Name: À l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Découvrez comment évaluer la fonction des gènes humains pendant la méiose I en utilisant des ovocytes de souris comme modèle. Cette méthode permet d'étudier les prédispositions génétiques à l'aneuploïdie maternelle.

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Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche de l’American Society for Reproductive Medicine et du Charles et Johanna Busch Memorial Fund à l’Université Rutgers, The State University de NJ à K.S. est a été financée par une subvention de la N.I.H. (F31 HD0989597).

1. molecular Cloning
<ol><li>Obtenir le DVD complet séquence codante du gène d’intérêt et le plasmide dans vitro transcription (pIVT) vecteur11. NOTE : Clones d’ADNc pleine longueur sont disponibles dans le commerce de différents fournisseurs ou peuvent être générés via la chaîne par polymérase transcription inverse (RT-PCR). Le Centre National de ressources en ligne Biotechnology Information (NCBI) fournit des séquences de la transcription des gènes de nucléotide et exprimés séquence étiqueté les bases de données (EST). Pour la facilité de la protéine, visualisation et l’analyse des niveaux d’expression, fusion de la protéine fluorescente verte (Gfp) ou une autre balise fluorescente appropriée peuvent être souhaitable dans la stratégie de clonage.</li>
	<li>En utilisant une stratégie de clonage validée, insérez la séquence codante du gène d’intérêt dans la région de clonage multiples de pIVT. Une description détaillée du clonage moléculaire et les étapes nécessaires ont été précédemment décrits 12. Remarque : Si un produit de gène-fusion doit être générée, veillez à ce que le clonage est dans le cadre de lecture adéquat.</li>
	<li>Séquence de la construction à l’aide des amorces de globine afin d’assurer l’insertion du gène correcte, bonne fusion dans le cadre, et qu’aucune mutation induite par la polymérase de point ont été créées. Remarque : Si l’équipement de séquençage de l’ADN Sanger n’est pas disponible, beaucoup de compagnies offre faible coûts options de séquençage de l’ADN.</li>
	<li>Mutagenize ADN si génère des polymorphismes de nucléotides simples (SNP) ou insertions/délétions (INDELS). Mutagénèse d’ADN est décrite dans les étapes 1,5 à 1,7 ci-dessous. Pour des constructions de type sauvage, passez à l’étape de linéarisation 1.7.</li>
	<li>Concevoir des amorces de mutagenèse et compléter la réaction de PCR de mutagenèse pour générer la construction mutante selon le protocole du fabricant. PCR-mediated de mutagénèse dirigée a été décrit précédemment 13. En outre, beaucoup de compagnies offre des kits de mutagenèse incluent les protocoles.</li>
	<li>Transformer mutagénisé ADN hôte bactérien. Isoler et purifier les plasmides. Remarque : Beaucoup d’entreprises font des kits qui peuvent être utilisés pour isoler et purifier l’ADN plasmidique facilement. Suivre le protocole de fabricants en conséquence. Si vous utilisez une souche bactérienne Gram-négative telles que Escherichia coli, il est recommandé d’utiliser un kit qui supprime des endotoxines.</li>
	<li>Séquencer l’ADN isolé des transformants bactériennes à l’aide de standard séquençage Sanger pour confirmer l’introduction du SNP ou INDEL désirée.</li>
	<li>Linéariser des produits finaux à l’aide de la même enzyme de restriction digestion de l’ADN purifié. Remarque : Le vecteur pIVT contient plusieurs single-enzyme coupe sites inscrits sur la carte plasmidique sur Addgene 14.</li>
	<li>S’assurer que le produit est linéaire par électrophorèse sur gel d’agarose. La méthode d’électrophorèse sur gel d’agarose a été précédemment défini 14. Remarque : Pour toutes les étapes restantes, utilisez embouts barrière (filtre) et des matériaux sans RNase pour assurer une production stable et de haute qualité RNA.</li>
	<li>Purifier le produit digéré à l’aide d’un protocole de nettoyage ADN ou kit validé et éluer dans de l’eau exempte de RNase/DNase 30 µL. NOTE : Spin de silice-matrice colonne à base de produits sont recommandés pour la qualité, purifié l’ADN. Suivre le protocole de fabricants en conséquence.</li>
	<li>
In vitro transcrire ADN polymérase T7 suivant le protocole du fabricant à l’aide.</li>
	<li>Purifier et éluer l’ARN dans 30 µL d’eau libre de RNase ni DNase utilisant un kit de purification de basée sur les colonnes des acides nucléiques spin de silice-matrice suivant le protocole du fabricant.</li>
	<li>Effectuer la dénaturation électrophorèse sur gel d’agarose à l’aide de formaldéhyde pour confirmer la taille finale du produit RNA. Reportez-vous aux étapes 1.13-1,22 au-dessous de 14. (Figure 1).</li>
	<li>Préparer le gel en chauffant 1 g d’agarose dans 72 mL eau jusqu'à dissolution, puis laisser refroidir à 60 ° C.</li>
	<li>Préparer 10 X vadrouilles tampon en cours d’exécution en ajoutant des vadrouilles 0,4 M (pH 7,0), acétate de sodium 0,1 M et EDTA 0,01 M.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de 10 X vadrouilles exécutant tampon et 18 mL de 37 % de formaldéhyde (12,3 M) à la solution d’agarose refroidi.</li>
	<li>Caste le gel en versant la solution d’agarose dans un conteneur de formation de gel. Utilisez un peigne assez grand pour accueillir 10 µL. Après que gel a sélectionné et est ferme au toucher, retirez délicatement le peigne.</li>
	<li>Assembler le gel dans la cuve d’électrophorèse et ajouter assez 1 X vadrouilles tampon, assurant que le gel soit complètement recouvert.</li>
	<li>Préparation échantillons RNA en ajoutant 1 µg d’ARN à 0,5 volumes X de colorant de chargement contenant du formaldéhyde.</li>
	<li>Ajouter le bromure d’éthidium à RNA solution à une concentration de 10 µg/mL.</li>
	<li>Dénaturer la solution échantillon RNA à 70 ° C pendant 5 min.</li>
	<li>À l’aide de stérile, 10 µL pointes à filtre, charger 5 µL de marqueur de poids moléculaire et 5 µL d’ARN échantillons dans les puits séparés du gel et electrophorese à 5 V/cm jusqu'à ce que la teinture a migré au moins deux-tiers de la longueur du gel.</li>
	<li>Visualiser l’ARN dans le gel sur un illuminateur de trans UV. S’assurer que l’ARN est la bonne taille en comparant le marqueur de poids moléculaire.</li>
	<li>Pour mesurer la concentration et la pureté de l’ARN, transférer 1,2 µL d’ARN purifié à l’aide de filtre stérile de µL 10 conseils sur un spectrophotomètre UV. Notez que RNA haute qualité devrait avoir rapports absorbance A260/280 (1,8 à 2,2) et 260/230 (> 1,7) respectivement.</li>
	<li>En utilisant 10 µL bouts filtrants, aliquotes le restant de l’ARN purifié dans 0,5 µL centrifugation des tubes stériles (3-5 µL/tube). Stocker les tubes à-80 ° C jusqu’au moment de microinjection. Remarque : Une concentration de la dernière injection de 500 ng/µL est un point de départ optimal. Il est recommandé de diluer RNA 1:2 en RNase libre H20 avant microinjection pour réduire la viscosité de l’ARN dans la pipette de micro-injection.</li>
</ol>2. kinétochore-Microtubule attachement Assay
<ol><li>Diviser les ovocytes en groupes égaux de microinjection. NOTE : Collecte des ovocytes, transfert, microinjection et maturation méiotique a été décrite en détail dans JoVE précédemment 15.</li>
	<li>Microinject un groupe avec l’ARNm expérimentale et les autres groupes au contrôle WT ou Gfp et PBS ARNm. NOTE : 500 ng/µL est la concentration d’injection recommandé de commencer par 10. Un picoinjector peut être utilisé pour contrôler la quantité d’injection. Un volume d’injection de 5-10 pL est recommandé 15.</li>
	<li>À l’aide d’une main ou la bouche des appareils pipetage à jeton où le verre pipette ouverture est légèrement plus grand que le diamètre d’un ovocyte (100-150 µm), transfert des ovocytes dans une goutte de 100 µL de milieu de culture sans milrinone dans une boîte de Pétri couverts en huile minérale de qualité embryonnaire et incuber pendant 7 h à 37 ° C en 5 % C02 pour permettre la maturation suffisante jusqu'à la métaphase de la méiose, les ovocytes j’ai (j’ai rencontré) 15.</li>
	<li>Après incubation, utilisant le même appareillage de pipette comme ci-dessus, transfert des ovocytes dans une boîte de Petri orgue Centre-puits contenant 700 µL de milieu collection préalablement réfrigérées média essentiel minimum (MEM) dans le centre bien et 500 µL H20 dans l’anneau extérieur et Placer le plat sur la glace pendant 7 min. Remarque : Il est recommandé de refroidir des médias MEM et de centrer bien Pétri orgue à-20 ° C pendant au moins 20 min avant le traitement des ovocytes.</li>
	<li>Difficulté les ovocytes en transférant à l’aide de l’appareil de la pipette dans un puits d’une plaque de verre clair spot contenant 400 µL de paraformaldéhyde à 2 % en 1 X PBS pendant 20 min à température ambiante.</li>
	<li>Utilisant la même pipette appareil, transférez les ovocytes dans un autre puits sur une plaque spot contenant 400 µL de solution de blocage (0,3 % de BSA + 0,01 % Tween-20 + 0,02 % NaN3, PBS) et magasin à 4 ° C jusqu’au moment de traiter pour immunostaining. Remarque : pour le stockage des ovocytes à 4 ° C, plaque spot lamelle couvre-objet avec parafilm pour éviter l’évaporation.</li>
	<li>Utilisant le même appareillage de pipette, ovocytes transfert à un nouveau puits sur un terrain plat contenant 400 µL de solution de perméabilisation (PBS BSA de 0,3 % + 0,1 % TritonX-100 + 0,02 % NaN3) et incuber à température ambiante pendant 20 min. ovocytes transfert rapidement par le biais de trois gouttes de 400 µL bloquant la solution pour supprimer n’importe quel détergent résiduel. Remarque : Une plaque de verre clair 9 puits spot fonctionne bien pour aller de groupes par le biais de traitements multiples en un seul plat (étapes 2,4-2,5).</li>
	<li>Effectuer les reste des procédures immunocytochimie dans une chambre humidifiée, abri de la lumière à température ambiante. Utiliser un récipient en plastique de taille moyenne doublé avec un essuie-tout humide et couvrir avec du papier aluminium.</li>
	<li>En utilisant l’appareil de la pipette, transférez les ovocytes dans 30 µL bloquant la solution sur le couvercle d’une plaque à 96 puits et les place dans la chambre humidifiée pendant 10 min. NOTE : Les gouttes sont placés dans les renfoncements circulaires sur la plaque.</li>
	<li>Pour étiqueter des centromères et la tige, à l’aide de l’appareil de la pipette, transférez les ovocytes à 30 µL bloquant la solution contenant l’antigène anti-centromérique (ACA, Crest) (01:30) et anti-acétylé tubuline (1 : 1000) et incuber pendant au moins 1 heure.</li>
	<li>Rincez les ovocytes en transférant par gouttes trois 30 µL de bloquant la solution pendant 10 min chaque.</li>
	<li>À l’aide de l’appareil de la pipette, transfert des ovocytes à un 30 µL goutte de solution de saturation contenant des anticorps secondaires gratuits aux anticorps utilisés ci-dessus (anti-humain IgG 1 : 200, 1 : 200 de anti-souris IgG) et incuber pendant 1 heure.</li>
	<li>Répétez les étapes de rinçage de 10 min 3, dans 30 µL solution de blocage comme indiqué au point 2.11.</li>
	<li>Transférez les ovocytes, à l’aide de l’appareil de la pipette, dans 3-5 µL montage moyen contenant DAPI (5,9 µg/µL) sur une lame de microscope.</li>
	<li>Placer 4 petites gouttes (taille d’une tête d’épingle) de gelée de pétrole sur les coins de la lamelle couvre-objet pour empêcher l’écrasement des ovocytes.</li>
	<li>Déposer délicatement la côté de vaseline de lamelle couvre-objet sur le toboggan.</li>
	<li>Sceller la lamelle bords avec clairement vernis à ongles et laisser pour sécher pendant 5 min.</li>
	<li>Stocker les lames à 4 ° C, abri de la lumière, jusqu’au traitement par microscopie confocale. Remarque : Assurez-vous que l’indice de réfraction du milieu de montage et lamelle, matches les objectifs de microscope utilisés. Montage recommandées matériaux ont été précédemment décrit 15.</li>
	<li>Image des ovocytes en utilisant un objectif de 40-63 x sur un microscope confocal, capturant les petits pas (≤ 1 µm) dans le plan z, optimisé pour le travail objectif et l’image de l’ensemble de la région de la broche de la métaphase. Remarque : Assurez-vous d’image toutes les 3 canaux fonction spécifiques Anticorps secondaires utilisés à l’étape 2.11. Image en moyenne ≥ 4 et un zoom de 3 est idéal pour une résolution suffisante. Une taille de palier 1 µm fournit une visualisation claire des microtubules kinétochores dans des ovocytes de souris. La procédure de capture d’image variera d’un microscope à un microscope. Veuillez consulter le guide de l’utilisateur confocal de fabricants pour des mesures précises sur la façon de configurer les paramètres du microscope.</li>
	<li>Déterminer l’état de fixation kinétochore-microtubule en utilisant des logiciels d’imagerie suivant étapes 2.21-2.23 ci-dessous. Remarque : Les étapes suivantes décrivent cette procédure à l’aide d’un logiciel téléchargeable gratuit Image J (NIH), cependant, l’autre logiciel d’imagerie peut être utilisé. Pièce jointe types ont été précédemment défini 16 .</li>
	<li>Ouvrez l’image en faisant glisser le fichier dans la barre d’outils Image J.</li>
	<li>Dans la série-z ouverte, faire tous les canaux visibles (ADN, kinétochore et broche) en cliquant sur «canaux de fusion», disponible dans le menu déroulant «Image», sous le sous-onglet «couleur».</li>
	<li>À l’aide de la bascule au bas de l’image, passer chaque tranche z et déterminer l’attachement des microtubules kinétochores. Fixation détaillée descriptions ont été précédemment décrit 16
</li>
</ol>3. essai de défi alignement du chromosome
<ol><li>En utilisant l’appareil de pipette comme indiqué au point 2.3, transfert des ovocytes dans une goutte de 100 µL de milieu de culture sans milrinone sous huile et incuber pendant 7 h afin de permettre une maturation suffisante jusqu'à la métaphase de la méiose, les ovocytes j’ai (j’ai rencontré) comme décrit dans l’étape 2.3 17 . Remarque : Les procédures de collecte, microinjection et la maturation ovocytaire ont été décrits précédemment 15. Consulter le protocole d’essai de pièce jointe à l’étape 2.1-2.2 pour les contrôles et pour les concentrations de microinjection de RNA.</li>
	<li>Utilisant le même appareillage de pipette, ovocytes transfert à une culture d’organes puits Centre plat contenant 700 µL milieu de culture contenant monastrol [100µm] dans le centre bien et 400 µL H20 dans l’anneau entourant et incuber à 37 ° C pendant 2 h.</li>
	<li>Rincez le monastrol par le transfert des ovocytes, à l’aide de l’appareil de la pipette comme ci-dessus, par le biais de trois gouttes de 100 µL CZB milieu de culture et puis transférez les ovocytes à un nouveau centre-puits orgue boîte de Petri contenant 700 µL de milieu culture + MG132 [5 µM] pendant 3 h dans le centre bague. Ajouter 400 µL H20 de l’anneau extérieur.</li>
	<li>Difficulté les ovocytes de transférer, à l’aide de l’appareil de la pipette, dans un puits d’une plaque de verre clair spot contenant 400 µL 2 de paraformaldéhyde % dans du PBS pendant 20 min à température ambiante.</li>
	<li>Après fixation, transférez les ovocytes, à l’aide de l’appareil de la pipette, dans un nouveau puits d’une plaque de verre clair spot contenant 400 µL solution de saturation et de conserver à 4 ° C jusqu’au traitement d’immunomarquage. Remarque : pour le stockage des ovocytes à 4 ° C, plaque spot lamelle couvre-objet avec parafilm pour éviter l’évaporation.</li>
	<li>Permeabilize et l’étiquette des ovocytes par immunocytochimie comme décrit aux points 2.6-2.16.</li>
	<li>Ovocytes en utilisant un objectif de 40-63 x sur un microscope confocal, capture d’image < 1 µm pas dans le plan z en veillant à l’image de l’ensemble de la région de la broche de la métaphase.</li>
	<li>Pour définir l’alignement du chromosome statut ouvrir des fichiers image à l’aide de logiciels d’imagerie. Remarque : Les étapes suivantes décrivent cette procédure à l’aide d’un logiciel téléchargeable gratuit Image J (NIH), cependant, l’autre logiciel d’imagerie peut être utilisé.</li>
	<li>Faites glisser image dans Panneau de configuration image J.</li>
	<li>Dans la série-z ouverte, utilisez l’outil de point (accessible en cliquant sur l’icône dans la barre de contrôle Image J point) pour marquer des points à la fin de chaque pôle du fuseau dans leur respectif z-tranche en plaçant l’outil au-dessus du pôle du fuseau dans l’image en cliquant sur l’image. Ajouter ces points dans la région de gestionnaire d’intérêt (ROI) en appuyant sur commande + t sur le clavier.</li>
	<li>Déterminer les coordonnées spécifiques pour chacun des emplois définis à l’étape 3.10 en sélectionnant le point spécifique dans le gestionnaire de ROI, puis en cliquant sur le bouton de mesure. Cela fournira un résultats contenant de table coordonnées x et y pour chaque point. Ce seront les points X1, Y1 et X1, Y2, respectivement.</li>
	<li>Ensuite, déterminez la coordonnée Z de true. Cela se fait en multipliant le nombre de tranche de la z-tranche spécifique dans la pile de z dans lequel figurait le pôle du fuseau (c.-à-d. tranche #2 de 6) c'est-à-dire par chaque point individuel dans l’épaisseur de la pile (c'est-à-dire 1 µm) (exemple : couper 2 x 1 µm = 2). Ceux-ci seront respectivement les points Z1 et Z2.</li>
	<li>Déterminer la longueur d’axe à l’aide de l’équation du théorème de Pythagore (a2 + b2 = c2) en utilisant le défini précédemment x, y et z coordonnées des étapes 3.11-3.13. Pour chaque axe la longueur finale est égale à : √((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>Déterminer le milieu de l’axe. Cela correspond à la moitié de la longueur de la broche. À l’aide de l’outil en ligne dans l’Image J, en cliquant sur l’icône de la ligne dans la barre d’outils Image J, tracez une ligne qui est d’un pôle du fuseau pour le milieu de l’axe. La longueur s’affichera dans la barre d’outils Image J.</li>
	<li>Déterminer statut d’alignement du chromosome en évaluant la distance de chromosome de la milieu de la broche à l’aide de l’outil de mesure de ligne. À l’aide de l’outil en ligne disponible en cliquant sur l’icône de la ligne dans la barre d’outils Image J, tracer une ligne depuis le milieu de l’axe au chromosome. La longueur s’affichera dans la barre d’outils Image J. Supérieur à 4 µm de la milieu de l’axe des chromosomes sont considérés comme non aligné 18.</li>
</ol>

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<li>Nguyen, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+threonine+3+on+histone+H3+by+haspin+kinase+is+required+for+meiosis+I+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes.</a> J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).</li>
<li>Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+maturation+involves+compartmentalization+and+opposing+changes+of+cAMP+levels+in+follicular+somatic+and+germ+cells%3A+studies+using+selective+phosphodiesterase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors.</a> Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).</li>
<li>Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+spindle+assembly+mechanisms+with+monastrol%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+mitotic+kinesin%2C+Eg5%5BTitle%5D)+AND+%22Eg5.+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5.</a> Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li>
<li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li>
<li>Fellmeth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+three+Aurora+kinase+C+splice+variants+found+in+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).</li>
<li>Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+cold-stable+kinetochore+fiber+in+metaphase+PtK1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells.</a> Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).</li>
<li>Brunet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+fibers+are+not+involved+in+the+formation+of+the+first+meiotic+spindle+in+mouse+oocytes%2C+but+control+the+exit+from+the+first+meiotic+M+phase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase.</a> J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En raison de l’identification rapide et croissante des humains variantes génétiques associées à la maladie, il est essentiel que les systèmes sont établies afin d’évaluer leur importance biologique. Comprendre la fonction des protéines dans la méiose humain pose des défis particuliers car les ovocytes humains sont précieux et sperme rare et humaine ne se prêtent pas aux manipulations génétiques. Les ovocytes de souris sont un système modèle mammifère précieux pour l’évaluation humaine gène méiotique fonction <sup class="...

L’infertilité est une maladie qui touche 10 à 15 % de la population humaine d’âge procréateur 1, d'où presque moitié cherche un traitement médical 2. Bien que l’étiologie de l’infertilité est diversifiée et une anomalie génétique la plus courante chez l’homme est souvent multifactorielle, aneuploïdie embryonnaire 3. Aneuploïdie est définie comme l’écart (gain ou perte) du bon nombre de chromosomes dans une cellule. Le phénomène de l’aneuploïdie sur les embryons humains est fréquent et augmente avec l’âge maternel avancé 4,5. Quatre essais comparatifs randomisés ont mis en évidence l’avantage de la sélection des embryons (euploïdes) seulement chromosomique normales pour le transfert de l’utérus parce que cette stratégie a donné lieu à des taux accrus d’implantation, taux d’avortement spontané et un temps plus court pour atteindre la grossesse 6,7,8,9. Par conséquent, comprendre l’étiologie de l’aneuploïdie humaine peut avoir des implications importantes en procréation assistée.
Bien que le dépistage génétique pré-implantatoire pour aneuploïdies est bénéfique dans les traitements contre l’infertilité, une compréhension approfondie de la façon dont sont originaires les aneuploïdies fait encore défaut. Il est largement admis qu’il existe une corrélation positive des aneuploïdies méiotiques (son originaires au cours de la production des gamètes) et âge de la mère, cependant, certains taux d’aneuploïdie embryonnaires présents des femmes qui s’écartent de la moyenne pour leur âge donné 4. Ces cas donnent à penser que l’âge seul n’est pas toujours prédictive du risque de générer un embryon aneuploïde. Autres facteurs peuvent jouer un rôle dans l’augmentation du risque d’aneuploïdie embryonnaire, comme les variantes génétiques.
Un aspect clé de l’enquête sur la contribution potentielle d’un variant du gène de l’aneuploïdie au cours de la méiose de l’ovocyte est de concevoir un système pour évaluer rapidement la fonction du gène méiotique. En raison des contraintes éthiques et un accès limité, il est impossible de réaliser ces expériences à l’aide d’ovules humains. Ces problèmes peuvent être contournés en utilisant des ovocytes de souris, et ici une série de tests pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I sont décrites. Par microinjecting l’ARN messager (ARNm) codant pour la variante du gène d’intérêt, la localisation de la protéine humaine dans le œuf de souris peut être visualisée et utilisée pour déterminer si l’expression ectopique de la protéine humaine sauvage et mutante dans un altérations phénotypiques qui pourraient conduire à une aneuploïdie. Ces phénotypes comprennent une augmentation dans les microtubules qui s’attachent à la mauvaise sœur kinétochore et l’incapacité de soutenir l’alignement des chromosomes en métaphase de la méiose I. ce qui est important, ce protocole peut être utilisé pour étudier le gain et perte de fonction variants génétiques en établissant des conditions expérimentales spécifiques à contester les événements clés de la méiose de l’ovocyte tels que broche d’alignement bâtiment et le chromosome 10.

<table><tbody><tr><td>0,2 mL Seal-Rite Tube PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Échelle d’ADN</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>100 bp Échelle d’ADN</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>6X Charge d’ADN</td><td>Colorant Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de point en verre à 9 puits</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Albumine de sérum bovin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-fluor-568 conjugué anti-souris IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Alexa-fluor-633 conjugué anti-humain IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>VWR</td><td>AA0356</td><td></td></tr><tr><td>Table anti-vibration</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>tout modèle standard</td></tr><tr><td>Tubuline anti-acétylée anticorps</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:100 diution</td></tr><tr><td>Anticorps anti-centromérique (CREST)</td><td>Anticorps incorporés</td><td>15-234</td><td>dilution 1:30&nbsp ;</td></tr><tr><td>Barrière (Filtre) Embouts de pipette</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12635</td><td>Assurez-vous qu’ils sont compatibles avec votre marque de pipettes. Ceux-ci sont compatibles avec les pipettes de la marque Eppendorf.</td></tr><tr><td>Milieux de culture déshydratés BD Difco : LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>Milieux de culture déshydratés BD Difco : LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tube capillaire</td><td>Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Puits central Plat de culture d’organes</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir</td><td></td> de CO2<td></td><td>Pour incubateur</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>tout modèle standard</td></tr><tr><td>Centrifugeuse (avec capacité de refroidissement)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>tout modèle standard&nbsp ;</td></tr><tr><td>Verre de protection 11 x 22 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles Thomas</td><td>Scientific</td><td>6663-F10</td><td>L’épaisseur varie pour certains microscopes</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC H20</td><td>Life Technologies</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Bain sec numérique</td><td>Thermo Scientific</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>Easy A élevé enzyme de clonage de fidélité</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>Pour le clonage de l’ADN&nbsp ;</td></tr><tr><td>Des enzymes pour la linéarisation de pIVT</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>NdeI ou KasI peuvent être utilisées</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Thermo Scientific</td><td>155585011</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent.</td><td></td><td></td><td>N’importe quel microscope fluorescent peut être utilisé</td></tr><tr><td>Formaldéhyde (37 %)</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>9311</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de chargement d’ARN formaldéhyde</td><td>Ambion</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope givrées (non chargées) 25X75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Clones</td><td></td><td></td> d’ADNc pleine longueur <td>Peut être obtenu auprès de n’importe quel fournisseur qui fournit une lecture ouverte Clones de cadre</td></tr><tr><td>Appareil d’électrophorèse sur gel</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>tout modèle standard</td></tr><tr><td>Verre Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Globin Forward Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.&nbsp ; Peut être acheté auprès de n’importe quelle entreprise qui génère des oligonucléotides personnalisés</td></tr><tr><td>Globin Reverse Primer for pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Peut être acheté auprès de n’importe quelle entreprise qui génère des oligonucléotides personnalisés</td></tr><tr><td>Pipettes de maintien</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>Humidified Chamber</td><td></td><td></td><td>Tupperware peut être utilisé</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Go Perles RT-PCR</td><td>Incubateur</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 27925901 GE Life Sciences <td>tout modèle standard avec technologie CO2 et chemise d’eau</td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Instruments</td><td></td> Nikon <td>Tout modèle standard</td></tr><tr><td>Logiciel Image J (NIH)</td><td></td><td>Logiciel d’analyse d’images</td>NIH <td></td></tr><tr><td>Couvercle de plaque à 96 puits</td><td>Nalgene Nunc International</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>Tube microcentrifuge à faible adhérence de 0,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&nbsp ;</td><td>MacVector</td><td></td><td>Logiciel d’analyse de séquences</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Marqueurs de l’ARN du millénaire-Formaldéhyde&nbsp ;</td><td>Ambion</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>Remise en suspension dans le DMSO à 2,5 mM</td></tr><tr><td>d’huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Uniquement utilisé testé sur les embryons, filtré stérilement</td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>Remise en suspension dans le DMSO à 100 mM</td></tr><tr><td>Embout buccal</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir</td><td></td> <td>N2</td><td>pour vernis à ongles de table antivibratoire</td></tr><tr><td> ; Transparent</td><td></td><td></td><td>N’importe quel vernis à ongles transparent peut être utilisé</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume Spectrophotomètre UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>n’importe quel modèle standard</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Tampon de gel dénaturant</td><td>Life Technologies</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Tampon de fonctionnement</td><td>Life Technologies</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Tampon de fonctionnement</td><td>Thermo Scnentific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture d’organes 60x15mm</td><td>Life Technologies</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Polysciences, Inc.&nbsp ;</td><td></td><td></td>577773</tr><tr><td>Thermocycleur PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484075 Boîte de</td><td></td></tr><tr><td>Pétri 139 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 60 mm</td><td>Falcon BD 351007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picoinjecteur</td><td>XenoWorks Digital Microinjecteur</td><td></td><td>tout modèle standard</td></tr><tr><td>Extracteur de pipette</td><td>Flaming-Brown Extracteur de micropipette</td><td>Modèle P-1000</td><td></td></tr><tr><td>pIVT Plasmide</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>Vecteur vide adapté à l’expression des ovocytes.</td></tr><tr><td>Sérum de jument enceinte Gonadotrophin</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>purification jusqu’à 20 μL d’ADN plasmidique</td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange II site directed mutagenesis</td><td>kit Agilent&nbsp ;</td><td>200523</td><td>kit de mutagénèse pour insertions et suppressions</td></tr><tr><td>Quikchange lightning kit de mutagénèse dirigée multi-sites</td><td>Agilent&nbsp ;</td><td>210512</td><td>kit de mutagénèse pour les changements de site unique</td></tr><tr><td>Ciseaux (pointe fine)</td><td>Outils de sciences fines</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux (pointe moyenne)</td><td>Outils de sciences fines</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1,5 mL microcentrifugeuse</td><td>tube USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Chauffe-lames</td><td></td><td></td><td>tout modèle standard</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre (Nanodrop)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td></td><td></td><td>tout modèle standard</td></tr><tr><td>Efficacité de sous-clonage DH5a Cellules compétentes Thermo</td><td>Fisher Scientifc</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>BD Bioscienes</td><td>309623</td><td>1 ml, 27G(1/2)</td></tr><tr><td>T4 ADN Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage Machine à haut rendement kit de transcription d’ARN coiffé</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler (Pointe fine- Taille 5)</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée sans Dnase/Rnase UltraPure Thermo</td><td>Fisher Scientifc</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium UltraPure 10mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP UVP UV/White lite transilluminateur</td><td>Fisher Scientific</td><td>UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Montage</td><td>Medium Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

À l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose i

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Aneuploïdie embryonnaire est la principale cause génétique de la stérilité chez l’homme. La plupart de ces événements sont créés au cours de la méiose femelle, et quoique corrélés avec l’âge maternel, âge seul n’est pas toujours prédictive du risque de générer un embryon aneuploïde. Donc, les variantes génétiques pourraient expliquer pour la ségrégation des chromosomes incorrect au cours de l’ovogenèse. Étant donné que l’accès à des ovocytes humains est limitée à des fins de recherche, une série de tests ont été développés pour étudier la fonction du gène humain au cours de la méiose I à l’aide des ovocytes de souris. Tout d’abord, l’ARN messager (ARNm) du gène et variant du gène d’intérêt sont microinjected dans des ovocytes de souris que j’ai arrêté la prophase. Après avoir laissé le temps à l’expression, ovocytes sortent de façon synchrone en maturation méiotique pour compléter la méiose I. Par le marquage de l’ARNm avec une séquence d’un reporter fluorescent, tels que de la protéine fluorescente verte (Gfp), la localisation de la protéine humaine peut être évaluée en plus les altérations phénotypiques. Par exemple, gain ou perte de fonction peut être étudiée par l’établissement de conditions expérimentales qui remettent en question le produit du gène pour corriger les erreurs méiotiques. Bien que ce système est avantageux dans les enquêtes sur la fonction de protéine humaine durant l’ovogenèse, l’interprétation adéquate des résultats devrait être entreprise, étant donné que l’expression de la protéine n’est pas aux niveaux endogènes et, à moins que contrôlé (c'est-à-dire frappé out ou vers le bas), murins homologues sont également présents dans le système.

Après in vitro transcription haute qualité RNA aura un ratio A260/A280 (1,8 à 2,2) et un ≥1.7 de ratio A260/A230 lorsqu’elle est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre. L’image dans la Figure 1 montre la migration de in vitro-produit RNA sur un gel d’agarose dénaturation après électrophorèse. Un groupe qui est étalé dans le modèle ou un échantillon qui a plusieurs bandes de tailles peut indiquer la contamination ou la dégradation de l’échan...

Comme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.

À l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

L’objectif global de cette série de tests est d’étudier la fonction des gènes humains au cours de la méiose I à l’aide d’ovocytes de souris. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la reproduction humaine, telles que s’il existe une prédisposition génétique à l’aneuploïdie maternelle. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise des ovocytes de souris comme modèle pour la méiose chez les mammifères, ce qui est utile compte tenu de l’inaccessibilité des ovules humains pour les études de la fonction des gènes.Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons séquencé les exomes de femmes qui avaient subi des traitements de fécondation in vitro et dont les taux d’aneuploïdie embryonnaire ne pouvaient pas être expliqués par leur âge maternel. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d’analyse d’images sont difficiles à apprendre et la définition de paramètres d’analyse stricts est essentielle à la rigueur et à la reproductibilité. À l’aide d’une stratégie de clonage validée, insérez la séquence codante complète du gène d’intérêt dans la région de clonage multiple du vecteur de transcr

using-mouse-oocytes-to-assess-human-gene-function-during-meiosis-i

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Ce protocole illustre la technique d'extraction ou d'ovocytes à un stade précoce des embryons fertilisés de l'oviducte de la souris. La capacité à identifier les infindibulum et insérer une aiguille extrémité émoussée en elle est essentielle à l'exécution correcte de la procédure.

Récupération des ovocytes de souris

Les ovocytes sont sujettes à une aneuploïdie raison d'erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la maturation méiotique. Oeufs aneuploïdes peut causer l'infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Ici, nous décrivons les méthodes pour introduire des matériaux de choix dans des ovocytes et des méthodes pour étudier la maturation méiotique et évaluer ploïdie.

Évaluation microinjection des ovocytes de souris, la maturation et de ploïdie

Ici, nous présentons un protocole de l'épuisement de l'ARNm de siRNA médiation spécifique suivie d'une analyse d'immunofluorescence pour évaluer l'assemblage du fuseau méiotique et de l'organisation dans des ovocytes de souris. Ce protocole est approprié pour l'appauvrissement de produits de transcription in vitro et l'évaluation fonctionnelle de broche différents et / ou des facteurs de MTOC associée dans les ovocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Nous présentons des protocoles pour la collecte, la préparation et l’imagerie d’ovocytes de drosophile matures. Ces méthodes permettent de visualiser le comportement des chromosomes ainsi que l’assemblage et la fonction du fuseau pendant la méiose.

Techniques for Imaging Prométaphase et Metaphase de méiose I fixe<em&gt; Drosophila</em&gt; ovocytes

L’ovogenèse chez les mammifères est connu pour être source d’erreurs, notamment en raison de missegregation de chromosome. Ce manuscrit décrit des méthodes de préparation de la chromatine se propager de la prophase de la souris, métaphase I et II-mise en scène des ovocytes. Ces techniques fondamentales permettent l’étude des protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes tout au long de l’ovogenèse chez les mammifères.

La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II

Un protocole optimisé est présenté qui permet l’épuisement des centres d’organisation des microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris au cours de la métaphase I à l’aide d’un laser femtoseconde proche infrarouge.

Ablation laser multiphotonique de centres organisateurs de microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris

L’erreur dans la ségrégation chromosomique est une caractéristique commune dans les ovocytes. Par conséquent, l’étude du point de contrôle de l’assemblage de la broche donne des indices importants sur les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains. Le présent protocole décrit trois essais complémentaires pour évaluer l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris.

Évaluation de l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris

Le maintien de l’intégrité du génome de l’ovocyte est nécessaire pour assurer la fidélité génétique de l’embryon résultant. Nous présentons ici un protocole précis pour détecter les cassures double brin de l’ADN dans les cellules germinales femelles de mammifères.

Détection de cassures double brin de l’ADN dans des ovocytes de souris

Ce protocole fournit un cadre expérimental pour documenter l’impact physique du cytosquelette sur la forme nucléaire et les organites internes sans membrane dans le système ovocytaire de la souris. Le cadre peut être adapté pour être utilisé dans d’autres types de cellules et contextes.

Capture de l’agitation basée sur le cytosquelette du noyau de l’ovocyte de souris à travers les échelles spatiales

Les erreurs méiotiques dans les synapses et la recombinaison sont courantes chez les ovocytes de mammifères. Une analyse rigoureuse des protéines impliquées dans ces processus est essentielle pour comprendre comment et pourquoi l’ovogenèse tourne souvent mal. Les techniques présentées ici permettent un suivi complet de la recombinaison et des synapses pour évaluer la qualité des ovocytes chez la souris.

Préparation de la propagation des chromosomes méiotiques à partir d’ovocytes de souris pour l’évaluation de la synapse et de la recombinaison

Découvrez comment évaluer la fonction des gènes humains pendant la méiose I en utilisant des ovocytes de souris comme modèle. Cette méthode permet d'étudier les prédispositions génétiques à l'aneuploïdie maternelle.

À l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I

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