Quantification de la croissance à l’intérieur de Macrophages intracellulaire est un rapide et une méthode fiable pour évaluer la Virulence de Leishmania

L’objectif général de cette expérience est d’évaluer la virulence de diverses souches de Leishmania par l’infection in vitro de macrophages murins dérivés de la moelle osseuse, et la quantification ultérieure de la cinétique de croissance intracellulaire du parasite. Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés sur les facteurs du macrophage de l’hôte et de l’agent pathogène qui déterminent la virulence des parasites infectieux Leishmania. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode rapide, économique et fiable qui nécessite beaucoup moins d’animaux, par rapport aux études in vivo.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement de la leishmaniose, car elle peut être utilisée pour évaluer l’infectiosité des souches mutées de Leishmania, ou l’efficacité des composés thérapeutiques. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes d’isolement des macrophages dérivés de la moelle osseuse et de quantification du parasite intracellulaire sont difficiles à apprendre à partir de protocoles écrits seuls. Commencez par fixer une souris femelle de quatre à six semaines à une planche de dissection et désinfectez l’animal avec de l’éthanol à 70 %.

Utilisez des ciseaux pour faire une incision d’un centimètre près d’une articulation de la hanche et coupez la peau tout autour de l’articulation. Tirez la peau de la jambe vers la cheville pour déganter soigneusement le membre, et coupez le pied au niveau ou en dessous de l’articulation de la cheville pour laisser le tibia intact. Pour localiser l’articulation de la hanche, manipulez le fémur pour identifier le point de rotation et utilisez les ciseaux pour sectionner la jambe au-dessus de l’articulation de la hanche, en laissant la tête proximale du fémur intacte.

Retirez autant de muscle et de tissu conjonctif que possible de la jambe et placez les os nettoyés dans une boîte de Pétri contenant un IPRP stérile complété par des antibiotiques sur de la glace. Après avoir prélevé la deuxième série d’os de la jambe, utilisez des pinces stérilisées et une lame numéro dix pour retirer tout muscle et tissu conjonctif restants. Transférez les os nettoyés dans un couvercle de boîte de Pétri vide et utilisez le scalpel pour retirer les deux extrémités de chaque tibia afin d’accéder à la moelle.

À l’aide d’une pince, placez un tibia sur l’embouchure d’un tube conique de 50 millilitres sur de la glace et insérez la pointe d’une aiguille de calibre 25 attachée à une seringue de 10 millilitres remplie de milieux complétés par des antibiotiques à une extrémité du tibia. Rincez environ cinq à 10 millilitres de milieu à travers l’os dans le tube conique jusqu’à ce que tout le tissu rouge de la moelle osseuse ait été prélevé et que l’os apparaisse blanc. Lorsque toute la moelle osseuse a été prélevée, centrifugez la moelle osseuse regroupée et suspendez à nouveau la palette de cellules de la moelle osseuse dans cinq millilitres de milieu de macrophage dérivé de la moelle osseuse.

Transférez la suspension de cellules de moelle osseuse dans un flacon de culture cellulaire de 175 centimètres carrés contenant 60 millilitres de milieu de macrophage stérile dérivé de la moelle osseuse, et rincez le tube deux fois avec le milieu du ballon de culture pour assurer une récupération cellulaire maximale. Après le deuxième lavage, transférez une aliquote de 30 millilitres de cellules dans une deuxième fiole de culture cellulaire de 175 centimètres carrés et fermez chaque fiole avec un capuchon filtrant. Ensuite, incubez les deux cultures pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour permettre de séparer les macrophages résidents de tout fibroblaste contaminant ou d’autres cellules adhérentes.

Le lendemain matin, transférez 10 millilitres de surnageant indifférencié contenant des cellules de moelle osseuse de chaque flacon dans des boîtes de Pétri en polystyrène non traitées de 100 x 15 millimètres traitées pour culture tissulaire, et retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux à trois jours supplémentaires. Ensuite, nourrissez les cultures avec cinq millilitres de milieu de macrophage frais dérivé de la moelle osseuse à 37 degrés Celsius par plat et remettez les plaques dans l’incubateur. Le septième ou le huitième jour après la culture, utilisez une pointe d’aspiration fixée à une conduite de vide pour transférer quatre lamelles de verre de 12 millimètres stérilisées en autoclave au fond de chaque puits d’une plaque de culture à six puits sans les chevaucher.

Préparez des plaques identiques pour chaque point temporel de l’expérience. Ensuite, lavez les cultures de macrophages dérivées de la moelle osseuse deux fois avec du PBS frais à 37 degrés Celsius et cinq millilitres de PBS sans calcium ni magnésium complétés par un EDTA millimolaire dans chaque plaque. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, regroupez les cellules détachées dans un tube conique de 50 millilitres, en rinçant chaque plaque deux fois avec cinq millilitres supplémentaires de PBS sans calcium ni magnésium.

Après la centrifugation, remettre les macrophages en suspension dans cinq à 10 millilitres de milieu de macrophages frais dérivé de la moelle osseuse sur de la glace. Après le comptage, diluez les cellules à cinq fois 10 au cinquième par millilitre de concentration dans un milieu de macrophage frais dérivé de la moelle osseuse, et ajoutez deux millilitres de cellules par puits à la plaque à six puits. Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit dans l’incubateur de culture cellulaire.

Pour infecter les cellules avec L. amazonesis, diluez la suspension parasitaire à la multiplicité expérimentale appropriée de l’infection, et ajoutez 50 à 100 microlitres de parasites dans chaque puits des six plaques de puits, y compris tous les points temporels de l’expérience. Incuber les macrophages dérivés de la moelle osseuse pendant la période d’infection et la température appropriées. Ensuite, lavez les puits trois fois avec deux millilitres de PBS frais à 37 degrés Celsius sans calcium ni magnésium par puits, et fixez les échantillons initiaux avec 1,5 à 2 millilitres de paraformaldéhyde à 2 % pendant 10 minutes.

Pour les plaques correspondant aux points temporels ultérieurs, ajoutez deux millilitres de milieu macrophage frais dérivé de la moelle osseuse dans chaque puits et remettez les plaques dans l’incubateur approprié. Ensuite, fixez et lavez les cellules pour chacun des points temporels restants, comme nous venons de le démontrer, et stockez les échantillons à quatre degrés Celsius dans du PBS frais. Pour colorer les cellules avec du DAPI, remplacez le surnageant par 1,5 millilitres de PBS frais sans calcium ni magnésium, complété par un détergent non ionique à 0,1 % pendant 10 minutes à température ambiante, suivi de trois lavages de deux millilitres avec du PBS sans calcium ni magnésium.

Ensuite, colorez les cellules avec deux microgrammes par millilitre de DAPI dans un millilitre de PBS pendant une heure à température ambiante. Après trois lavages, placez les lamelles de couverture côté cellule vers le bas sur une lame de microscope en verre individuelle montée avec un réactif de montage anti-décoloration du commerce. Ensuite, pour quantifier le nombre de cellules infectées, utilisez l’objectif d’huile d’immersion 100x d’un microscope à fluorescence et un compteur manuel pour identifier le nombre de petits noyaux d’amastigote regroupés autour de chaque grand noyau coloré au DAPI.

Leishmania a deux formes infectieuses, les promastigotes métacycliques, qui se différencient des promastigotes procycliques à la phase stationnaire de la culture, et l’amastigote, la forme infectieuse intracellulaire que l’on trouve dans l’hôte vertébré. Ici, des amastigotes différenciés axéniquement peuvent être visualisés dans un macrophage dérivé de la moelle osseuse une heure après l’infection initiale et avant la formation de vacuoles parasitophores par fusion phagolysosomale. À 48 heures, de grandes vacuoles parasitophores distinctes abritant plusieurs parasites peuvent être observées, caractéristiques d’une infection virulente à Leishmania.

Les promastigotes non virulents en phase logarithmique, en revanche, sont incapables d’initier le développement de vacuoles parasitophores, ne parviennent pas à se répliquer et sont finalement tués dans les macrophages hôtes. Dans cette expérience, une augmentation constante du nombre de parasites métacycliques Leishmania de type sauvage intracellulaire a été observée jusqu’à 72 heures après l’infection, tandis que peu ou pas de croissance intracellulaire pour les parasites mutants avec une importation de fer mitochondrial altérée a été mesurée, suggérant que l’activité mitochondriale est nécessaire pour la croissance du parasite dans les macrophages. Les infections par les macrophages réalisées avec des amastigotes axéniques de type sauvage et mutants ont montré un schéma de croissance intracellulaire similaire à celui observé avec les promastigotes métacycliques, mais avec une infectivité parasitaire de type sauvage encore plus élevée que celle observée avec les promastigotes métacycliques.

Il est important de noter qu’il y a un délai initial de 24 heures pour les infections à promastigotes métacycliques, ce qui représente le temps nécessaire pour que les promastigotes métacycliques internalisés se différencient d’abord en amastigotes avant de commencer à se répliquer. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 15 jours si elle est correctement exécutée. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’utiliser les souches de souris appropriées et d’effectuer une quantification minutieuse des cellules macrophages et parasitaires pour garantir des MOI cohérents dans toutes les expériences.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver des macrophages dérivés de la moelle osseuse et de les infecter avec Leishmania pour quantifier leur croissance parasitaire intracellulaire, après coloration nucléaire avec DAPI. N’oubliez pas que travailler avec Leismania peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que l’utilisation d’une enceinte de sécurité biologique et d’un équipement de protection individuelle, et l’évitement des instruments tranchants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.