Évaluation vasculaires hyperperméabilité inducteurs enzymatiques de la peau avec le test de Miles

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la fuite vasculaire dans le derme de la souris qui est induite par l’injection intradermique d’agents favorisant la perméabilité. Cette procédure peut aider à répondre à des questions clés sur la régulation de la perméabilité vasculaire in vivo, telles que quelles molécules peuvent stimuler ou inhiber les fuites vasculaires et quelles sont les voies de signalisation impliquées. Le principal avantage de cette procédure est qu’elle est rapide et relativement simple, et qu’elle utilise principalement des réactifs et des matériaux de laboratoire courants.

Les implications de cette technique s’étendent au traitement des maladies avec œdème pathologique. En particulier, les chercheurs peuvent utiliser ce test pour identifier de nouvelles cibles moléculaires et pour tester des médicaments pertinents pour leur capacité à inhiber la perméabilité vasculaire de manière relativement rapide et simple. Préparez des solutions séparées de l’inhibiteur d’histamine, le maléate de pyrilamine, et du colorant bleu Evans, tous deux dans une solution saline à 0,9 %.

Ensuite, en travaillant dans une armoire à flux laminaire, stérilisez les solutions en les passant à travers un filtre de 0,22 micromètre. Chargez les deux solutions dans des seringues séparées d’un millilitre équipées d’aiguilles de calibre 30. Ensuite, ébouriffez la souris.

Inclinez ensuite la souris de manière à ce que la tête soit dirigée vers le sol et l’abdomen vers le haut. Une fois la souris positionnée, administrez 10 microlitres par gramme de poids corporel de solution de maléate de pyrilamine par injection intrapéritonéale. Ensuite, afin de favoriser la vasodilatation, placez la souris dans une chambre chauffante à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Déplacez ensuite la souris vers un dispositif de contention de souris. Ensuite, frottez la queue avec de l’éthanol à 70 % pour une vasodilatation supplémentaire. Administrer 100 microlitres de solution de colorant bleu Evans par voie intraveineuse par la veine de la queue.

Pour éviter les saignements, tenez rapidement la queue entre un doigt et le pouce et appliquez une pression au site d’injection. L’injection intraveineuse d’Evans Blue Dye dans la veine de la queue de la souris est une étape difficile et critique de cette procédure. Par conséquent, il est essentiel que les chercheurs soient compétents pour effectuer cette injection avant de procéder à la suite de la procédure.

L’établissement de la compétence nécessitera une pratique préalable. Utilisez des solutions stériles de solution saline tamponnée au phosphate pour diluer le réactif VEGF de sorte que le volume final de la dose soit de 20 microlitres. Chargez ensuite le réactif induisant la perméabilité VEGF et la commande du véhicule dans deux seringues séparées de 300 microlitres équipées d’aiguilles de calibre 31.

Maintenez l’aiguille à un angle de 15 degrés avec la peau et injectez 20 microlitres de VEGF par voie intradermique dans le flanc de la souris. Localisez une bulle en relief dans la peau pour valider l’efficacité de l’injection. Effectuez des injections intradermiques à deux sites supplémentaires distants d’au moins un centimètre.

Tournez ensuite la souris pour exposer le deuxième flanc et répétez les injections triples avec la solution de véhicule. Tenez un registre sur papier pour chacun des sites d’injection et l’heure à laquelle la procédure d’injection est terminée. Transférez ensuite la souris dans la cage d’accueil.

Continuez à surveiller la souris jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience et commence à se déplacer dans la cage. Laissez agir la solution VEGF pendant 20 minutes avant d’appeler la souris. À ce stade, injectez séquentiellement VEGFA et Vehicle chez toutes les souris en suivant la même procédure.

Après 20 minutes, placez chaque souris euthanasiée sur le dos et épinglez ses pattes sur un tableau en liège enveloppé dans un mouchoir propre. Ensuite, à l’aide de ciseaux émoussés, faites une incision verticale de trois à quatre centimètres de long du bas-ventre à la poitrine de la souris morte. Ensuite, utilisez des pinces et un scalpel pour taquiner la peau des deux côtés du flanc.

Utilisez le scalpel pour enlever toute graisse si présente dans les régions autour du site de fuite. Ensuite, utilisez la pince et le scalpel pour exciser les régions de la peau avec le colorant Evans Blue qui a fuité. Les régions cutanées excisées doivent être de taille similaire.

Transférez les échantillons de peau dans des tubes de 1,5 millilitre et étiquetez-les en conséquence. Séchez l’échantillon en plaçant le tube ouvert dans un bloc de chaleur pendant la nuit. Une fois le séchage terminé, ajoutez 250 microlitres de formamide désionisé à l’échantillon dans une hotte.

Fermez le couvercle du tube et placez-le dans un bloc de chaleur pendant la nuit pour extraire le colorant Evans. Centrifugez les échantillons à 10 000 g ou plus pendant 40 minutes dans une centrifugeuse de paillasse. Après la centrifugation, transférez 100 microlitres de chaque surnageant contenant un colorant de l’échantillon centrifugé dans les puits d’une plaque à 96 puits fonctionnant dans une hotte.

Lire l’absorbance d’Evans Blue à l’aide d’un spectrophotomètre. Pour étudier les fuites vasculaires induites par le VEGF, la souris est injectée avec 50 nanogrammes de VEGFA dans une solution saline tamponnée au phosphate ou uniquement dans une solution saline tamponnée au phosphate comme véhicule. L’image montre une augmentation de l’accumulation de colorant Evans Blue dans les échantillons de peau injectés avec le VEGFA par rapport au contrôle du véhicule in situ.

Cette image sur plaque de 96 puits montre le colorant bleu Evans chargé extrait en formamide de l’échantillon de peau. Ce graphique montre les valeurs d’absorbance normalisées des échantillons de contrôle VEGFA et de véhicules uniquement. Le graphique montre que l’injection de 50 nanogrammes de VEGFA augmente considérablement la fuite du colorant Evans par rapport au véhicule seul.

Ce graphique est obtenu après avoir quantifié les variations de pli de la densité optique pour le VEGFA par rapport aux échantillons de véhicules. Le graphique montre une augmentation moyenne de trois fois de la fuite vasculaire après l’administration de VEGFA par rapport au véhicule seul. Une fois maîtrisé, le segment principal de cette technique peut être réalisé en deux heures s’il est exécuté correctement.

Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de normaliser les fuites vasculaires induites par l’agent en les fuites vasculaires induites par le véhicule afin de tenir compte des fuites vasculaires non spécifiques et des variations entre les souris. Cette procédure peut être combinée avec d’autres méthodes telles que l’administration de médicaments afin de répondre à des questions telles que la possibilité de cibler une protéine pour inhiber la perméabilité vasculaire. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie vasculaire pour explorer les mécanismes moléculaires de l’hyperperméabilité vasculaire chez les souris génétiquement modifiées, en identifiant les composants de signalisation clés nécessaires aux fuites vasculaires.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’induire et de mesurer les fuites vasculaires dans le derme de la souris.