont ouvertes.Placez les peelings dans 50 ml de solution d’enzymes de digestion de la paroi cellulaire. Flottez-les et incubez-les à 26 degrés Celsius. Après 20 minutes, retirez les pelures de la solution enzymatique et rincez-les deux brièvement à l’eau déminéralisée, puis placez-les dans un tampon d’ouverture de stomates frais.Broyez les pelures dans un mortier avec de l’azote liquide, avec un pilon. Effectuez ensuite l’extraction du phénol comme décrit dans le texte. Après avoir broyé les pelures dans un mortier avec un pilon, transférez l’extrait, ainsi que les pelures dans un tube à centrifuger Oak Ridge, et agitez sur un shaker pendant une heure à quatre degrés Celsius.Faites précipiter les protéines extraites au phénol en ajoutant cinq volumes d’acétate d’ammonium froid à 0,1 mol dans du méthanol à 100 %. Après avoir précipité la protéine pendant la nuit à 20 degrés Celsius, récoltez la protéine par centrifugation et effectuez des lavages de granulés comme décrit dans le texte. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre d’acétone froide et transférez-la dans un microtube à centrifuger de deux millilitres.Après la centrifugation, jetez le surnageant d’acétone et séchez la pastille pendant dix minutes. Dissoudre l’échantillon de protéines dans un tampon de dissolution. Après le vortex et la centrifugation, prélever le surnageant et mesurer la concentration en protéines.Exécutez un gel SDS-PAGE. Visualisez les bandes protéiques séparées et observez la qualité relative des protéines. Il s’agit d’une image représentative des cellules de garde d’Arabidopsis avant et après la digestion enzymatique des cellules du mésophylle et de l’épiderme.La viabilité des cellules de garde avant et après l’élimination des cellules du mésophylle et de l’épiderme peut être observée à l’aide du diacétate de fluorescéine, qui mesure l’activité enzymatique et l’intégrité de la membrane cellulaire. Comme vous pouvez le voir, les cellules de garde sont toujours viables après le peeling et la digestion enzymatique. Cet exemple illustre le mouvement des stomates d’Arabidopsis en réponse au traitement par ABA.Les cellules de garde réagissent au traitement et l’ouverture des stomates diminue de plus de 50 % après 30 minutes de traitement par ABA. Voici un cours temporel du mouvement des stomates. De plus, une image représentative de l’ouverture des stomates à chaque point temporel est présentée.La détection, la séparation et l’abondance relative des protéines sont observées par SDS-PAGE. Les bandes sont claires et distinctes. Quatre répétitions biologiques sont incluses pour souligner la reproductibilité de l’extraction des protéines à partir de cette méthode.Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons essayé de corréler les changements moléculaires des cellules de garde en temps réel avec le mouvement des stomates. Une fois maîtrisé, un échantillon de protéines provenant de cellules de garde de stomates peut être préparé en quelques heures et peut être utilisé dans de multiples expériences. Il est important de se rappeler de ne pas infliger de gros dommages aux cellules de garde lors du pelage et de la manipulation.En suivant cette méthode, d’autres techniques peuvent être appliquées pour étudier la signalisation des cellules de garde, telles que le marquage isobare pour étudier la réponse redux des protéines chez les plantes dans des conditions normales et de stress. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et d’enrichir des cellules de garde intactes et viables, ainsi que d’extraire des protéines de haute qualité appropriées pour les études en aval.

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La base moléculaire de l'espace des réponses spécifiques phytochrome est étudiée en utilisant des plantes transgéniques qui présentent des tissus et des organes spécifiques déficiences phytochrome. L'isolement des cellules spécifiques présentant induite par la déplétion chromophore phytochrome Fluorescence-Activated tri cellulaire suivie par des analyses microarray est utilisée pour identifier les gènes impliqués dans les réponses phytochrome spatiale spécifique.

Étude des tissus et des organes spécifiques Réponses phytochrome utilisant FACS assistée type cellulaire profilage expression spécifique dans Arabidopsis thaliana</em

Nous avons développé un protocole simple et reproductible pour accéder à la réponse stomatique bactéries vivantes. Cette méthode minimise blessant et la manipulation de la feuille par rapport à l'utilisation des pelures épidermiques rapportés précédemment.

Évaluer la réponse stomatique à Live cellules bactériennes en utilisant l&#39;imagerie feuilles entières

Cet article décrit les méthodes de criblage des gènes contrôlant la perméabilité plasmodesmal et gradient donc auxine pendant la réponse tropique. Cela inclut la mesure du degré de réponse à tropisme hypocotyle   d'Arabidopsis thaliana et de vérifier la perméabilité plasmodesmal par l' acide 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonique (HPTS) le chargement et l' évaluation du niveau finalement callose.

Une stratégie pour valider le rôle des Callose médiée Plasmodesmal Gating dans la réponse Tropic

L'horloge circadienne régule environ un tiers du transcriptome Arabidopsis, mais le pourcentage de gènes qui se nourrissent de nouveau dans timekeeping reste inconnue. Ici, nous visualisons une méthode pour évaluer rapidement les phénotypes circadiens dans toute lignée mutante d'Arabidopsis en utilisant l'imagerie luminescente d'un journaliste circadien transitoirement exprimé en protoplastes.

Analyse rapide des phénotypes circadiens dans Arabidopsis protoplastes transfectées avec un Luminescent Clock Reporter

Les méthodes existantes pour la modification des plantes ont une applicabilité limitée. La nouvelle technologie dérivée des peptides proposée ici promet à la fois simplicité et efficacité dans l’introduction de protéines ou de gènes exogènes dans les compartiments intracellulaires souhaités de plantes intactes.

Peptide dérivé Méthode du transport des gènes et des protéines Across cellulaire et obstacles organites dans les plantes

Ici, nous présentons un protocole de capture interactif appliqué aux protoplastes de mésophylle de la feuille d' Arabidopsis thaliana . Cette méthode repose de manière critique sur la réticulation UV in vivo et permet l'isolement et l'identification des protéines de liaison de l'ARNm de la plante à partir d'un environnement physiologique.

Capture interactine d&#39;ARNm à partir de protoplastes végétaux

Dans ce protocole, nous décrivent des techniques pour la dissection appropriée d’Arabidopsis fleurs et siliques, quelques techniques de base de compensation et sélectionné les procédures pour les observations d’entier-montent des structures reproductrices de coloration.

Entier-Montez de compensation et la coloration des Siliques et organes fleur Arabidopsis

Ce protocole vise à démontrer comment induire des stomates en cluster dans les cotylédons des plantules de Arabidopsis thaliana en traitement d’immersion avec une solution moyenne contenant du sucre et observer des structures intracellulaires tels que les chloroplastes et les microtubules dans les cellules stomatiques en cluster à l’aide de confocal laser microscopie.

Un système d’Induction de stomates groupées par traitement de Immersion de Solution de sucre chez les plantules de Arabidopsis thaliana

Cet article décrit deux méthodes de phénotypage sans l’utilisation de peelings épidermiques pour caractériser les gènes contrôlant le développement stomatique. La première méthode montre comment analyser un phénotype stomatique à l’aide d’un épiderme végétal coloré au bleu de toluidine O. La deuxième méthode décrit comment identifier les ligands stomatiques et surveiller leurs activités biologiques.

Identification des gènes impliqués dans le développement stomatique par notation du phénotype épidermique

Ici, nous présentons une méthode simple d’observation directe et de mesure automatisée des réponses stomatiques à l’invasion bactérienne chez Arabidopsis thaliana. Cette méthode exploite un dispositif d’imagerie stomatique portable, ainsi qu’un pipeline d’analyse d’images conçu pour les images de feuilles capturées par l’appareil.

Observation directe et mesure automatisée des réponses stomatiques à Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 chez Arabidopsis thaliana

Ce protocole propose une méthode comparative pour évaluer les traits stomatiques et épidermiques de deux espèces distinctes à l’aide de peelings épidermiques, de techniques de dégagement et d’analyse d’images assistée par IA. L’objectif est de permettre une quantification à haut débit et reproductible des structures cellulaires sous-jacentes à la fonction stomatique pour des applications agricoles et la recherche végétale à grande échelle.

Caractérisation des traits stomatiques et épidermiques à l’aide de peelings, de dégagement et d’analyse d’images basée sur l’IA

Découvrez une méthode améliorée pour isoler des cellules de garde intactes à partir de feuilles de plantes. Cette technique permet des analyses physiologiques, biochimiques et moléculaires fiables pour étudier la signalisation stomatique.

Stomates Tape-Peel : Une méthode améliorée pour la préparation d’échantillons de cellules de garde

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