Name: Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Découvrez une méthode simple et économique pour isoler et purifier des cellules souches mésenchymateuses à partir du liquide synovial de lapin. Ce protocole utilise le tri cellulaire activé par magnétisme pour obtenir une population cellulaire pure.

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Cette étude a été financée par les subventions suivantes : la Fondation des sciences naturelles de Chine (no 81572198 ; No. 81772394) ; le Fonds pour la Construction de haute niveau Discipline médicale de l’Université de Shenzhen (n° 2016031638) ; la Fondation de recherche médicale de la Province de Guangdong, Chine (no. A2016314) ; et Shenzhen projets Science et technologie (no. JCYJ20170306092215436 ; Lol JCYJ20170412150609690 ; Lol JCYJ20170413161800287 ; Lol SGLH20161209105517753 ; Lol JCYJ20160301111338144).

Toutes les expériences sur des animaux ont été menées selon les directives d’éthique Comité régionales, et toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité Shenzhen deuxième populaire de l’hôpital, Université de Shenzhen.
1. isoler et Culture les rbSF-CSM
<ol><li>
Préparatifs de la procédure de l’animale
	<ol>
<li>Préparer le squelette-mature femme Nouvelle Zélande lapins blancs pour la collecte de rbSF-MSCs. effectuer un examen clinique des lapins un jour avant la procédure anesthésie et arthrocentèse. Remarque : les examens physiques devrait inclure poids (2,0 à 2,5 kg), sexe (féminin) et température corporelle, rythme respiratoire et cardiaque. Intervalles de paramètre pour les lapins cliniquement sains sont 30 à 50 min pour le taux de respiration, 220-280 min pour la fréquence cardiaque et 38-39 ° C pour la température du corps.</li>
		<li>Rapidement les animaux pendant 6 h avant l’anesthésie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparations et procédure pour l’anesthésie des animaux
	<ol>
<li>Retenir le lapin avec une cage (voir Table des matières) et ensuite injecter 3 % pentobarbital sodique dans la veine marginale oreille à une dose de 1 mL/kg pour l’anesthésie générale.</li>
		<li>Placer le lapin dans une position dorsale-position allongée confortable.</li>
		<li>Surveiller la fréquence respiratoire, fréquence cardiaque et la température corporelle du lapin pendant l’anesthésie.</li>
		<li>La pommade ophtalmologique sur ses yeux pour prévenir le dessèchement pendant l’anesthésie.</li>
		<li>Évaluer la profondeur de l’anesthésie après classification14 de Guedel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation pour MSCs isolement et culture
	<ol>
<li>Pour cultiver rbSF-MSCs, préparer 500 mL de milieu de culture commercial (voir Table des matières) additionné de 10 % commercial supplément (voir Table des matières), 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline-streptomycine.</li>
		<li>Incuber le milieu de culture à 37 ° C dans un bain d’eau.</li>
		<li>Préparer 500 mL d’une solution saline du tampon phosphate (PBS) pour l’isolation de cellules et le lavage de la cellule.</li>
		<li>Préparer 100 mL d’une solution saline isotonique pour la procédure d’arthrocentèse cavité du genou.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Collection d’uid ﬂ synovial articulaire du genou du lapin
	<ol>
<li>Sélectionnez une zone de 5 x 5 cm environ en taille autour du genou et se raser les poils de lapin de ce domaine à l’aide d’un rasoir électrique de sécurité.</li>
		<li>Vous pouvez également désinfecter le site de la procédure 3 x avec la povidone iode solution et 75 % d’éthanol. Après que la zone est complètement sèche, appliquer stérile drape.</li>
		<li>Injecter 1 à 2 mL de solution saline isotonique, à l’aide d’une seringue hypodermique stérile à (2 mL), dans la cavité articulaire du genou de l’espace articulaire latérale, déplacer le genou 3-4 x et puis aspirer tout le liquide synovial à température ambiante.</li>
		<li>Le liquide synovial filtrer sur un filtre de cellule en nylon à 40 µm pour enlever tous les débris dans les 4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Culture des rbSF-MSCs
	<ol>
<li>Recueillir le liquide filtré dans des tubes à centrifuger 50 mL et centrifuger à 1 500 tr/min pendant 10 min à température ambiante.</li>
		<li>Jeter le surnageant après la centrifugation, laver le culot avec du PBS, resuspendre le culot avec le milieu de culture complet et la plaque puis le milieu en boîtes de 100 mm.</li>
		<li>Incuber les boîtes à 37 ° C en atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2.</li>
		<li>Après 48 h, reconstituer les plats avec un milieu frais pour enlever toutes les cellules non adhérentes. Remplacer le milieu deux fois par semaine pendant 2 semaines comme passage 0 (P0). Remarque : Il devrait y avoir environ 1 x 104 cellules adhérentes. Cellules viables/ml en SF sont environ 2 x 102/ml.</li>
		<li>Après 14 jours après l’ensemencement initial, beaucoup de colonies si a formé dans les récipients de culture. Sélectionner les colonies plus de 2 mm de diamètre. Marquez l’endroit où se trouvent les colonies sélectionnées en traçant leur circonférence sur le fond du plat.</li>
		<li>Jeter les colonies < 2 mm de large, à l’aide de grattoirs à cellules. Digérer les colonies sélectionnés environ 5 µl de 0,25 % de trypsine, à l’aide d’un cylindre de clonage et transférer les colonies à un nouveau plat comme passage 1 (P1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soins post-opératoires des animaux
	<ol>
<li>Conformément aux procédures standard institutionnel d’exploitation pour la surveillance post-opératoire et de l’anesthésie.</li>
		<li>Surveiller les signes vitaux du lapin toutes les 10 min jusqu'à ce qu’il a repris connaissance. Enfin, transférer l’animal conscient à la cage. Ne retournez pas un lapin qui a subi une chirurgie à la compagnie des autres animaux jusqu'à ce qu’elle a entièrement récupéré.</li>
		<li>Après l’opération, désinfecter le site avec 0,1 % polyvidone iodée, 2 fois par jour pendant 3 jours.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CD90 séropositifs magnétique activé cellule Tri (CMA) du rbSF-MSCs et Culture primaire
<ol><li>
Préparation des échantillons
	<ol>
<li>Lorsque les cellules atteignent près de 80 % confluence, aspirer le milieu et puis ajoutez 1 à 2 mL de 0,25 % trypsine-EDTA à chaque plat.</li>
		<li>Incuber les plats pendant 2-3 min afin de permettre le détachement de la cellule.</li>
		<li>Une fois que les cellules sont détachent, ajouter une quantité égale de milieu de culture pour inactiver la trypsine.</li>
		<li>Passer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 40 µm, recueillir le filtrat dans un tube de 15 mL et ensuite filer vers le bas les cellules à 600 × g pendant 10 min à température ambiante.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans MACS tampon (PBS, pH 7,2, 0,5 % d’albumine sérique bovine et 2 mM EDTA) et ensuite compter le nombre de cellules.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Marquage magnétique NOTE : Trier les rbSF-CSM avec une cellule magnétique activé tri trousse contenant des colonnes, un stand et les séparateurs (voir Table des matières).<ol>
<li>Déterminer le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
		<li>Centrifuger la suspension de cellules à 300 × g pendant 10 min à 4 ° C. Totalement aspirer le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 80 µL de tampon de resuspension par 10 cellules total7 .</li>
		<li>Pour 10 cellules total7 , ajouter 20 µL de microbilles conjugué avec un anticorps monoclonal de CD90 anti-lapin.</li>
		<li>Mélanger les billes magnétiques et les cellules uniformément dans les tubes, puis les incuber à 4 ° C pendant 15 minutes dans l’obscurité.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de tampon par 107 cellules dans le tube et centrifuger à 300 × g pendant 10 min à 4 ° C pour laver les cellules. Jeter le surnageant après la centrifugation.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans 500 µL de tampon par 107 cellules.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Séparation magnétique
	<ol>
<li>Placer la colonne avec les ailes de la colonne vers l’avant dans le champ magnétique du séparateur magnétique.</li>
		<li>Rincer la colonne séparateur magnétique (MS) avec 500 µL de tampon par 107 cellules.</li>
		<li>Transférer la suspension de la cellule dans la colonne. Laisser les cellules négatives passent par le champ magnétique de se défaire de ces cellules sans étiquette.</li>
		<li>Laver la colonne x 1-2 avec 500 µL de tampon par 107 cellules et éliminer les intermédiaires.</li>
		<li>Transférer la colonne dans un tube à centrifuger (15 mL).</li>
		<li>Ajouter 1 mL de tampon par 107 cellules de la colonne et immédiatement pousser le piston dans la colonne afin d’éliminer les cellules magnétiquement étiquetées.</li>
		<li>Répétez la procédure ci-dessus avec un MS Column d’augmenter la pureté du CD90+ cellules, qui peuvent enrichir la fraction d’élution.</li>
		<li>Centrifuger la suspension de cellules à 300 × g pendant 10 min, aspirer le surnageant et remettre en suspension il au milieu de culture.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Culture de la CD90+ rbSF-MSCs
	<ol>
<li>Ensemencer les cellules en boîtes de 100 mm après le tri des cellules activées magnétique.</li>
		<li>Incuber les boîtes à 37 ° C dans un incubateur à cellules humidifié avec 5 % de CO2.</li>
		<li>Lorsque la confluence de 80 à 90 % de la culture primaire est obtenue, à environ 7-10 jours, digérer les cellules adhérentes avec 0,25 % de trypsine-EDTA et passage à une dilution de 1 / 2 pour faire le passage 2 (P2).</li>
		<li>Utiliser la même méthode pour passer les cellules au passage 3 (P3), qui peuvent être utilisés pour les tests in vitro . Remarque : Après la sous-culture et la purification, on obtient environ 1 x 107 rbSF-MSCs.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. identification des rbSF-MSCs
<ol><li>
Confirmation de marqueur de surface des rbSF-MSCs par cytométrie en flux
	<ol>
<li>Lorsque les MSCs sont confluents de 80 à 90 % à P3, laver les cellules avec du PBS et traitez-les avec 1 mL de 0,25 % trypsine-EDTA. Puis, incuber les MSCs à 37 ° C pendant 2-3 min jusqu'à ce que les cellules sont détachent.</li>
		<li>Récolter les cellules à l’aide de 10 mL de PBS, transférez-les dans un tube conique (15 mL) et les centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans 500 µL de PBS et transférer dans un tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Incuber une dilution au 1/100 de l’anticorps conjugué FITC et PE-conjugué (isotype, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) pendant 1 h dans l’obscurité à 4 ° C.</li>
		<li>Centrifuger ce mélange à 300 × g pendant 5 min à température ambiante et laver les cellules deux fois avec du PBS par centrifugation à 300 × g pendant 5 minutes chaque fois. Jeter le surnageant.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules de 500 µL de PBS, transférer la suspension de cellules dans un tube à fond rond (5 mL) et l’analyser à l’aide d’un cytomètre en flux. NOTE : Acquisition de données sur un cytomètre doté de deux canaux de fluorescence : 533/30 et 585/40. Pour chaque isotype de fluorescence, utilisez le contrôle de l’isotype d’ajuster la tension laser approprié et définir l’intensité minimale requise pour obtenir un histogramme de fluorescence qui affiche les bords gauche et droite du pic. Recueillir un minimum de 10 000 événements pour les analyses statistiques.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Multidifferentiation des rbSF-MSCs Remarque : Utilisation P3 rbSF-MSCs pour les dosages multidifferentiation in vitro .<ol>
<li>
Différenciation ostéogénique
		<ol>
<li>Préparer le milieu ostéogénique induction : DMEM basic (1 x) contenant de 50 mM de phosphate-2-acide L-ascorbique, 10 mM de le α-glycérophosphate et 100 nM de dexaméthasone.</li>
			<li>Les cellules à 103 cellules/cm2 dans une plaque de culture de tissu de 6 puits de semences et leur culture dans le milieu de l’induction ostéogénique.</li>
			<li>Changer le milieu inducteur tous les 3 jours pendant 3 semaines.</li>
			<li>Fixer les cellules avec 4 % de formaldéhyde pendant 30 min à température ambiante après la différenciation est terminée, en détachant les cellules avec le rouge d’alizarine 1 % pendant 5 min et puis lavez les 3 x avec PBS15.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Différenciation adipocytaire
		<ol>
<li>Préparer le milieu d’induction adipocytaire : DMEM basic (1 x), composé de 100 mM de l’indométhacine, 10 mg/mL de l’insuline humaine recombinante, 1 mM de la dexaméthasone et 0,5 mM de la 3-isobutyl-1-méthylxanthine.</li>
			<li>Traiter les P3 rbSF-CSM pendant trois semaines dans le milieu d’induction adipocytaire.</li>
			<li>Après 3 semaines, tacher les vacuoles de lipides neutres à l’aide de l’huile rouge O pour confirmer la différenciation adipocytaire. Fixer les cellules dans une solution de formaldéhyde de 4 % pendant 30 min à température ambiante et puis lavez-les 3 x avec PBS16.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Différenciation chondrogéniques
		<ol>
<li>Préparer le milieu d’induction chondrogéniques : DMEM basic (1 x) composé de 10 ng/mL de TGFβ1, 1 % de son supplément, 0,35 mM de L-proline, 100 nM de dexaméthasone, 50 mM de L-ascorbique acide-2-phosphate et 1 mM de pyruvate de sodium.</li>
			<li>Utiliser le pellet mise en culture pour l’induction chondrogéniques. Centrifuger 5 × 105 P3 rbSF-MSCs à 1500 tr/min pendant 10 min dans un tube en polypropylène (15 mL) pour former une boulette.</li>
			<li>Culture des granulés pendant 3 semaines avec le milieu d’induction chondrogéniques.</li>
			<li>Changer le support tous les 3 jours pendant 3 semaines.</li>
			<li>Après l’induction de 3 semaines, incorporer le culot cellulaire avec de la paraffine, section, il en tranches de 4 mm et détachant à l’aide de 0,1 % bleu de Toluidine pendant 30 min à température ambiante17.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extraction de l’ARN totale et analyse quantitative PCR en temps réel (qRT-PCR)
	<ol>
<li>Isoler l’ARN total des cellules après l’induction de la différenciation de 3 semaines en utilisant l’extraction de l’ARN commerciale nécessaire (voir la Table des matières).<ol>
<li>Enlever le milieu de culture dans la boîte de Petri et puis ajouter 1 mL de réactif de l’isolement.</li>
			<li>Lyse des cellules par pipetage répétées jusqu'à ce que la solution soit homogène. Il incuber à température ambiante pendant 3 min.</li>
			<li>Transvaser le lysat cellulaire dans un tube de microtubes de 1,5 mL.</li>
			<li>Ajouter 100 µL de chloroforme, secouez-le par main 15 x et incuber le mélange à température ambiante pendant 3 min.</li>
			<li>Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL.</li>
			<li>Ajouter 500 µL d’isopropanol et précipiter l’ARN pendant 10 min à température ambiante.</li>
			<li>Centrifuger à 12 000 × g minat 10 4 ° C. Le culot de RNA devrait être visible au fond du tube.</li>
			<li>Retirez le surnageant et puis ajouter 500 µL d’éthanol 75 %. Brièvement, faites tourner le tube pendant plusieurs secondes pour laver le culot de RNA. Il centrifuger à 7 500 × g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
			<li>Supprimer l’éthanol résiduel.</li>
			<li>Dissoudre le culot de RNA dans 10 µL d’eau DEPC et placer les tubes sur la glace.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Marche arrière transcrire l’ARN total en ADNc avec une synthèse de l’ADN nécessaire (voir la Table des matières). Remarque : Effectuez toutes les procédures suivantes sur la glace.<ol>
<li>Préparer le mélange maître de la transcriptase inverse.</li>
			<li>Ajouter 25 µL d’ARN DNase traités dans chaque tube avec 1 µg d’ARN.</li>
			<li>Incuber le mélange aux températures suivantes à l’aide d’un thermocycleur PCR : 26 ° C pendant 10 min (pour permettre les hexamères aléatoire de recuire), 42 ° C pendant 45 min (transcriptase inverse) et à 75 ° C pendant 10 min (inactiver la transcriptase inverse).</li>
			<li>Immédiatement analyser l’ADNc obtenu par quantitative PCR en temps réel, ou conserver à-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Effectuer l’analyse d’expression de gène avec un système de PCR quantitatif en temps réel.<ol>
<li>Utilisez qRT-PCR Master Mix (voir Table des matières) pour effectuer des PCR. Les amorces PCR pour GAPDH, Runx2, Agg et PPARγ sont énumérés au tableau 1.</li>
			<li>Calculer l’expression des gènes à l’aide de la méthodeΔΔCT 2−.</li>
			<li>Procéder à une analyse statistique en utilisant un logiciel de statistique standard. Un échantillon indépendant t-test permet de comparer les moyens du groupe.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

L’existence de MSCs dans le liquide synovial offre une alternative pour la thérapie cellulaire. Des études antérieures ont montré que les blessures sites contiennent des quantités plus élevées de cellules souches mésenchymateuses dans leur liquide synovial, qui peuvent être positivement corrélée avec la période post-traumatique5. Les MSCs dans le liquide synovial peuvent être bénéfiques au tissu pour améliorer la cicatrisation spontanée après une blessure18,<sup ...

MSCs ont été proposées comme une source précieuse pour la médecine régénérative, surtout pour les lésions du cartilage. MSCs, y compris les chondrocytes, ostéoblastes, adipocytes, myocytes squelettiques et viscérales cellules stromales, étendre largement les zones destinés à la transplantation de cellules souches en raison de leur forte expansion taux et lignées multiples différenciation possibles1. MSCs peuvent être isolés dans le squelette musculaire, membrane synoviale, la moelle osseuse et le tissu adipeux2,3,4. Résultats ont conﬁrmé aussi la présence de MSCs dans le liquide synovial, et des recherches antérieures a identifié MSCs de dérivés de liquide synoviales (SF-MSCs) comme candidats prometteurs pour régénération articulaire5,6.
Cependant, recherche et expérimentation préclinique sur échantillons humains sont soumis à nombreuses questions éthiques. Au lieu de cela, les lapins ont été et continuent d’être le plus couramment utilisé des espèces animales pour démontrer que la transplantation de MSCs peut réparer les lésions du cartilage. Ces dernières années, un nombre croissant de chercheurs ont étudié les cellules souches mésenchymateuses de lapin (rbMSCs) les deux in vitro et in vivo, que ces cellules sont semblables aux humains MSCs dans leur physiologie cellulaire de la biologie et de tissus. De même, les rbMSCs sont capables d’adhérer aux surfaces plastiques, affichant la morphologie de la broche-fibroblaste comme dans MSCs humaines. En outre, les échantillons mésenchymateuses lapin sont simples et faciles à obtenir7. En outre, les points cruciaux sont que rbMSCs expriment des marqueurs de surface, telles que CD44 CD90 et CD105, et que la différenciation des lignées multiples potentielle est préservée, ce qui est en accord avec les critères d’identification des populations de MSC comme défini par la société internationale de thérapie cellulaire8,9. En particulier, chondroprogenitors fluides synoviales sont capables de non-hypertrophique chondrogenèse lorsque induite par le TGF-β1, rendant les sources cellulaire appropriée pour le cartilage articulaire phénotypiquement régénération10,11, 12.
Toutefois, l’isolement de SF-MSCs est très différent des autres tissus, y compris le cordon ombilical, le tissu adipeux, sang périphérique et la moelle osseuse. Actuellement, les approches courantes pour la purification et le tri des SF-MSCs sont cytométrie en flux et immunomagnetic axée sur la perle tri, bien que la méthode de cytométrie de flux nécessite un environnement spécifique et très coûteux instruments13.
Cet article présente une procédure simple et peu invasive recueillir des échantillons de liquide synovial de Nouvelle Zélande lapins blancs. Au cours de la procédure, les rbSF-MSCs sont solidement développé in vitro et ensuite isolement avec CD90 positives procédures fondées sur les perles magnétiques. Enfin, le protocole montre comment obtenir les MSCs avec une grande pureté et de la viabilité dans les sources de cellules récoltées.
Dans le présent protocole, les rbSF-CSM isolées sont caractérisés basé sur leur morphologie, l’expression de marqueurs spécifiques et la pluripotence des cellules souches. Immunophénotypage axée sur la cytométrie de flux révèle une expression positive significative du CD44 et CD105, tandis que l’expression de CD45 et CD34 est négative. Enfin, un essai in vitro avec de rbSF-MSCs montre la différenciation ostéogénique, adipocytaire et chondrogéniques de ces cellules.

<table><tbody><tr><td><fort>réactifs</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 1703</td><td>Chaud en 37 &deg ; C bain-marie avant utilisation</td></tr><tr><td>MesenGro Supplement</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 M1512</td><td>Composant du milieu de culture MSCs</td></tr><tr><td>DMEM basic</td><td>Gibco Inc.</td><td>C11995500BT</td><td>Milieu de différenciation des CSM</td></tr><tr><td>Solution saline isotonique</td><td>Litai, Chine</td><td>5217080305</td><td>Réactif de procédure d’arthrocentèse de cavité</td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>PBS, sans Ca2+/Mg2+</td></tr>sérum <tr><td>de veau fœtal (FBS)</td><td>Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td>Composant du milieu de culture des CSM Solution de</td></tr><tr><td>povidone iodée</td><td>Guangdong, Chine</td><td>150605</td><td>Agent de stérilisation</td></tr><tr><td>75 %</td><td>éthanol Lircon, Chine</td><td>170917</td><td>Agent de stérilisation</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine/EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td>Réactif de dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>1 % Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td>Composant des CSM moyennes</td></tr><tr><td>MACS Running Buffer</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160112089</td><td>Contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 microbilles conjuguées d’anticorps mMEDTA</td></tr><tr><td>CD90</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160801456</td><td>Pour le tri cellulaire activé magnétique</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Composant des CSM chondrogéniques différenciation</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td>Composant de la différenciation ostéogénique des CSM</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td>354352</td><td>1 %, Composant de la différenciation chondrogénique des CSM</td></tr><tr><td>L-proline L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607</td><td>0,35 mM, Composant de la différenciation chondrogénique des CSM</td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique-2-phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 mM, Composant de la différenciation chondrogénique des CSM</td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-méthylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>0,5 mM, Composant de la différenciation adipogénique</td></tr><tr><td>Indométacine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 mM, Composant de la différenciation adipogénique</td></tr><tr><td>TGF&beta ; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL, Composant de la différenciation chondrogénique des CSM</td></tr><tr><td>&alpha ;-glycérophsphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6751</td><td>Composant de la différenciation ostéogénique des CSM</td></tr><tr><td>Anticorps polyclonal CD34, FITC Bioss conjugué</td><td></td><td>bs-0646R-FITC</td><td>Marqueur de cellules souches hématopoïétiques</td></tr><tr><td>Souris antilapin CD44</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA806GA</td><td>Thy-1 membrane glycoprotéine (marqueur MSC)</td></tr><tr><td>CD45 (anticorps monoclonal)</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA808GA</td><td>Marqueur de cellules souches hématopoïétiques</td></tr><tr><td>Anticorps CD105 Marqueur</td><td>Genetex</td><td>GTX11415</td><td>MSCs</td></tr><tr><td>Alcool isopropylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030</td><td>Précipite l’extraction de l’ARN phases organiques</td></tr><tr><td>Trichlorométhane</td><td>Wenge, Chine</td><td>61553</td><td>Extrait de l’ARN total</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>Isolat d’ARN total</td></tr><tr><td>SYBR green master mix</td><td>Takara Bio, Japon</td><td>RR420A</td><td>Test PCR</td></tr><tr><td>kit de synthèse d’ADNc</td><td>Takara Bio, Japon</td><td>RR047A</td><td>Retranscrit à l’ADN complémentaire</td></tr><tr><td>Rouge Alizarine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td>Coloration des composés calciques</td></tr><tr><td>Bleu de toluidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td>Coloration des tissus cartilagineux</td></tr> Solution <tr><td>d’huile Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391L</td><td>Coloration des vacuoles lipidiques</td></tr> <tr><td><fort>Équipement</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Séparateur MiniMACS</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-102</td><td>Pour le tri cellulaire activé magnétique</td></tr><tr><td>MultiStand</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-303</td><td>Pour le tri cellulaire activé magnétique</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-201</td><td>Pour le tri cellulaire activé magnétique</td></tr><tr><td>Crépine de cellule</td><td>FALCON Inc.</td><td>352340</td><td>40 &mu ; Hémocytomètre en nylon ISOLAB</td></tr><tr><td></td><td>Inc.</td><td>075.03.001</td><td>Comptage de cellules</td></tr><tr><td>Falcon Antenne de 100 mm Boîte</td><td>de</td><td>culture cellulaire</td><td>Corning</td> 353003</tr><tr><td>Tube de microcentrifugation</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Extraction d’ARN et PCR</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91050</td><td>Centrifugeuse</td></tr><tr><td>à grande vitesse</td> stérilisée aux rayons gamma <td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Cellules de centrifugation</td></tr><tr><td>Cellule à dioxyde de carbone incubateur</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>PCR en temps réel Instrument</td><td>Life Tech</td><td>QuantStudio Réaction</td><td>en chaîne de la polymérase quantitative en temps réel</td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>Analyseur de cellules</td></tr><tr><td>Pipettor</td><td>Eppendorf</td><td>O25456F</td><td>Transfert du liquide</td></tr><tr><td>Cylindre de clonage</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3983-50EA</td><td>Isoler et prélever des colonies cellulaires individuelles</td></tr><tr><td>Seringue hypodermique stérile</td><td>Double-Dove, Chine</td><td>131010</td><td>Procédure d’arthrocentèse</td></tr><tr><td>Cage à lapin</td><td>Zhike, Chine</td><td>ZC-TGD</td><td>Retenir le lapin</td></tr></tbody></table>

cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont la source principale de cellule pour la thérapie cellulaire. MSCs du fluide synovial de la cavité articulaire susceptibles de servir pour l’ingénierie tissulaire du cartilage. MSCs de liquide synovial (SF-MSCs) ont été considérés comme des candidats prometteurs pour la régénération articulaire, et leur bénéfice thérapeutique potentiel a fait d’eux un sujet de recherche importants de la fin. SF-MSCs de la cavité du genou les lapins blancs de Nouvelle-Zélande peuvent être utilisés comme un modèle optimisé translationnel afin d’évaluer la médecine régénérative humaine. Au moyen de base CD90 cell activé magnétique tri technologies (MACS), ce protocole avec succès obtient lapin SF-MSCs (rbSF-MSCs) de ce modèle de lapin et plus pleinement montre le phénotype de la maîtrise de ces cellules par incitant à faire la différence à ostéoblastes, les adipocytes et les chondrocytes. Par conséquent, cette approche peut être appliquée dans la recherche en biologie cellulaire et ingénierie tissulaire en utilisant des procédures et des équipements simples.

Isolement, Purification et la Culture des rbSF-MSCs : Ce protocole utilise des MACS d’isoler rbSF-MSCs, basés sur l’expression du marqueur de surface MSC CD90. Un diagramme de flux de processus d’isolement des rbSF-MSCs, purification et la caractérisation et le protocole de culture in vitro est illustré à la Figure 1.
Morphologie des cellules après des cellules a...

Cet article présente un protocole simple et économique pour la simple isolation et la purification de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial de Nouvelle-Zélande lapin blanc.

Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le protocole de tri dans le domaine des cellules souches en fournissant une procédure de purification des cellules souches mésenchymateuses directement à partir du liquide synovial. Le principal avantage de cette technique est que nous avons établi un protocole simple et économique pour l’isolement et la purification du MACS à partir du liquide synovial de lapin. Généralement dans la recherche, grâce à cette méthode, nous faisons de grands efforts, car la pluation de la population cellulaire dépend de la production d’une suspension unicellulaire.Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons remarqué que seule la méthode de tri cellulaire activée par magnétisme est actuellement approuvée par la FDA pour des applications cliniques. Commencez cette procédure par une anesthésie animale comme décrit dans le protocole textuel. Pour effectuer le prélèvement de liquide synovial articulaire sur le genou du lapin, sélectionnez une zone d’environ cinq centimètres sur cinq centimètres autour du genou.Rasez les poils de lapin autour de cette zone à l’aide d’un rasoir électrique de sécurité. Alternativ

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Rat MSC ont été isolés à partir des fémurs et tibias et ensuite enrichi par tri cellulaire magnétique. Cellules triées ont été confirmés pour l'expression des marqueurs de surface par cytométrie en flux. Ces cellules ont également été cultivées à une densité clonale pour former des colonies isolées et ensuite ces colonies ont été séparés par des cylindres de clonage.

L&#39;isolement et l&#39;enrichissement des cellules de rat souches mésenchymateuses (CSM) et de séparation des mono-colonie Dérivé MSC

Une technique expérimentale pour le traitement de défauts ostéochondraux dans l'articulation du genou du lapin est décrite. L'implantation de cellules souches mésenchymateuses allogéniques dans des défauts ostéochondraux offre un développement prometteur dans le domaine de l'ingénierie tissulaire. La préparation de la fibrine cellule...

Traitement des défauts ostéochondraux à genou la commune du lapin par implantation de cellules allogéniques souches mésenchymateuses dans caillots de fibrine

Ce protocole décrit une technique d'isolation pour obtenir des cellules mésenchymateuses du stroma de séjour du poumon primaires de rats, par l'utilisation d'une digestion enzymatique, séparation par gradient de densité, l'adhérence plastique et CD146 + sélection de billes magnétiques.

Isolement de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Cellules Resident pulmonaire mésenchymateuses stromales de Rat Poumons

Nous présentons les techniques nécessaires pour isoler la fraction vasculaire stromale (SVF) des dépôts de tissu adipeux inguinal (sous-cutané) et périgonadique (viscéral) de souris afin d’évaluer leur expression génique et leur activité collagénolytique. Cette méthode comprend l’enrichissement de cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC)Sca1 à haute teneur en utilisant la séparation cellulaire immunomagnétique.

Séparation immunomagnétique de Sca1 Fat Depot spécifique<sup&gt; haute</sup&gt; Cellules souches adipeuses (CSA)

Un protocole établissant des cellules souches mésenchymateuses (CSM) isolées du liquide synovial et de la moelle osseuse de miniporcs et collectées de manière non invasive par aspiration à la seringue est présenté. Le phénotypage cellulaire a été effectué à l’aide de la cytométrie en flux après isolement cellulaire et culture in vitro de la moelle osseuse et de liquides synoviaux dérivés de CSM.

Isolement cellulaire et phénotypage des cellules souches mésenchymateuses dérivées de liquide synovial et de moelle osseuse de Minipigs

Chondrogenèse de cellules souches nécessite un réglage fin des conditions de culture. Nous présentons ici une approche magnétique pour les cellules de condensation, une étape essentielle pour initier chondrogenèse. De plus, nous montrons que la maturation dynamique dans un bioréacteur applique une stimulation mécanique aux constructions cellulaires et améliore la production de la matrice extracellulaire cartilagineuse.

L&#39;agrégation magnétique de cellules souches 3D et bioréacteurs Maturation pour Cartilage régénération

Ici, nous présentons un protocole pour produire un grand nombre d’exosomes de qualité GMP à partir de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial à l’aide d’un bioréacteur 3D.

Préparation à grande échelle d’exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial par culture de bioréacteur 3D

La présente étude fournit un protocole modifié pour isoler les macrophages synoviaux et les fibroblastes du tissu arthritique inflammatoire murin.

Isolement et culture de macrophages synoviaux primaires et de fibroblastes à partir de tissus arthritiques murins

Cette étude a permis d’établir une méthode stable et efficace pour l’isolement, la culture et la détermination fonctionnelle des cellules souches CD34+ résidentes de la paroi vasculaire (CD34+ VW-SC). Cette méthode d’isolement facile à suivre et rapide peut être utilisée par d’autres chercheurs pour étudier les mécanismes potentiels impliqués dans les maladies cardiovasculaires.

Isolement immunomagnétique des cellules souches CD34+ résidentes de la paroi vasculaire chez la souris

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de la mâchoire ont des fonctions importantes dans la différenciation, l’auto-renouvellement et la modulation immunitaire. Ils sont devenus un réservoir crucial de cellules précurseurs en thérapie génique, en ingénierie tissulaire et en médecine régénérative. Ici, nous présentons une méthode unique pour isoler les cellules souches mésenchymateuses de la mâchoire et de la moelle osseuse chez le rat.

Technique d’isolement et de culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat

Ce protocole décrit une méthode de tri à base de billes magnétiques utilisant des anticorps de cytométrie de flux marqués par la phycoérythrine (PE) et des microperles anti-PE pour isoler des sous-populations spécifiques de cellules souches mésenchymateuses présentant une forte positivité des marqueurs cibles postsort et une prolifération / activité métabolique basée sur CCK-8 préservée dans les conditions testées, sans nécessiter de trieurs cellulaires coûteux ni de billes personnalisées...

Isolement et validation des sous-populations de cellules souches mésenchymateuses positives à la podoplanine à l’aide d’une stratégie indirecte de billes magnétiques

Découvrez une méthode simple et économique pour isoler et purifier des cellules souches mésenchymateuses à partir du liquide synovial de lapin. Ce protocole utilise le tri cellulaire activé par magnétisme pour obtenir une population cellulaire pure.

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Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

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