Name: Fluorescence moléculaire tomographie pour l’imagerie In Vivo des xénogreffes de glioblastome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Découvrez la tomographie moléculaire par fluorescence pour imager les xénogreffes de glioblastome in vivo. Cette méthode non invasive permet de surveiller quantitativement la progression tumorale et la réponse thérapeutique.

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Nous remercions le Dr Frederick Lang, MD Anderson Cancer Center pour GBM-PDX neurospheres. Ce travail a été soutenu par la défaite GBM recherche Collaborative, une filiale de la société nationale de cerveau tumeur (Frank Furnari), R01-NS080939 (Frank Furnari), le James S. McDonnell Foundation (Frank Furnari) ; Jorge Benitez a été soutenue par un prix de l’Association américaine de tumeur cerveau (ABTA) ; Ciro Zanca était partiellement soutenue par une bourse de recherche postdoctorale de Fondation américaine-italien d’un Cancer du sein. Frank Furnari reçoit des traitements et un soutien supplémentaire de Ludwig Institute for Cancer Research.

L’utilisation des animaux de recherches expérimentales et des agents infectieux, tels que les lentivirus à transmettre les cellules cancéreuses, requièrent l’approbation préalable par le programme institutionnel de soins aux animaux et par le Comité institutionnel de biosécurité. Ce protocole suit les directives de protection des animaux de l’Université de Californie à San Diego (UCSD).
1. marquage des cellules de glioblastome avec FP635 ou FP720 Construct
<ol><li>Produire et purifier les lentivirus selon le protocole décrit par Tiscornia et al. 12
</li>
	<li>La culture environ 2,0 x 106 cellules d’une lignée de cellules de gliome humain avec DMEM plus 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) dans un plat de 15 cm ; culture 2.0 x 106 glioblastome humain dérivé de patient (GBM-PDX) domaine avec DMEM ou F12 le milieu 1:1 avec B27 supplément plus humain facteur de croissance épidermique recombinant (EGF ; 20 ng/mL) et FGF (10 ng/mL) dans une fiole de T75.</li>
	<li>Maintenir toutes les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2et 100 % d’humidité relative.</li>
	<li>Dissocier les cellules.<ol>
<li>Pour les cellules de gliome : Retirez le surnageant des plaques et l’ajout de 3 à 5 mL de trypsine 1 X pour les cellules de gliome.</li>
		<li>Pour le GBM sphères : recueillir les cellules en pipettant également, les cellules dans un tube de 15 mL.<ol>
<li>Tournez en bas les sphères GBM à 200 x g pendant 5 min à l’aide d’une centrifugeuse de table à la température ambiante.</li>
			<li>Retirez le surnageant et ajouter 3 à 5 mL de solution de détachement cellulaire.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incuber les cellules à 37 ° C pendant 10-15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soigneusement se dissocient les cellules en pipettant également monter et descendre plusieurs fois (faire en sorte que soient remplis les sphères et les cellules de gliome dissocié) et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules avec 5 mL de milieu en pipettant également monter et descendre plusieurs fois. Déterminer la viabilité cellulaire exclusion bleu trypan.</li>
	<li>Plaque de 1,0 x 106 des cellules cibles dans un plat de 10 cm avec 5 mL de milieu de pipetage.</li>
	<li>Transduce cellules avec lentivirus exprimant des protéines fluorescentes à la multiplicité d’infection (MOI) 5 tel qu’il est décrit par Tiscornia et al. 12 et incuber à 37 ° C.</li>
	<li>Après 24h, retirer le support des cellules transduits, ajouter 5 mL de milieu frais et incuber pendant supplémentaire 48 h à 37 ° C.</li>
	<li>Se dissocient les cellules infectées en une suspension de cellules individuelles tel que décrit dans les étapes 1.4-1.6. Tournez en bas les cellules à 200 x g pendant 5 min et remettre en suspension dans 500 µL de solution de tri (solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 1 % FBS).</li>
	<li>Distribuer la suspension cellulaire dans des tubes de FACS. Co, détachant les cellules 1 µL/ml de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dihydrochlorure d’exclure les cellules mortes. Contrôles négatifs sont tenus de mettre en place les portes cytomètre de flux (cellules transduites non et non-transduites / DAPI colorées).</li>
	<li>Trier les cellules fluorescentes-positif/négatif DAPI dans tri solution, tel que décrit par Ben Ali et al. 13et de recueillir les cellules triées dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Tournez en bas les cellules triées à 200 x g pendant 5 min, retirez le surnageant et remettre en suspension dans 5 mL de milieu de culture. Ensemencez les cellules triées dans un plat de 10 cm de pipetage. Incuber à 37 ° C pendant au moins 48 à 72 heures.</li>
	<li>Développez les cellules triées en dissociant les cellules suivant étapes 1.4-1.6 et plaquant dans plusieurs plats pour des expériences in vivo . Remarque : Pour plus de détails sur la cellule Tri préparation et purification, voir Ben et al. 13
</li>
</ol>2. intracrânienne Injection de cellules de glioblastome iRFP-tag dans des souris immunodéficientes
Remarque : Avant de commencer l’intervention, assurez-vous que la salle de chirurgie et outils sont propres pour la procédure. Utilisez immunodéficientes nue (Foxn1nu) mâles ou femelles souris athymiques, entre 4-5 semaines et g 17-19 pour les injections intracrâniennes. Animaux devrait être logés pendant au moins 3 jours après leur arrivée et avant la chirurgie.
<ol><li>Préparation de cellules<ol>
<li>Récolter et dissocier les cellules fluorescentes de positif-gliome dans une suspension de cellules individuelles (1.4-1.6 étapes) et remettre en suspension 0,5 ou 1,0 x 106 cellules de 2 à 5 µL de PBS par injection par animal. Pipetter, la suspension de cellules dans un tube microtubes de 1,5 mL et le déposer sur la glace.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gestion et préparation de l’anesthésie<ol>
<li>Préparez 200 µL d’une solution saline contenant la kétamine (100 mg/kg) et xylazine (10 mg/kg) par 20 grammes de poids corporel de souris. Peser les animaux et on calcule la dose appropriée de l’anesthésie.</li>
		<li>Fournir une injection intrapéritonéale de l’anesthésie et pommade ophtalmique pour les yeux pour éviter la déshydratation. Pour plus d’informations sur cette étape, voir Kathleen et al. 14 Place l’animal sur un pad thermique de l’eau préchauffée à 37 ° C.</li>
		<li>Vérifier que les animaux sont anesthésiés par la surveillance de la réponse de pincée d’orteil (réflexe de pédale), généralement dans les 5-10 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injection intracrânienne<ol>
<li>Charger un µL 5 seringues Hamilton (aiguille pointe émoussée) avec suspension de cellules et de monter dans le support de sonde.</li>
		<li>Placez la souris dans un petit cadre stéréotaxique animaux et fixer la tête en utilisant les barres de l’oreille et l’adaptateur incisive après les détails décrits par Cetin et al. 15
</li>
		<li>Désinfecter la tête avec 70 % d’éthanol et Bétadine solution. Assurez-vous que le champ opératoire est terminer stérile. Effectuer une incision médiane avec un petit scalpel et séparer la peau et les tissus conjonctifs.</li>
		<li>Placer la seringue de Hamilton sur le point de bregma utilisant le micromanipulateur.</li>
		<li>Eloignez la sonde titulaire 1,0 mm antéro-postérieure et 2.0 mm latérale du point de bregma. Marquer cette position avec un crayon.</li>
		<li>À cet endroit, soigneusement faire un trou dans le crâne avec une perceuse à main micromoteur en appliquant une légère pression vers le bas jusqu'à ce que les vaisseaux sanguins deviennent visibles. Ne pas interrompre le parenchyme arachnoïdien de mater et le cerveau.</li>
		<li>Introduire l’aiguille dans le trou de trépan et advance 3,0 mm au-dessous de la surface de la pie-mère.</li>
		<li>Mettre en place le volume (2 à 5 µL) et débit (1 µL/min) d’injection à l’aide d’un injecteur stéréotaxique motorisé ou effectuer manuellement l’injection.</li>
		<li>Après l’injection, retirer l’aiguille progressivement par ordre croissant de 1,0 mm toutes les 1 min et nettoyer le site d’injection avec l’éthanol à 70 %.</li>
		<li>Fermer la peau plaie avec agrafes chirurgicales ou en faisant des sutures chirurgicales (souvent dénommés "points") et voir Kathleen et al. 14 pour plus de détails.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Récupération de l’animale<ol>
<li>Transférer l’animal à un pad thermique de l’eau (37 ° C) et de surveiller la température corporelle, rythme respiratoire et cardiaque, jusqu'à la guérison complète. Administrer une analgésie par des protocoles standard. Remarque : Pour plus d’informations sur la procédure stéréotaxique, chirurgie et coordonnées, voir autres rapports5,14,15.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. FMT imagerie
Remarque : Selon le but expérimental, le glioblastome iRFP-tag, les cellules peuvent être surveillés en vivo avant, pendant ou après le traitement. Pour le but de l’imagerie, anesthésier les animaux à l’aide d’une chambre à induction isoflurane, maintenir dans une cassette d’imagerie pendant le balayage et l’image dans le socle de l’imageur FMT.
<ol><li>Retirer l’animal de la cage et le place dans la chambre de l’induction de l’isoflurane. Fermer la chambre et sur alimentation en oxygène et vaporisateur à 3-5 %.</li>
	<li>Surveiller l’animal jusqu'à ce qu’il est complètement anesthésié, généralement à 1-2 min. inconscient animaux ne doit pas répondre à des stimuli externes.</li>
	<li>Retirer l’animal anesthésié de la chambre et mettre l’animal dans la cassette d’imagerie en plaçant l’adaptateur de tête tout d’abord, puis en plaçant l’animal face vers le bas. Assurez-vous que la tête se trouve dans le centre de la cassette.</li>
	<li>Placer la platine supérieure de la cassette sur le dessus et serrer les boutons de réglage jusqu'à 17 mm.</li>
	<li>Une fois que l’animal est sûr dans la cassette d’imagerie, passez à l’imagerie en y insérant la cassette de la station d’accueil interne de l’imageur FMT, où l’isoflurane est pompée pour garder l’animal anesthésié.</li>
	<li>Lancez le logiciel imageur et analyseur en double-cliquant sur l’icône du logiciel.</li>
	<li>Dans la fenêtre de l’onglet « expérimental », sélectionner le « Database » et le « Groupe d’étude ».</li>
	<li>Ouvrez la fenêtre de l’onglet « Scan » et sélectionnez l’objet à l’image en cliquant sur « Sélectionner le sujet ». Aussi, sélectionnez le canal de laser dans le panneau « Canal de Laser ». Pour les cellules marquées FP635, sélectionnez « laser canal 635 nm » et pour marqué FP720 cellules, sélectionnez « laser canal 680 nm ».</li>
	<li>Acquérir une image en cliquant sur l’option « Capture » dans la fenêtre de l’onglet « Scan ». Ensuite, réglez le champ de balayage en faisant glisser le champ de balayage de l’image capturée à un nombre déterminé d’emplacements source, habituellement dans les sources de 20-25 pour le côté ipsilatéral.</li>
	<li>Cochez l’option « Ajouter à la file d’attente de la reconstruction » et cliquez sur « Scan » dans la fenêtre de l’onglet « Scan ».</li>
	<li>Attendez que le balayage est terminé et puis retirez la cassette d’imagerie de la station d’accueil.</li>
	<li>Enlever la plaque supérieure de la cassette et remettre l’animal dans la cage.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.1-3.12 pour le reste des animaux.</li>
</ol>4. image Analysis
<ol><li>Dans le logiciel imageur et analyseur, sélectionnez la fenêtre de l’onglet « analyse ».</li>
	<li>Charger le dataset et l’objet à analyser en cliquant sur le bouton « + » dans le Dataset « jury » de la fenêtre de l’onglet « analyse ».</li>
	<li>Une fois que l’image a été chargé dans la fenêtre de l’onglet « analyse », effectuez la région de l’analyse de l’intérêt (ROI) en sélectionnant l’icône ellipsoïde, située dans le coin supérieur gauche de la fenêtre de l’onglet « analyse ».</li>
	<li>Ajustez le seuil à zéro dans le panneau « données statistiques » par clic droit sur la colonne « seuil » dans la fenêtre de l’onglet « analyse ».</li>
	<li>La valeur totale du panneau « Données statistiques » représente le signal provenant des cellules de glioblastome fluorescent-étiquetées implantés dans le cerveau de souris.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.2-4.4 pour le reste des animaux. Charger ou supprimer un nouveau sujet en cliquant sur le « + » ou « − » bouton, respectivement, dans le Dataset « jury » de la fenêtre de l’onglet « analyse ». Remarque : Pour plus d’informations sur l’imagerie FMT et le fonctionnement de logiciels, voir20.
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Xénogreffes tumorales ont été largement utilisés dans la recherche sur le cancer et un certain nombre de techniques d’imagerie bien établis a été développé : BLI ; résonance magnétique imagerie (IRM) ; tomographie d’émission de positons (TEP), calculée (CT) ; FMT. Chacune de ces approches est livré avec les avantages et les inconvénients, mais finalement se complètent mutuellement avec le type de renseignements fournis. Un des plus couramment utilisés en vivo technologie d’imagerie est BLI5</su...

Le cancer est une des principales causes de décès par maladie chez l’homme dans le monde industrialisé. Avec un nombre extrêmement élevé de morts, les nouveaux traitements sont requis de toute urgence. Glioblastome multiforme (GBM) est un type extrêmement mortelle de cancer du cerveau, composé de populations hétérogènes tumeur stromale et immunitaire des cellules du cerveau. Selon le registre de tumeur de cerveau Central des Etats-Unis, l’incidence des tumeurs cérébrales malignes et bénignes primaires est environ 22 cas pour 100 000 habitants. Environ 11 000 nouveaux cas devraient être diagnostiqués aux Etats-Unis en 20171.
Les études précliniques enquêter sur la probabilité d’une drogue, procédure ou traitement efficace avant les essais chez l’homme. Parmi les premières étapes de laboratoire dans les études précliniques consiste à identifier des cibles moléculaires potentielles pour le traitement de la toxicomanie à l’aide de cellules cancéreuses implantées dans un organisme hôte, définis comme des modèles de xénogreffes humaines. Dans ce contexte, les modèles de xénogreffes de tumeurs intracrâniennes cerveau utilisant des xénogreffes dérivés de patient (PDXs) ont été largement utilisées pour étudier la biologie de tumeur de cerveau, progression, évolution et réponse thérapeutique et plus récemment pour le développement de biomarqueurs, de drogues dépistage et personnalisé médecine2,3,4.
Un des plus abordables et non invasif en vivo méthodes pour surveiller les xénogreffes intracrâniennes d’imagerie est bioluminescence d’imagerie (BLI)5,6,7,8. Toutefois, certaines limitations de BLI incluent administration de substrat et disponibilité, stabilité de l’enzyme et léger trempe et diffusion au cours de la formation image acquisition9. Nous rapportons ici le FMT infrarouge comme une alternative à l’imagerie méthode pour surveiller les modèles précliniques de glioblastome. Dans cette méthode, acquisition de signaux et quantification de données implantés PDXs, exprimant une protéine fluorescente proche infrarouge iRFP72010,11 (désormais appelé FP720) ou turboFP635 (désormais appelée FP635), est réalisée avec un FMT système d’imagerie. Utilisant la technologie FMT, l’orthotopic tumeurs peuvent être surveillés en vivo avant, pendant ou après le traitement, d’une manière non invasive, sans substrat et quantitative pour observations précliniques.

<table><tbody><tr><td>DMEM/Glycémie élevée&nbsp ;</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30022.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Technologies cellulaires innovantes</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>HyClone/GE</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>EGF recombinant humain&nbsp ;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2633</td><td></td></tr><tr><td>humain recombinant FGF</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2634</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-031-00</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1113903</td><td></td></tr><tr><td>p24 ELISA&nbsp ;</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Zoetis</td><td>NADA 043-403</td><td>Substance contrôlée</td></tr><tr><td>Pommade</td><td>Dechron</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Suture résorbable</td><td>CpMedical</td><td>VQ392</td><td></td></tr><tr><td>5 ul seringue</td><td>Hamilton</td><td>26200-U</td><td>Numéro de catalogue tel que vendu par Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Cell Sorter</td><td>Sony</td><td>SH8007</td><td></td></tr><tr><td>Souris cadre stéréotaxique&nbsp ;</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Injecteur stéréotaxique motorisé</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Perceuse à main à micromoteur</td><td>Foredom</td><td>K1070</td><td></td></tr><tr><td>Coussin chauffant pour souris&nbsp ;</td><td>Ken Scientific Corporation</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>Système de tomographie par fluorescence</td><td>PerkinElmer</td><td>FMT 2500 XL</td><td></td></tr><tr><td>TrueQuant Logiciel d’imagerie&nbsp ;</td><td>Perkin Elmer&nbsp ;</td><td></td><td></td>7005319</tr><tr><td>Ultra-centrifugeuse Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>392049</td><td></td></tr><tr><td>Culture tissulaire Boîtes 100mm Olympus</td><td>Plastics</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes 150mm Olympus</td><td>Plastics</td><td>25-203</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de culture tissulaire T75</td><td>Corning</td><td>430720U</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes coniques</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 15 mL</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Avanti J-20</td><td>Beckman Coulter</td><td>J320XP-IM-5</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Polypropylène, Paroi mince, 5,0 mL</td><td>Tube Beckman Coulter</td><td>326819</td><td></td></tr><tr><td>, Paroi mince, Polypropylène, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Souris nues athymiques</td><td>Charles River Laboratories</td><td>Code de souche&nbsp ; 490 (Homozygote)</td><td>Approbation préalable du Programme de soins aux animaux de l’établissement et du Comité de biosécurité de l’établissement. &nbsp ; &nbsp ;</td></tr></tbody></table>

fluorescence moléculaire tomographie pour l’imagerie in vivo des xénogreffes de glioblastome

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Tumorigénicité est la capacité des cellules cancéreuses pour former une tumeur masse. Une approche largement utilisée pour déterminer si les cellules sont tumorigènes est en injectant des souris immunodéficientes par voie sous-cutanée avec les cellules cancéreuses et de mesurer la masse de la tumeur, après qu’il devienne visible et palpable. Orthotopique injections de cellules cancéreuses visent à introduire la xénogreffe dans le microenvironnement qui ressemble le plus le tissu d’origine de la tumeur à l’étude. Recherche sur le cancer du cerveau nécessite une injection intracrânienne des cellules cancéreuses pour permettre la formation de tumeurs et d’analyse dans le microenvironnement unique du cerveau. L’imagerie in vivo des xénogreffes intracrâniennes surveille instantanément la masse de la tumeur de souris orthotopically greffée. Nous rapportons ici l’utilisation de la tomographie moléculaire de fluorescence (FMT) des xénogreffes de tumeurs de cerveau. Les cellules cancéreuses sont tout d’abord transduites avec près de protéines fluorescentes infrarouges et ensuite injectées dans le cerveau des souris immunodéficientes. Les animaux sont ensuite analysés pour obtenir des informations quantitatives sur la masse de la tumeur sur une longue période de temps. Cellule avant étiquetage permet de quantification rentable, fiable et reproductible de la charge tumorale au sein de chacune des souris. Nous avons éliminé la nécessité d’injecter des substrats d’imagerie et ainsi réduit le stress sur les animaux. Une limitation de cette approche est représentée par l’incapacité à détecter de très petites masses ; Toutefois, il a une meilleure résolution pour les plus grandes masses que les autres techniques. Il peut être appliqué afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement médicamenteux ou des altérations génétiques des lignées de cellules de gliome et échantillons dérivés de patient.

U87EGFRvIII de cellules de glioblastome (U87 cellules surexprimant la variante de récepteur de l’EGF III) ont été cultivés selon l’étape 1.2. Lentivirus a été produit et purifiée selon étape 1.1. La concentration virale était déterminée par p24 analyse ELISA. Les cellules étaient transduites avec lentivirus portant des protéines fluorescentes infrarouges selon étape 1.8. Le plasmide codant FP72010,11 a été aimablement fourni par D...

Orthotopique injection intracrânienne des cellules tumorales a été utilisée dans la recherche sur le cancer pour étudier la biologie de tumeur de cerveau, progression, évolution et réponse thérapeutique. Nous présentons ici la tomographie moléculaire de xénogreffes tumorales, à fluorescence qui fournit une imagerie intravitale en temps réel et la quantification d’une tumeur de masse dans des modèles précliniques de glioblastome.

Fluorescence moléculaire tomographie pour l’imagerie In Vivo des xénogreffes de glioblastome

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

L’objectif global de cette procédure expérimentale est d’établir un modèle préclinique d’imagerie des tumeurs cérébrales à l’aide de la tomographie moléculaire à fluorescence ou FMT. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la biologie des tumeurs cérébrales, de la recherche sur le cancer et de la découverte de médicaments sur l’agressivité tumorale, l’hétérogénéité et la réactivité au traitement. Le principal avantage de cette technique est que les tumeurs peuvent être surveillées in vivo avant, pendant ou après le traitement de manière non invasive, sans suture et quantitative.Un autre avantage de cette technique est la possibilité d’appliquer à d’autres types de modèles de xénogreffes implantés dans différents organes de l’animal. Commencez par ensemencer une fois 10 à la sixième cellules de glioblastome dans cinq millilitres de milieu dans une boîte de 10 centimètres pour une incubation de 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, transduisez les cellules avec le lentivirus, exprimant une protéine fluorescente d’intérêt appropriée à une multiplicité d’infection de cinq et retournez les cellules dans l’incubateur.Après 24 heures, remplacez le surnageant par cinq millilitres de milieu frais et incubez la culture pendant 48 heures supplémentaires. À la fin de l’incubation, remplacez le milieu par trois à cinq millilitres de tripson pendant 10 à 15 minutes à 37 degrés Celsius, suivi d’un pipetage minutieux pour dissocier complètement les cellules détachées. Collecter les cellules par centrifugation et remettre en suspension la pastille dans 500 microlitres de solution de tri.Divisez les cellules en un nombre approprié de tubes de fax et co-colorez les cellules avec du DAPI pour l’exclusion des cellules mortes. Ensuite, chargez les tubes sur le cytomètre en flux et triez les cellules vivantes en fonction de leur expression fluorescente dans un tube conique de 15 millilitres contenant une solution de tri fraîche. Après la centrifugation, remettez en suspension les cellules positives et négatives DAPI dans cinq millilitres de milieu de culture et ensemencez-les dans une nouvelle parabole de 10 centimètres pour leur culture à 37 degrés Celsius pendant 48 à 72 heures.À la fin de l’incubation, divisez les cellules pour l’ensemencement dans plusieurs boîtes pour des expériences in vivo ultérieures. Le jour de l’injection, dissocier les gliomes fluorescents positifs en une suspension unicellulaire et les remettre en suspension à une concentration de 0,5 ou une fois 10 à six cellules par deux à cinq microlitres de PBS par injection et par concentration animale dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre sur glace. Après avoir confirmé l’absence de réponse au pincement de l’orteil, appliquez une pommade sur les yeux de la souris immunodéficiente receveuse athymique nue et chargez une seringue Hamilton de cinq microlitres équipée d’une aiguille à pointe émoussée avec les cellules pour l’injection.Montez la seringue dans un porte-sonde et placez la souris dans un petit cadre stérotactique animal. Fixez la tête à l’aide des barres auriculaires et de l’adaptateur d’incisive et désinfectez la tête avec une solution d’éthanol à 70 % et de batadine. À l’aide d’un petit scalpel, faites une incision médiane et séparez la peau et les tissus conjonctifs.À l’aide du micromanipulateur, placez la seringue Hamilton sur le point de bregma et déplacez le porte-sonde d’un millimètre antéropostérieur et de deux millimètres latéralement du point de bregma. Après avoir marqué la position avec un crayon, utilisez une perceuse à main à micromoteur pour faire soigneusement un trou dans le crâne, en appliquant une légère pression vers le bas jusqu’à ce que les vaisseaux sanguins deviennent visibles. Introduisez l’aiguille dans le trou de la bavure à trois millimètres sous la surface piale et injectez les cellules à un débit d’un microlitre par minute à droite.Lorsque le volume complet de la cellule expérimentale a été injecté, retirez progressivement l’aiguille à une vitesse d’ascension d’un millimètre par minute et nettoyez le site d’injection avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, fermez la plaie cutanée selon les protocoles standard et surveillez l’animal sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli. Pour imager les cellules injectées, placez l’animal receveur anesthésié dans la cassette d’imagerie d’un imageur de tomographie moléculaire à fluorescence, l’adaptateur de tête d’abord en position couchée, la tête au centre de la cassette.Avec la cassette fermée, serrez les boutons de réglage à 17 millimètres. Lorsque l’animal est en sécurité, insérez la cassette dans la station d’accueil interne et ouvrez le logiciel de l’imageur et de l’analyseur. Dans la fenêtre de l’onglet expérimental, sélectionnez la base de données et le groupe d’étude appropriés, puis ouvrez la fenêtre de l’onglet de numérisation.Cliquez sur Sélectionner le sujet pour sélectionner le sujet à imager et sélectionnez le canal laser dans le panneau du canal laser. Cliquez sur Capture pour acquérir une image, puis cliquez et faites glisser ce champ de numérisation dans l’image capturée pour identifier les emplacements sources. Cochez l’option Ajouter à la reconstruction et cliquez sur Scanner dans la fenêtre de l’onglet Analyser.Une fois le balayage terminé, retirez la cassette d’imagerie de la station d’accueil et remettez l’animal dans sa cage sous surveillance jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement. Pour analyser les images, dans le logiciel d’imagerie et d’analyse, ouvrez la fenêtre de l’onglet Analyse et cliquez sur le bouton du signe plus dans le panneau de sélection de l’ensemble de données pour charger l’ensemble de données et le sujet à analyser. Utilisez ensuite l’icône ellipsoïde pour sélectionner la région qui vous intéresse et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la colonne de seuil pour ajuster le seuil à zéro dans le panneau des données statistiques.Les cellules de glioblastome marquées avec des protéines fluorescentes dans le proche infrarouge, comme nous venons de le démontrer, présentent des profils fluorescents distincts qui peuvent être distingués par tomographie moléculaire à fluorescence, même jusqu’à cinq jours après l’injection. De plus, l’absence de signal de fond entre les constructions facilite la double imagerie in vivo des populations de cellules cancéreuses d’intérêt. Dans cette expérience, des sphères de glioblastome marquées par fluorescence co-transduites avec des lentivirus codant pour SHRNA ciblant la protéine associée au domaine de la mort ont été injectées à des souris athymiques nude immunodéficientes receveuses, comme cela vient d’être démontré.La réaction en chaîne quantitative préliminaire de transcription inverse a confirmé l’efficacité du ciblage SHRNA dans les lignées cellulaires cancéreuses et la tomographie moléculaire à fluorescence a révélé une diminution du signal de fluorescence chez les souris greffées avec des sphères de glioblastome SHRNA par rapport aux animaux implantés avec des cellules transduites de contrôle SH. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des données précliniques pour la recherche sur le cancer du cerveau à l’aide d’un système de tomographie moléculaire à fluorescence.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Luciférase modifiée xénogreffes de tumeurs humaines du cerveau peut être établie par voie intracrânienne chez des souris athymiques, avec un suivi ultérieur de la croissance tumorale et la réponse au traitement en utilisant l'imagerie par bioluminescence. En combinaison avec une analyse de survie, de surveillance bioluminescence est un outil de recherche indispensable pour les essais pré-cliniques de thérapies envisagées pour le traitement des tumeurs cérébrales.

Établir intracrânienne xénogreffes tumorales du cerveau avec analyse ultérieure de la croissance tumorale et la réponse à la thérapie à l&#39;aide d&#39;imagerie par bioluminescence

L'implantation intracrânienne d'GL261 cellules en souris C57BL / 6 produit gliomes malins qui récapitulent plusieurs des caractéristiques de glioblastome humain. Nous avons utilisé des cellules exprimant de façon stable GL261 luciférase pour nous permettre...

Implantation intracrânienne avec 3D ultérieures In Vivo Bioluminescent imagerie des gliomes murin

Diffuse la tomographie par fluorescence offre une approche relativement peu coûteux et potentiellement à haut tout au long de...

Computed Tomography-guidée tomographie diffuse Time-Domain Fluorescence chez les petits animaux pour la localisation de biomarqueurs du cancer

Nous décrivons une méthode intégrée pour la précision, l'implantation stéréotaxique de cellules humaines de glioblastome multiforme dans le cerveau des souris nude et de série...

Implantation stéréotaxique intracrânienne et<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie bioluminescente de xénogreffes tumorales dans un système de modèle de souris de glioblastome multiforme

Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole permettant de modifier génétiquement les cellules de gliome pour exprimer la protéine de fluorescence infrarouge ou iRFP. Ces cellules de gliome marquées par fluorescence sont utiles dans l’imagerie des tissus profonds pour comprendre le développement des tumeurs cérébrales.

Marquage fluorescent des cellules de gliome : une méthode de transfection basée sur un vecteur lentiviral pour obtenir des cellules de gliome exprimant une protéine fluorescente pour l’imagerie des tissus profonds

Dans cette vidéo, nous décrivons la tomographie moléculaire par fluorescence ou FMT pour l’imagerie in vivo de xénogreffes de glioblastome marquées par des protéines fluorescentes dans des modèles murins. Cette technique est utile pour élucider les effets des thérapies antitumorales au niveau moléculaire.

Tomographie moléculaire à fluorescence : une technique d’imagerie pour l’imagerie in vivo de xénogreffes de glioblastome marquées par des protéines fluorescentes dans un modèle murin

Source : Clark, A.J., et al. Imagerie par bioluminescence d’un modèle animal immunocompétent pour le glioblastome. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo fait la démonstration de l’imagerie par bioluminescence pour suivre la progression du glioblastome dans un modèle murin immunocompétent, en utilisant des cellules tumorales exprimant la luciférase et la luciférine pour quantifier la croissance tumorale de manière non invasive.

Imagerie par bioluminescence d’un modèle murin immunocompétent pour le glioblastome

Nous avons établi un modèle de glioblastome orthotopique corticale chez la souris pour intravitale microscopie à deux photons qui récapitule les contraintes biophysiques normalement en jeu au cours de la croissance de la tumeur. Une fenêtre en verre chronique remplaçant le crâne au-dessus de la tumeur permet le suivi de la progression de la tumeur au cours du temps par microscopie à deux photons.

Un modèle de souris orthotopique glioblastome maintien contraintes physiques et parenchyme cérébral Convient pour intravitale deux microscopie biphotonique

Les cellules de gliome GL261 fournissent un modèle animal immunocompétent utile du glioblastome. Les objectifs de ce protocole sont de démontrer des techniques appropriées pour surveiller la croissance tumorale intracrânienne à l’aide de l’imagerie de bioluminescence in vivo, et de vérifier l’utilité des cellules GL261 modifiées par la luciférase pour l’étude de l’immunologie tumorale et des approches immunothérapeutiques pour le traitement du glioblastome.

Bioluminescence imagerie d&#39;un modèle animal pour immunocompétentes glioblastome

Ici nous utilisons bioluminescent, radiographie et tomographie par émission de positons/calculé tomographie imaging pour étudier comment inhiber l’activité mTOR impacts tumeurs myélome de la moelle osseuse-implanté dans un modèle de xénogreffe. Cela permet des analyses physiologiquement pertinents, non invasif et multimodales de l’effet anti-myélome de thérapies ciblant myélome de la moelle osseuse-greffée tumeurs in vivo.

Multimodal bioluminescentes et émission positronique tomographie/Computational imagerie par tomographie des xénogreffes de moelle osseuse de myélome Multiple chez les souris NOG

Nous présentons une nouvelle approche pour la microscopie à deux photons de l’administration tumorale de nanoparticules d’oxyde de fer marquées par fluorescence au glioblastome dans un modèle murin.

Microscopie intravitale à deux photons du glioblastome dans un modèle murin

Découvrez la tomographie moléculaire par fluorescence pour imager les xénogreffes de glioblastome in vivo. Cette méthode non invasive permet de surveiller quantitativement la progression tumorale et la réponse thérapeutique.

Fluorescence moléculaire tomographie pour l’imagerie In Vivo des xénogreffes de glioblastome

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