Utilisation des anticorps Anti-phospho-girdin pour visualiser la touffe Intestinal cellules de souris flottante jéjunum Cryosections

L’objectif global de cette procédure de coloration est de visualiser les cellules de touffe dans les cryosections de jéjunum de souris. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la gastro-entérologie, telles que la façon dont la prolifération des cellules de touffe se produit dans l’intestin des mammifères lors d’une infection parasitaire. Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs ayant une expérience histologique limitée peuvent obtenir des images de cellules de touffes de haute qualité.

Commencez par exposer les organes pelviens d’un cadavre de souris fraîchement fixé avec du formol. Coupez l’extrémité du rectum de l’anus et séparez les intestins du corps en coupant le mésentère. Pour isoler le jéjunum, coupez les intestins à quatre centimètres de la face anale de l’antre gastrique et jetez la moitié anale de l’intestin grêle restant.

Coupez le jéjunum en deux pour faciliter la procédure de rinçage. Chargez 20 millilitres de solution de formol neutre tamponnée à 10 % dans une seringue de 20 millilitres et fixez une aiguille droite de calibre 18 avec le biseau retiré. Ensuite, injectez une solution de formol neutre tamponnée à 10 % à partir d’une extrémité du jéjunum coupé pour éliminer le contenu intestinal et fixer la surface de la lumière intestinale.

Lavez la lumière intestinale en injectant du PBS. Ensuite, rincez avec une solution de gélatine liquide pour remplacer le PBS. Fermez une extrémité du jéjunum coupé par ligature de suture, à l’aide d’une suture coupée en nylon 6-0.

Remplissez le jéjunum de gélatine liquide et fermez l’extrémité opposée par ligature de suture. Ensuite, faites quatre nœuds de suture sur la longueur du jéjunum. Faites tremper les mouchoirs dans 50 millilitres de saccharose à 15 % dans une solution de formol neutre tamponnée à 10 % pendant la nuit, à 4 degrés Celsius.

Le lendemain, coupez le jéjunum au niveau des nœuds de suture pour obtenir trois morceaux de jéjunem en forme de saucisse avec les deux extrémités ligaturées. Alignez les pièces dans un cryomoule, puis recouvrez d’un composé d’enrobage. Congelez en un clin d’œil le cryomoule dans de l’isopentane refroidi à l’azote liquide.

Pour préparer des sections de jéjunum, commencez par régler la température de la chambre du cryostat et la température de l’objet à moins 22 degrés Celsius. Placez le bloc de tissu congelé dans un cryomoule dans la chambre du cryostat pendant au moins 15 minutes. Au bout de 15 minutes, coupez le bloc en deux avec une lame de rasoir pour exposer la section transversale du jéjunum.

Montez la moitié du bloc sur un adaptateur de cryostat. Sectionnez le jéjunum rempli de gélatine en sections de 30 microns d’épaisseur. À l’aide d’une pince congelée, transférez délicatement les sections dans une boîte de culture de 35 millimètres contenant 3 millilitres de PBS.

Après avoir lavé les sections trois fois pendant cinq minutes chacune avec 3 millilitres de PBS-T, ajoutez 3 millilitres de solution de récupération d’antigène fraîchement préparée dans la boîte contenant les sections flottantes. Ensuite, fermez le couvercle, scellez l’espace entre le plat et le couvercle avec une bande de ruban adhésif en vinyle, et incubez à 50 degrés Celsius dans un incubateur d’hybridation pendant trois heures, sans secouer. Après l’immuno-coloration, transférez la boîte de coupes colorées dans le PBS dans un microscope stéréoscopique.

Placez 200 microlitres de PBS dans une gouttelette au centre d’une lame de verre blanc codée MAS. Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette P200, vous pouvez transférer une section de jéjunum de la boîte dans la gouttelette. Après avoir ajusté l’alignement de la section, aspirez tout le PBS restant autour de la section.

Ajoutez 20 microlitres de support de montage aqueux et placez une lamelle sur le support. Scellez immédiatement les bords de la lamelle avec un support de montage à base de xylène et laissez sécher pendant deux à trois heures avant de commencer la microscopie confocale. Le remplissage en gélatine du jéjunum préserve la forme du disque rond et maintient le positionnement droit des villosités.

En l’absence de remplissage à la gélatine, les sections jéjunales ont tendance à se plier, ce qui permet aux villosités de basculer vers l’arrière. pY1798 délimite de manière reproductible des cellules de touffe entières, y compris la membrane, le cytoplasme du soma en forme de bobine et l’extrémité luminale fortement colorée, où la condensation robuste du signal correspond à la touffe saillante d’une cellule de touffe. La phalloïdine a une grande affinité pour l’actine filamenteuse, qui est présente dans les microvillosités qui forment la bordure de la brosse intestinale.

La phalloïdine marque de manière reproductible et proéminente le bord épaissi du pinceau qui correspond à une masse de radicelles s’étendant de la touffe. La co-localisation cohérente des signaux pY1798 avec la bordure en brosse fortement épaissie et positive à la phalloïdine démontre que ce protocole identifie avec succès les cellules de la touffe, qu’elles soient situées sur une villosité ou dans une crypte. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est correctement exécutée.

La combinaison de gélatine à faible point d’émission, de cryosections flottantes et de récupération d’antigènes à basse température peut être appliquée pour l’immuno-coloration d’autres tissus du projet.