Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le protocole de tri dans le domaine des cellules souches en fournissant une procédure de purification des cellules souches mésenchymateuses directement à partir du liquide synovial. Le principal avantage de cette technique est que nous avons établi un protocole simple et économique pour l’isolement et la purification du MACS à partir du liquide synovial de lapin. Généralement dans la recherche, grâce à cette méthode, nous faisons de grands efforts, car la pluation de la population cellulaire dépend de la production d’une suspension unicellulaire.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons remarqué que seule la méthode de tri cellulaire activée par magnétisme est actuellement approuvée par la FDA pour des applications cliniques. Commencez cette procédure par une anesthésie animale comme décrit dans le protocole textuel. Pour effectuer le prélèvement de liquide synovial articulaire sur le genou du lapin, sélectionnez une zone d’environ cinq centimètres sur cinq centimètres autour du genou.

Rasez les poils de lapin autour de cette zone à l’aide d’un rasoir électrique de sécurité. Alternativement, désinfectez le site de la procédure avec une solution de povidone iodée et de l’éthanol à 75 % trois fois. Ensuite, appliquez des champs stériles une fois que la zone a complètement séché.

À l’aide d’une seringue hypodermique stérile, injectez un à deux millilitres de solution saline isotonique dans la cavité articulaire du genou à partir de l’espace articulaire latéral. Bougez le genou trois à quatre fois, puis aspirez tout le liquide synovial à température ambiante. Filtrez le liquide synovial à travers une crépine en nylon de 40 microns pour éliminer tous les débris, dans les quatre heures.

Pour cultiver les SF-MSC de lapin, collectez le liquide filtré dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres et centrifugez à 1 500 tr/min pendant dix minutes à température ambiante. Jetez le surnageant après la centrifugation et lavez le granulé avec du PBS. Après avoir remis en suspension le granulé avec le milieu de culture complet, plaquez le milieu dans des plats de 100 millilitres.

Incuber les plats à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de dioxyde de carbone. Après 48 heures, remplissez la vaisselle avec du milieu frais pour éliminer toutes les cellules non adhérentes. Remplacez le fluide deux fois par semaine pendant deux semaines comme passage zéro.

Après 14 jours après le placage initial, de nombreuses colonies devraient s’être formées dans les plats de culture. Sélectionnez les colonies de plus de deux millimètres de diamètre. Marquez l’emplacement des colonies sélectionnées en traçant leur circonférence sur le fond de la parabole.

Jetez les colonies de moins de deux millimètres de large à l’aide de grattoirs cellulaires. Digérez les colonies sélectionnées avec environ cinq microlitres de trypsine à 0,25 % à l’aide d’un cylindre de clonage, et transférez les colonies dans une nouvelle boîte pour le passage. Lorsque les cellules atteignent environ 80 % de confluence, aspirez le milieu.

Ensuite, ajoutez un à deux millilitres de 0,25 % de trypsine EDTA dans chaque plat. Incuber les plats pendant deux à trois minutes pour permettre le détachement des cellules. Une fois les cellules détachées, ajoutez une quantité égale de milieu de culture pour inactiver la trypsine.

Faites passer la suspension cellulaire dans une crépine de 40 microns et collectez le filtrat dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, faites tourner les cellules à 600 fois G pendant dix minutes à température ambiante. Remettez en suspension la pastille de cellule dans la mémoire tampon MACS.

Pour effectuer un marquage magnétique, déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifugez la suspension cellulaire à 300 fois G pendant dix minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir complètement aspiré le surnageant, ajoutez 80 microlitres de tampon de remise en suspension pour dix millions de cellules au total.

Pour dix millions de cellules au total, ajoutez 20 microlitres de microbilles conjuguées à un anticorps monoclonal anti-lapin CD90. Mélangez les billes magnétiques et les cellules uniformément dans les tubes. Ensuite, incubez-les à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes dans l’obscurité.

Ajoutez un millilitre de tampon pour dix millions de cellules dans le tube, puis centrifugez à 300 fois G pendant dix minutes à quatre degrés Celsius, pour laver les cellules. Jeter le surnageant après la centrifugation. Remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon pour dix millions de cellules.

Placez la colonne, avec les ailes de la colonne vers l’avant, dans le champ magnétique du séparateur magnétique. Rincez la colonne de séparation magnétique avec 500 microlitres de tampon pour dix millions de cellules. Transférez la suspension à cellule unique dans la colonne.

Laissez les cellules négatives passer à travers le champ magnétique pour éliminer ces cellules non marquées. Lavez la colonne une à deux fois avec 500 microlitres de tampon pour dix millions de cellules, et jetez le flux. Transférez la colonne dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.

Ajoutez un millilitre de tampon pour dix millions de cellules à la colonne. Ensuite, enfoncez immédiatement le piston dans la colonne, pour évacuer les cellules marquées magnétiquement. Répétez la procédure susmentionnée avec une deuxième colonne de séparateur magnétique, pour augmenter la pureté des cellules CD90-positives, qui peuvent enrichir la fraction éluée.

Après avoir centrifuger la suspension cellulaire à 300 fois G pendant dix minutes, aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille avec le milieu de culture. Inoculez les cellules dans des boîtes de 100 millilitres après le tri cellulaire activé par magnétisme. Incuber les plats à 37 degrés Celsius dans un incubateur à cellules humidifiées avec 5 % de dioxyde de carbone.

Lorsque la confluence de 80 à 90 % de la culture primaire est atteinte, après environ sept à dix jours, digérez les cellules adhérentes avec 0,25 % de trypsine EDTA et faites-les passer à une dilution d’un à deux pour faire le passage deux. Utilisez la même méthode pour faire passer les cellules au passage trois, qui peut être utilisé pour les essais in vitro. On voit ici la morphologie des SF-MSC de lapin d’élevage monocouche avant et après MACS, sous un microscope inversé.

Avant le tri, les populations de cellules de liquide synovial de lapin adhérentes présentent une hétérogénéité. Ils contiennent divers types et tailles de cellules telles que la morphologie ovale, longue, courte et étoilée. La morphologie principale du passage deux et du passage six est une morphologie fuseau.

Suivant MACS avec CD90, les populations cellulaires présentent une morphologie homogène. Avec la sous-culture, le nombre de cellules augmente. L’analyse par cytométrie en flux a démontré que les cellules SF-MSC de lapin étaient positives pour les marqueurs MSC CD44 et CD105.

Bien que négatif pour le marqueur de cellule endothéliale CD34 et pour le marqueur de cellule hématopoïétique CD45. Les résultats ont montré qu’avant le MACS, la population de SF-MSC de lapin était composée d’environ 40 % de cellules MSC. Après MACS, la population enrichie contenait plus de 99 % de cellules MSC.

L’analyse par cytométrie en flux du marqueur CD90-positif avant et après le tri MAC est illustrée. La coloration au rouge d’alizarine a démontré que les nodules minéralisés se formaient sous induction ostéogénique pendant trois semaines. Après trois semaines d’induction adipogénique, l’accumulation de vacuoles riches en lipides a été détectée par coloration intracellulaire Oil Red O.

Après trois semaines d’induction chondrogénique, la pastille cellulaire a été dosée histologiquement avec une coloration au bleu de toluidine. Le protéoglycane acide positif caractérisait les cellules de type chondrocytes. Après trois semaines d’induction, l’expression relative de l’ARNm du marqueur ostéoblastique, du marqueur adipogène et du marqueur chondrogénique a été détectée.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux à quatre heures. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l’isolement simple et de la purification des cellules souches mésenchymateuses à partir du liquide synovial de lapin blanc de Nouvelle-Zélande. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de sélectionner les colonies de plus de deux millilitres de diamètre.

Produisez également une suspension unicellulaire avant le tri immunomagnétique, car les cellules indésirables attachées à une cellule marquée resteront sur la bille magnétique. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que le tri cellulaire activé par fluorescence peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires portant sur l’innocuité et l’efficacité de la purification des cellules souches mésenchymateuses. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération du cartilage articulaire pour explorer les cellules CD idéales dans la réparation du cartilage articulaire.

N’oubliez pas que les opérations ont été effectuées sur un banc de refroidissement de l’arche et que des précautions telles que des gants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure. Les implications de cette technique s’étendent au traitement des lésions du cartilage articulaire, car les MASC dérivées du liquide synovial sont des candidats prometteurs pour la régénération du cartilage articulaire.