Name: Génération d’indigène, non balisés la huntingtine Exon1 monomère et de fibrilles en utilisant une stratégie de Fusion de SUMO (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Découvrez une méthode robuste pour produire des monomères et fibrilles de Huntingtine native sans balise. Cette stratégie de fusion SUMO améliore la reproductibilité des études structurales et fonctionnelles.

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Ce travail a été financé principalement par des subventions de la Fondation CHDI et la Swiss National Science Foundation. Nous remercions Dr Sophie Vieweg discussions utiles lors de l’élaboration de ce nouveau système d’expression et d’autres membres du groupe Lashuel pour partager leur expérience avec ce système d’expression et leur entrée et précieux commentaires. Nous remercions également Prof. Oliver Hantschel fournissant le plasmide ULP1. Les auteurs tiennent à remercier Dr. John B. Warner et Dr Senthil K. Thangaraj examen critique du manuscrit

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<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Sathasivam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+splicing+of+HTT+generates+the+pathogenic+exon+1+protein+in+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).</li>
<li>Mangiarini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+1+of+the+HD+gene+with+an+expanded+CAG+repeat+is+sufficient+to+cause+a+progressive+neurological+phenotype+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice.</a> Cell. 87 (3), 493-506 (1996).</li>
<li>El-Daher, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+proteolysis+releases+non-polyQ+fragments+that+cause+toxicity+through+dynamin+1+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation.</a> EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).</li>
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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt avec le contenu de cet article.

Dans ce protocole, nous avons défini une méthode efficace pour obtenir quantités de milligramme de natif, non identifié Httex1 contenant des résidus de glutamine 23 ou 43. Ceci a été réalisé en exprimant Httex1 comme une fusion de C-terminal de son6-balise SUMO, qui sert à isoler la protéine de fusion depuis le lysat cellulaire par IMAC et est clivé avant purification HPLC de Httex1. Alors que la stratégie SUMO a été utilisée dans la production de plusieurs autres protéines, notre méthode montre que les propriétés uniques que Sumo pourrait également être utilisé pour générer intrinsèquement désordonnés, sujettes à l’agrégation, protéine amyloïdogène qui se sont déjà révélés extrêmement difficile à gérer et produire43,44. Nous présentons un protocole qui est simple, facile à utiliser et comparable à un protocole pour la production d’une protéine « sage ». La fusion de SUMO solubilise et stabilise la Httex1 pendant l’expression et la purification d’IMAC. Clivage prématuré de la balise, comme observé avec la stratégie d’intein10 et agrégation n’étaient plus un problème.
Protéines intrinsèquement désordonnées sont particulièrement vulnérables à la dégradation. Alors que la dégradation de le N-terminale de la région de la N17 n’est pas un problème à l’aide de ce protocole, troncatures dans le PRD de Httex1 peuvent se produire. Comme les protéines tronquées sont très semblables à Httex1 hydrophobie, responsable et taille, il est difficile de les enlever par des moyens chromatographiques, donc il est préférable de prévenir leur formation en premier lieu. S’en tenir étroitement au protocole, toujours sur la glace en utilisant une quantité suffisante d’inhibiteur de protéase devraient aider maintenir le niveau de troncature observée très faible. Appliquer une balise de fusion à l’extrémité C-terminale de Httex1 a pu supprimer troncations dans le PRD facilement comme la protéine tronquée perdrait la balise affinité ainsi. Toutefois, si la séquence native doit être maintenue à que cette option ne peut être appliquée comme Httex1 se termine par la proline et au mieux de notre connaissance, il n’y a aucune balise de fusion C-terminale qui est connus pour induire un clivage chimiothèques et efficace après proline.
La partie la plus critique du protocole est le traitement de la Httex1 libéré après clivage de la balise SUMO par ULP1. La protéine doit être purifiée immédiatement par RP-HPLC. Heureusement, c’est une réaction efficace et rapide qui est habituellement réalisée dans 10-20 min à 4 ° C. En revanche, la stratégie d’intein exige plusieurs heures pour le clivage complet de l’intein, ce qui nécessite un compromis entre un clivage incomplet et agrégation de début afin de maximiser le rendement. Un bilan rapide est obligatoire pour mutant Httex1, car il va commencer à agréger à la concentration relativement élevée dans la réaction de clivage, tandis que la variante 23Q est stable pendant une longue période. Au cours de la purification de RP-HPLC, apparaît un autre avantage du SUMO : alors que le Ssp DnaB intein est hydrophobe et s’en tient fermement à la colonne, SUMO est plus hydrophile et élué complètement de la colonne de phase inversée de C4. Bien que commercial ULP1 est très coûteux, la protéine peut être facilement produite des rendements élevés suivant les protocoles publiés antérieurement29.
L’importance cruciale de l’application d’un protocole de ventilation avant d’utiliser le Httex1 ne peut pas être assez souligné. PolyQ lyophilisée protéines telles que les Httex1 sont stables et peuvent être stockées longtemps, mais ne sont pas complètement solubles dans l’eau et les tampons. La présence d’oligomères préformés ou fibrilles pourrait avoir un impact significatif sur la cinétique de l’agrégation et les propriétés biophysiques de la protéine45. Le protocole de désagrégation décrit ici permet la ventilation de la protéine, l’élimination des agrégats préformés et génération d’une solution de monomère Httex1 auprès d’un échantillon lyophilisé. Nous avons observé l’agrégation cinétique et fibrilles une morphologie semblable pour Httex1 obtenus avec le SUMO et la stratégie d’intein.
Par rapport aux méthodes précédentes de production Httex1, la stratégie SUMO décrite ici offre plusieurs avantages et élargit l’éventail des études possibles pour étudier la structure et les propriétés fonctionnelles de cette protéine dans la santé et la maladie. La protéine de fusion de SUMO-Httex1 est facile à manipuler, il peut être congelé et stocké ou maintenu dans la solution pendant 24 h à température ambiante, tandis que le mHttex1 libre serait regrouper rapidement. La stabilité et la grande solubilité des protéines SUMO-Httex1 fusion fournissent une plus grande flexibilité pour manipuler la protéine et/ou introduisent des modifications dans mHttex1 qui serait autrement impossible après clivage enzymatiques et chimiques. Cela inclut l’introduction de modifications post-traductionnelles, fluorophores, marqueurs de spin, balises de biotine, etc. les avances présentées ici devraient 1) faciliter les futures études afin d’élucider les relations structure-fonction des Httex1 ; 2) génèrent de nouveaux outils pour étudier l’agrégation Htt et la diffusion de la pathologie ; 3) permettent le développement de nouveaux tests pour identifier les molécules qui stabilisent mutant Httex1 et empêchent son agrégation ; et 4) encourager les scientifiques dans d’autres domaines pour apporter à travailler sur cette protéine et rejoignez notre quête pour trouver des remèdes pour la maladie de Huntington.

HTT est une protéine de 348 kDa et a été impliquée dans plusieurs fonctions physiologiques1. Lorsque Htt contient une région polyQ élargi de plus de 36 résidus dans son extrémité N-terminale, elle provoque HD2,3. Pathologie de la HD est caractérisée par des inclusions cellulaires dans le striatum et le cortex, ce qui conduit à la mort neuronale et une atrophie des tissus affectés4,5. Plusieurs fragments de N-terminal Htt qui contiennent le tractus de répétition de polyQ ont été détectés dans les cerveaux post mortem de patients HD et sont censés être générés par le traitement protéolytique de la protéine de la huntingtine6. Des études récentes suggèrent que Httex1 pourrait également être formé en raison de l’épissage des ARNm aberrants. Httex1 contient la mutation pathologique polyQ et sa surexpression chez les animaux peut récapituler nombreuses fonctionnalités clées de HD7, mettant ainsi en évidence un possible rôle central de ce fragment en HD pathologie et maladie progression6, 8,9.
En raison de la forte agrégation propension de mutant Httex1 (mHttex1) avec des voies élargis polyQ, la majorité des systèmes d’expression actuels est basée sur la fusion transitoire de Httex1 aux protéines (comme la glutathion-S-transférase (GST), thiorédoxine (TRX) ou protéine-liant-maltose (MBP) et/ou des peptides (poly-histidine) différemment d’améliorer son expression, de stabilité, de purification ou de solubilité10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Le partenaire de fusion est lié à Httex1 avec une courte séquence contenant un site de clivage des protéases comme la trypsine, tabacco etch protéase du virus (TEV) ou PreScission pour permettre le clivage et la libération de Httex1 avant l’ouverture de l’agrégation ou purification. Insuffisances de ces méthodes incluent la possibilité de laisser des résidus supplémentaires en raison de la non-chimiothèques clivage et la création de fragments tronquées en raison de le miscleavage au sein de la séquence de Httex1, en plus de l’hétérogénéité en raison du clivage incomplet ( Voir Vieweg, et al. , pour une discussion plus approfondie sur les avantages et les limites de cette approche)10. Pour pallier ces lacunes, nous avons récemment mis au point une stratégie d’expression permettant la génération de Httex1-sans tag native pour la première fois en utilisant une fusion de N-terminal transitoire de Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein à Httex110. Alors que le clivage intein chimiothèques est précis et donne la quantité de mg de protéines, il souffre encore deux inconvénients qui pourraient diminuer le rendement : nommément prématuré clivage de l’intein qui peut se produire lors de l’expression et le fait qu’un clivage se produit au cours plusieurs heures, ce qui pourraient conduire à la perte de protéines en raison de l’agrégation, surtout pour les Httex1 de polyQ expansé répétitions.
Pour pallier ces lacunes et d’affiner notre stratégie pour la production de natif, sans tag Httex1, nous avons développé un nouveau système d’expression issu de la fusion transitoire du SUMO, plus exactement l’homologue de levure Smt3 à Httex1. L’application du système de production de protéines recombinantes SUMO a été publiée en 200429, où une augmentation du taux d’expression et de la solubilité de la protéine de fusion de SUMO a été démontrées. La balise SUMO peut être clivée par l’ubiquitine comme protéine spécifique protéase 1 (ULP1), qui ne nécessite pas un site de reconnaissance, mais reconnaît la structure tertiaire de SUMO et élimine pratiquement la possibilité de miscleavage30. Par ailleurs, le clivage ULP1 médiation est rapide et chimiothèques et ne laisse aucun résidu supplémentaire. Le clivage prématuré de la balise de fusion, tel qu’observé avec l’intein autocatalytique10, est complètement évité par l’exigence d’une protéase externe. Alors que la stratégie SUMO est aujourd'hui largement utilisée pour la production de protéine recombinante31,32,33, nous montrons dans cet article qu’il est particulièrement utile pour la génération d’un intrinsèquement désordonnés, sujettes à l’agrégation, protéine amyloïdogène tels que Httex1. Nous croyons que la simplicité, l’efficacité et la robustesse de notre méthode basée sur la fusion-SUMO vont faire Httex1 native, tag-free plus accessible aux chercheurs de différentes disciplines et élimine la nécessité d’utiliser des séquences non indigènes de Httex1 in vitro . Il s’agit d’une avancée importante qui permettra de faciliter les études futures afin d’élucider la relation structure-fonction de Httex1.
Le protocole décrit la purification de Httex1 de 12 L de culture bactérienne, mais le protocole pourrait être facilement adapté pour les productions plus petite ou plus grande échelle. Le protocole décrit la préparation de type sauvage Httex1 (wtHttex1) avec une longueur de répéter polyQ ci-dessous (23Q) et le mutant Httex1 (mHttex1) avec un polyQ répéter longueur au-dessus (43Q) le seuil pathogène (36Q).

<table><tbody><tr><td>Formiate d’uranyle (UO2(CHO2)2)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50</td><td>grilles EMS</td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>Cellule de haute précision en quartz SUPRASIL 1 mm trajet lumineux de Hellma Analytics</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Substance tampon Dulbecco’s (PBS sans Ca et Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon Luria (Bouillon Miller’s LB)</td><td>&nbsp ; Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td></td><td>NEB NEB# E4130</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&nbsp ; Cocktail inhibiteur de protéase Roche</td><td></td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-huntingtine, a.a. 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Chèvre anti-souris IgG (H + L)</td><td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 colonne&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>C4 Colonne HPLC</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168. P0</td><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 10 et micro ; m C4 300 &Aring ;, LC Colonne 250 x 21,2 mm, Phenomenex, 19x10 mm colonne de garde, non chemisée en température</td></tr><tr><td>Acétonitrile HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans préfiltre stérile</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre semi-micro cuvette</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop, raccords 1/16" (&Auml ; KTAdesign), 50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER Tubes pour FPLC 16 x 100 mm, bouchon 12,0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Microcon de 100 kD&nbsp ; filtres à débit rapide</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130 processeur de liquide à ultrasons</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml ; KTA 900 équipé d’un collecteur de fractions&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 Dichroïsme circulaire</td> Système UPLC <td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters&nbsp ;</td><td>Waters</td><td></td><td>C8 BEH acquity 2,1 x 100 mm Colonne de 1,7 micron, colonne préchauffée (40 &deg ; C), débit de 0,6 mL/min, volume d’injection de 4 &mu ; </td></tr><tr><td>L waters Système HPLC</td><td>Détecteur UV Waters</td><td></td><td>2489 et module de gradient quaternaire 2535, boucle de 20 mL dans un boîtier FlexInject</td></tr><tr><td>ESI-MS : Finnigan LTQ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>instrument de lyophylisation</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit BioTWIN&nbsp ;</td>Microscope électronique <td>FEI</td><td></td><td>équipé d’un canon LaB6 et d’une caméra CCD (FEI) FEI Eagle 4K x 4K et fonctionnant à 80 kV</td></tr><tr><td>37 &deg ; C secousses&nbsp ; incubateur</td><td>Infors HT multitron Biophotomètre standard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

génération d’indigène, non balisés la huntingtine exon1 monomère et de fibrilles en utilisant une stratégie de fusion de sumo

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative mortelle héréditaire causée par une expansion CAG (≥36) dans le premier exon du gène HD, ayant pour résultat l’expression de la protéine huntingtine (Htt) ou N-terminale des fragments celle-ci avec un (polyglutamine élargi tronçon de polyQ).
L’exon1 de la protéine huntingtine (Httex1) est le plus petit fragment Htt qui reprend bon nombre des fonctionnalités de HD de cellulaires et animaux modèles et est l’un des fragments plus largement étudiés de Htt. La petite taille de Httex1 rend expérimentalement plus propices à la caractérisation biophysique utilisant des techniques standards et haute résolution par rapport à des fragments plus longs ou long Htt. Toutefois, la propension de grande agrégation du mutant Httex1 (mHttex1) avec une augmentation polyQ de contenu (≥42) a rendu difficile de développer l’expression efficace et des systèmes de purification de produire ces protéines en quantité suffisante et les rendre accessibles aux scientifiques de diverses disciplines sans l’utilisation de protéines de fusion ou d’autres stratégies qui modifient la séquence native de la protéine. Nous présentons ici une méthode robuste et optimisée pour la production de quantités de milligramme d’indigène, tag-gratuit Httex1 issu de la fusion transitoire du petit ubiquitine connexes modificateur (SUMO). La simplicité et l’efficacité de la stratégie permettra d’éliminer la nécessité d’utiliser des séquences non indigènes de Httex1, donc rendre cette protéine plus accessibles aux chercheurs et améliorer la reproductibilité des expériences dans différents laboratoires. Nous croyons que ces avancées facilitera également les futures études visant à élucider la relation structure-fonction de Htt ainsi qu’en développement de nouveaux outils diagnostiques et de thérapies pour traiter ou ralentir la progression de la HD.

Httex1 est exprimée chez e. coli avec un N-terminal son6-balise SUMO. Les résultats représentatifs de l’expression et purification de la protéine de fusion sont résumés dans la Figure 1. La séquence de Httex1 se compose des résidus 2-90 de Htt et commence par Ala2, car Met1 est totalement clivé en vivo42. La numérotation des acides aminés correspond à la variante de 23Q, la séquence complète de la protéine de fusion exprimée est montrée dans la Figure 1A. Les plasmides seront déposés à Addgene dans un proche avenir à partager avec la communauté. Une représentation schématique du plasmide et la protéine de fusion exprimée est illustré à la Figure 1B. His6-SUMO Httex1 exprime à un niveau moyen (Figure 1C) et la plus grande partie de la protéine de fusion est présent dans la fraction soluble après lyse, tant pour la 23Q et la variante 43Q. La protéine de fusion migre plus élevés que prévu, selon le poids moléculaire. C’est en partie à cause du pli fort du SUMO mais surtout en raison de la composition de la séquence inhabituelle de Httex1, contenant principalement des résidus de glutamine et de la proline. Le type sauvage (23Q) tant le mutant (43Q) protéine de fusion peut être enrichie à environ 80 % de pureté par IMAC (Figure 1D), la présence de purification des protéines de l’hôte peut s’expliquer par le niveau d’expression relativement faible de Httex1 et le grand échantillon volume appliqué à la colonne.
Le clivage de la sa6-balise SUMO et la purification de Httex1 est illustré dans la Figure 2A. UPLC est un outil efficace pour surveiller le clivage de la sa6-balise SUMO (Figure 2B). Le pic initial de la protéine de fusion est consommé et deux pics de nouveau et bien séparées correspondant le son6-balise SUMO et Httex1 apparaissent. La réaction de clivage est terminée en 10-20 min. Le Western Blot (WB) est trop lent pour surveiller la réaction de clivage efficacement, mais il a été inclus dans la figure pour référence et pour démontrer la conformité du clivage SUMO. Les deux Httex1 23Q et 43Q peuvent être séparés de son6-SUMO tag par RP-HPLC (Figure 2C) et ont été obtenues en grande pureté comme indiqué par l’analyse de l’UPLC, MS et SDS-PAGE (Figure 2D).
Pour illustrer que les protéines de Httex1 préparés par cette méthode conservent les propriétés attendues de l’agrégation de Httex1, nous avons évalué la cinétique de la fibrillization du mutant Httex1 à 37 ° C par un dosage de la sédimentation, surveiller les changements dans la structure secondaire de CD spectroscopie et caractérise la morphologie des agrégats de TEM. Un ensemble de données représentatif de la cinétique de l’agrégation de la formation de fibrilles mHttex1 tel que déterminé par un test de sédimentation est montré dans laFigure 3A. La perte de Httex1 soluble 43Q au fil du temps, en raison de la formation de fibrilles a été quantifié par UPLC. Nous observons un épuisement complet des protéines solubles après 48 heures d’incubation. En outre, nous avons déterminé la structure secondaire de la protéine par spectroscopie CD (Figure 3B). Httex1 43Q quarts de non structurées (λmin 205 nm) à feuillet β principalement riche conformation (λmin 215 nm) après 48 heures d’incubation. Ce changement structurel est accompagné par la formation d’agrégats longtemps fibrillaires comme observables par TEM à 48 heures (Figure 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Figure 1 . Expression et purification de son6-protéine de fusion de SUMO Httex1.  (A), la séquence d’acides aminés His6-SUMO-Httex1-QN fusion constructions (son6-SUMO en vert et Httex1-QN en orange) ; (B) un aperçu schématique de l’expression et purification de la protéine de fusion ; (C) analyse SDS-PAGE de l’expression et la solubilité de la protéine de fusion après la lyse ; Chromatogramme (D) de la purification de l’IMAC de la protéine de fusion et l’analyse des fractions par SDS-PAGE (barre rouge : barre de fraction libre, bleu : lavage fraction, noir bar : fractions contenant les pics d’élution) ; <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Figure 2 . Clivage de la sa balise SUMO6 et purification des protéines de Httex1-QN tag-free. Présentation schématique de la (A) ; (B) analyse du clivage de la balise SUMO avec ULP1 par UPLC (bleu : avant l’ajout des ULP1 ; noir : 20 min (23Q), respectivement de 10 min (43Q) après l’addition de ULP1) et la Banque mondiale (MAB5492 1 : 2000, chèvre secondaire anti souris anticorps 1 : 5000) ; (C) chromatogramme de la purification de RP-HPLC préparative des Httex1 ; D : analyse de la Httex1 purifié par UPLC, SDS-PAGE et ESI-MS ; le poids moléculaire prévu est respectivement de 9943 Da (23Q) et 12506 Da (43Q). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Figure 3 . Agrégation de Httex1-43Q : test de sédimentation (A) basé sur UPLC. (B) des spectres de DC de la structure secondaire à 0 h et des micrographies TEM de 48 h. (C) des agrégats après 48 h (barreaux de l’échelle est 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons ici un protocole robuste et optimisé pour la production de quantités de milligramme de monomères natives, tag-free et les fibrilles de l’exon1 de la protéine huntingtine (Httex1) issu de la fusion transitoire du petit ubiquitine connexes modificateur (SUMO).

Génération d’indigène, non balisés la huntingtine Exon1 monomère et de fibrilles en utilisant une stratégie de Fusion de SUMO

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Cette méthode nous permet de produire un exon sans marqueur portant la séquence native de la protéine et offre de nouvelles opportunités pour étudier la fonction structurelle de cette protéine, nous permettant ainsi de comprendre sa fonction dans la santé et la maladie. Les principaux avantages ici sont la simplicité, l’efficacité et la robustesse de la méthode. En éliminant l’hétérogénéité de la séquence, cette méthode permettra et facilitera la comparaison et la reproductibilité entre différents laboratoires.Bien que cette méthode ait été développée pour la production de l’exon un de la huntingtine, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes sujets à l’agrégation comme le peptide bêta-amyloïde et l’alpha-synucléine. Tout d’abord, filtrez un surnageant précédemment isolé contenant une protéine de fusion de l’exon un de l’exon huntingtin His-SUMO à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micromètre. Prélever un échantillon de 20 microlitres du surnageant filtré pour l’analyse SDS-PAGE.Remplissez le lysat clarifié dans un Superloop. Isolez la protéine de fusion de l’exon un de la huntingtine His-SUMO à partir du lysat bactérien clarifié par chromatographie d’affinité métallique immobilisée sur un système de chromatographie liquide à performance rapide à quatre degrés Celsius. Passez 10 volumes de colonne ou 200 millilitres de tampon A à 10 millilitres par minute pour éliminer les protéines non liées.Éluer la protéine de fusion avec des volumes de 2,5 colonnes ou 50 millilitres de tampon B à 100 % à raison de deux millilitres par minute. Prélever 20 microlitres de chaque fraction pour l’analyse SDS-PAGE. Ajoutez 20 microlitres de colorant de chargement à chaque échantillon.Chargez deux microlitres de protéine brute, la fraction non liée, la fraction de lavage et chaque fraction du pic d’élution sur un gel à 15 %. Faites fonctionner le gel pendant 90 minutes à 180 volts. Une fois le tirage terminé, colorez le gel avec le colorant Coomassie selon les instructions du fabricant.Regroupez les fractions contenant la protéine de fusion en fonction du pic du chromatogramme. Ajoutez ensuite du DTT de 100 millimolaires et de la L-cystéine de 100 millimolaires aux fractions mélangées, et dissolvez en inversant doucement le tube. Pour préparer le solvant A à la purification par HPLC, ajoutez deux millilitres d’acide trifluoroacétique à une bouteille d’eau de deux litres.Pour préparer le solvant B, ajoutez 2,5 millilitres d’acide trifluoroacétique dans une bouteille de 2,5 litres d’acétonitrile. Préparez le système HPLC comme suggéré par le fabricant. Effectuez une exécution à blanc pour garantir la propreté de la colonne.Ensuite, prélever 100 microlitres de la protéine de fusion avant l’ajout d’ULP1 pour surveiller la réaction de clivage par UPLC. Transférez 20 millilitres de protéine de fusion dans un nouveau tube de 50 millilitres et ajoutez 0,4 millilitre de solution mère ULP1. Incuber l’échantillon sur de la glace et conserver la protéine de fusion restante sur de la glace.Ne stockez pas la protéine pendant les étapes intermédiaires et procédez à la purification jusqu’à la fin. Toutes les 10 minutes, retirez 100 microlitres de réaction de clivage pour surveiller la progression de l’UPLC. Après centrifugation des échantillons, analysez deux microlitres de chaque surnageant par UPLC.Comparez les chromatogrammes obtenus pour l’échantillon avant l’ajout d’ULP1 et les échantillons prélevés après. Une fois le clivage SUMO terminé, filtrez l’échantillon à l’aide d’un filtre à seringue de 22 micromètres. Ensuite, purifiez l’échantillon filtré par HPLC en phase inversée.Analysez les fractions HPLC par UPLC et ESI-MS. Des fractions de piscine de pureté similaire dans des tubes en plastique de 50 millilitres. Congeler les échantillons dans de l’azote liquide et lyophiliser.Transférez ensuite la protéine lyophilisée dans des tubes en plastique de deux millilitres et stockez-la à moins 20 degrés Celsius. Dissoudre 100 microgrammes d’exon huntingtin lyophilisé, un microlitre sur huit d’acide trifluoroacétique pur dans un tube de 1,5 millilitre. Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, évaporez soigneusement l’acide trifluoroacétique sous une hotte avec un jet d’azote ou d’argon.Une fois que la protéine est sèche, dissolvez-la dans 100 microlitres d’eau. Analysez ensuite deux microlitres d’échantillon par UPLC. Mélangez maintenant 20 microlitres de solution protéique avec 20 microlitres de colorant de chargement 2X.Analysez des échantillons de protéines d’un à 10 microgrammes par SDS-PAGE. Faites fonctionner le gel pendant 90 minutes à 180 volts. Une fois le tirage terminé, colorez le gel avec le colorant Coomassie selon les instructions du fabricant.Préparez 10 millilitres de DPBS dans un tube de 50 millilitres. Filtrez la solution DPBS à travers un filtre de 2 micromètres avant chaque utilisation. Ensuite, dissolvez 150 microlitres d’exon huntingtin lyophilisé, un sur 12 microlitres d’acide trifluoroacétique pur dans un tube de 1,5 millimètre.Après une incubation de 20 minutes à température ambiante, évaporez soigneusement l’acide trifluoroacétique dans une hotte avec un jet d’azote ou d’argon. Dissoudre la protéine désagrégée dans un millilitre de DPBS pré-refroidi et ajuster le pH entre 7,2 et 7,4 avec une molaire d’hydroxyde de sodium. Filtrez ensuite la solution protéique à travers un filtre centrifuge de 100 kilodaltons dans des tubes en plastique de 1,5 millilitre.Déterminez la concentration de l’exon un de la huntingtine à l’aide d’une courbe d’étalonnage UPLC basée sur la détection par analyse des acides aminés. Calculez ensuite la quantité de DPBS qui doit être ajoutée pour obtenir une concentration de l’exon un de la huntingtine à trois micromolaires. Diluez la protéine à trois micromolaires en ajoutant la quantité calculée de DPBS dans le tube à essai.Gardez le tube sur de la glace jusqu’au lancement du protocole d’agrégation. La validation par électromicroscopie et d’autres techniques doit être effectuée afin de valider que le protocole de désagrégation a réussi à éliminer tous les agrégats préformés. La séquence complète d’acides aminés de la protéine de fusion exprimée est illustrée ici.Un schéma du plasmide et de la protéine de fusion exprimée est présenté ici. L’exon de la huntingtine His-SUMO s’exprime à un niveau moyen, et la majeure partie de la protéine de fusion est présente dans la fraction soluble après lyse, à la fois pour les variantes de 23 glutamines et de 43 glutamines. La protéine de fusion de type sauvage et mutante peut être enrichie à environ 80 % de pureté par chromatographie d’affinité métallique immobilisée.Le clivage de l’étiquette His-SUMO et la purification de l’exon un de la huntingtine sont illustrés ici. Le pic de protéine de fusion original est consommé et deux nouveaux pics bien séparés correspondant à l’étiquette His-SUMO et à l’exon de huntingtine apparaissent. Les deux 23 glutamines et 43 glutamines de l’exon 1 de la huntingtine peuvent être séparées de l’étiquette His-SUMO par HPLC en phase inverse et ont été obtenues avec une grande pureté, comme le montrent les analyses UPLC, MS et SDS-PAGE.La cinétique d’agrégation de la formation de la fibrille de l’exon un de la m-huntingtine, déterminée par un test de sédimentation, montre une déplétion complète des protéines solubles après 48 heures d’incubation. La spectroscopie CD de la structure secondaire de la protéine montre un décalage des 43 glutamines de l’exon 1 de la huntingtine de la conformation non structurée à la conformation riche en feuillet bêta. Ce changement structurel s’accompagne de la formation de longs agrégats fibrillaires comme observé par TEM.Une fois maîtrisée, cette méthode d’expression et de purification de l’exon de huntingtine un peut être réalisée en trois jours si elle est réalisée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est très important de se rappeler que les protéines de l’exon un de la huntingtine, en particulier les protéines avec étirement de polyglutamine expansé, ont une très forte propension à s’agréger. Grâce à cette méthode, nous sommes en mesure de produire suffisamment de protéines de l’exon 1 de la huntingtine et de réaliser des études auparavant inaccessibles pour étudier la structure, l’agrégation et la toxicité de la protéine et pour développer de nouveaux tests pour détecter et quantifier la forme de l’exon 1 associée à la maladie.La stabilité et la solubilité élevée de la protéine de fusion SUMO offrent une plus grande flexibilité dans la manipulation de la protéine et permettent l’introduction de modifications dans le contexte des protéines de fusion qui ne seraient autrement pas possibles après le clivage. Nous espérons que la simplicité et l’efficacité de cette méthode élimineront le besoin d’utiliser des séquences non natives et des systèmes modèles et encourageront les chercheurs de différentes disciplines à se joindre à notre quête pour comprendre la biologie de cette protéine importante et développer des thérapies efficaces pour le traitement de la maladie de Huntington.

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Ce rapport décrit une méthode de bio-ingénierie pour concevoir et construire de nouveaux Facteurs d'épissage artificiel (ASF) qui modulent spécifiquement l'épissage des gènes cibles dans les cellules de mammifères. Cette méthode peut être élargie pour englober divers facteurs artificiels pour manipuler d'autres aspects du métabolisme de l'ARN.

Facteurs artificiels artificiels pour manipuler spécifiquement l&#39;épissage alternatif dans les cellules humaines

On décrit une méthode pour le fractionnement de la huntingtine mutante solubles et insolubles espèces de souris cérébrale et la culture cellulaire. La méthode décrite est utile pour la caractérisation et la quantification des flux de protéine huntingtine et sida en analysant l’homéostasie des protéines dans la pathogenèse de la maladie et en présence de...

Fractionnement pour la résolution des espèces de la huntingtine solubles et insolubles

Induire l’inclusion exon (modulation d’épissure) et expression de SMN pour l’atrophie musculaire spinale (SMA) de sauvetage ont démontré différents oligonucléotides antisens (NAO). Nous décrivons ici un protocole pour lipotransfection AON induire l’inclusion d’exon du gène SMN2 et les méthodes d’évaluation pour déterminer l’efficacité chez les patients fibroblastes SMA.

Évaluation de l’Inclusion d’Exon induite par Splice commutation oligonucléotides antisens de fibroblastes de patients de SMA

Cet article décrit les protocoles afin d’évaluer l’effet des protéines fluorescentes sur l’agrégation et la toxicité de l’expansion de polyglutamine mal repliées pour l’évaluation rapide d’une protéine fluorescente nouvellement indéterminée dans le contexte de reporters fluorescents.

Effet des protéines fluorescentes sur des partenaires de Fusion utilisant les épreuves de toxicité Polyglutamine chez la levure

Le SUMO est une protéine modificatrice essentielle et très conservée, de petite taille, comme l’ubiquitine. Dans ce protocole, nous décrivons l’utilisation d’une protéine de piégeage de SUMO recombinant tolérante au stress (kmUTAG) pour visualiser les conjugués de SUMO natifs et non marqués et leur localisation dans une variété de types de cellules.

Localisation des protéines modifiées par SUMO à l’aide de protéines de piégeage du sumo fluorescent

L’objectif de cet article est de décrire les étapes requises pour la génération de fibrilles à partir de l’alpha-synucléine monomère, le contrôle de qualité ultérieur, et l’utilisation des fibrilles préformées in vivo.

Génération de fibrilles préformées alpha-synucléine à partir de monomères et utilisation in vivo

Ce protocole décrit la conversion des fibroblastes cutanés en myoblastes et leur différenciation en myotubes. Les lignées cellulaires sont dérivées de patients atteints de troubles neuromusculaires et peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes pathologiques et tester des stratégies thérapeutiques.

Reprogrammation directe des fibroblastes humains en myoblastes pour étudier les thérapies pour les troubles neuromusculaires

Nous fournissons des protocoles évolutifs couvrant la conception de construction, la transfection transitoire, l’expression et la purification de variantes complètes de la protéine huntingtine humaine dans les cellules HEK293.

Production efficace et évolutive de variantes de huntingtine humaine pleine longueur dans des cellules de mammifères à l’aide d’un système d’expression transitoire

Nous décrivons ici une méthode d’identification des protéines de liaison aux petites molécules à l’aide du marquage par photoaffinité. L’avantage de cette technique est que la liaison et le marquage covalent des protéines cibles se produisent dans l’environnement cellulaire vivant, éliminant ainsi le risque de perturber la structure des protéines natives et les conditions de liaison lors de la lyse cellulaire.

Identification des protéines de petites molécules de liaison dans un Natif cellulaire Environnement par des cellules vivantes photoaffinité Étiquetage

Découvrez une méthode robuste pour produire des monomères et fibrilles de Huntingtine native sans balise. Cette stratégie de fusion SUMO améliore la reproductibilité des études structurales et fonctionnelles.

Génération d’indigène, non balisés la huntingtine Exon1 monomère et de fibrilles en utilisant une stratégie de Fusion de SUMO

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