Name: Peptides antimicrobiens produites par l’Incorporation de la pression sélective d’amino-acides Non canoniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Découvrez l'incorporation d'acides aminés non canoniques dans des peptides antimicrobiens ribosomiques utilisant Escherichia coli. Cette méthode permet d'évaluer l'activité antimicrobienne par tests de diffusion sur gélose et microscopie à fluorescence.

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J.H.N., T.B. et M.B. reconnaissent le financement par le programme UE FW7 (SYNPEPTIDE). F.-J.S. et T.F. reconnaissent le financement par le ministère fédéral de l’éducation et la Science (BMBF programme « HSP 2020 », TU-WIMIplus projet SynTUBio) et la Fondation de recherche allemande (Cluster d’Excellence « Unifying concepts in Catalysis »).

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

En utilisant SPI pour l’insertion des analogues de la proline, les structures ciblées nisine peuvent être substantiellement modifiés, créant des variantes de nouveau peptide avec combinaisons de séquence unique et propriétés chimiques. De cette façon, la limite de base de la technologie génétique classique peut être contournée, qui est contraint des chimies de chaîne latérale des 20 cAAs. In vivo la diversification chimique de la nisine comme illustré ci-dessus illustre une approche générale pour compléter la SPTM naturelle et pour rehausser de façon spectaculaire l’espace chimique des RiPPs. Nous croyons qu’élargir le répertoire des acides aminés naturels très prometteur surtout pour amplis. Dans les protéines, un énorme éventail de fonctionnalités peut être réalisé grâce à un arrangement défini des 20 cAAs dans les structures tridimensionnelles. Avec seulement 7-100 aa en longueur3, moyens d’atteindre ces caractéristiques structurales que par le biais de cAAs serait limités pour les amplis. Il n’est donc pas surprenant que naturels ampères sous forme de RiPPs sont généralement largement sera mis à jour le4. De la même façon, ANAC comme blocs de construction alternatives est très prometteurs pour améliorer leurs paramètres pharmacodynamiques et pharmacocinétiques (voir Baumann et coll. 201735 et les références qui y sont).
La méthodologie SPI utilisée dans ce travail bénéficie d’un montage expérimental relativement facile, d’exécution simple et reproductibilité élevée. En raison de la substitution globale, multisite incorporation de ncAA de peptides de la cible est également réalisable. En revanche, la méthode peut ne pas convenir pour le remplacement des acides aminés qui se produisent fréquemment dans le produit du gène cible. En principe, postes non désirés peuvent être modifiés par mutagenèse dirigée, mais ces modifications supplémentaires pourraient également affecter plusieurs propriétés AMP, y compris la structure et la bioactivité. Une fois une souche auxotrophe pour la production disponible, plusieurs ANAC peut être testé sans nécessiter de modifications importantes sur le plan génétique. En outre, la méthode n’est pas limitée à auxotrophes e. coli souches, mais peuvent également être effectuées à l’aide de l’hôte de production naturelle. Par exemple, Zhou et coll. ont montré que SPI pour la production de nouveaux RiPPs travaille également le naturellement Trp-auxotrophe L. lactis: l’utilisation définie des médias, trois analogues de tryptophane ont été incorporées aux quatre positions dans la nisine50.
Étant donné que la méthode SPI conduit à un remplacement global de l’Elu cAA de la ncAA, il est généralement applicable à un large éventail de cibles peptides et protéines. Une gamme d’auxotrophes e. coli souches est disponible (voir étape 1), permettant plusieurs cAAs chaque à tester pour le remplacement de l’ANAC. A rencontré analogues incorporés à l’aide de metA-souches déficients (par exemple, B834(DE3)) sont plus couramment employées. Exemples d’isostructuraux Met analogues sont azidohomoalanine (Aha) et homopropargylglycine (Hpg), ANAC commercialement disponible qui peut être intégré de manière efficace. Les deux introduisent bioorthogonal poignées qui permettent la fixation des molécules transportant un alcyne compatible ou la fonctionnalité de l’azoture, respectivement. Par exemple, les colorants fluorescents ou moitiés de polyéthylène glycol (PEG) peuvent être attachées en cuivre (I)-catalysée de l’azoture alcyne cycloaddition (CuAAC)51.
Bien que les deux méthodes d’incorporation de ncAA recombinante (SPI et SCS) généralement obtenir des quantités suffisantes de cible, les rendements sont souvent réduits par rapport au type sauvage production des protéines et des peptides correspondants. Comme souvent, les puretés sont corrélés à l’efficacité de production, étapes de purification supplémentaire peuvent être nécessaires, surtout pour les espèces peu abondantes. Dans ce cas particulier de la production de la nisine recombinant, la séquence His-tag simplifie grandement la purification RiPP par enrichissement sélectif des lysats cellulaires. La purification montrée dans ce protocole améliore la pureté et la concentration de la nisine, mais ne donne pas souvent de puretés AMP suffisantes pour déterminer le rendement et l’activité spécifique. En plus de l’IMAC, méthodes de purification des AMP couramment utilisées incluent HPLC, chromatographie échangeuse d’ions (IEC) et les précipitations (par exemple. à l’aide d’acétone ou l’acide trichloracétique (TCA)) ou une combinaison - résultant en un système de purification multi-étapes52 . Il est à noter que leur communément polycationiques nature peut faciliter la purification de la CEI. Lyophilisation est fréquemment utilisée pour stocker des amplis purifiées.
Idéalement, ANAC pour incorporation dans ampères devrait être disponible dans le commerce à des prix abordables ou facilement produites par les protocoles de synthèse chimique simple et reproductible. Une condition tout aussi importante pour la méthode SPI est que la ncAA est reconnu, activé et pratiqués sur l’ARNt apparenté par les RAA endogènes ou conjointement exprimées. Cela peut être testé in vitro par acide aminé activation ou ARNt aminoacylation dosage53. Comme une alternative simple, expressions de test SPI de protéines de modèle comme la protéine fluorescente verte (GFP) menée tous les deux en présence et en absence de supplémentation en ncAA peuvent être réalisées. En outre, solubilité dans la perméabilité moyenne et cellules de croissance ainsi que stabilité chimique constituent des facteurs importants.
Dans cet exemple, une activité antimicrobienne a été projetée à l’aide d’une souche de bactéries Gram-positives indicatrice. Comme il exprime la peptidase chef NisP, l’étape finale de la maturation de la nisine est catalysée. Suppression de la séquence de tête (son marqués à des fins de purification) peut également être réalisée in vitro par traitement avec purifiée NisP50 ou la trypsine54. Au-delà de la portée de ce travail, des organismes pathogènes et des souches multirésistantes peuvent ensuite être testés pour l’inhibition bactériostatique ou bactéricide par SAP en utilisant une méthodologie similaire. Espèces cibles cliniquement pertinents comprennent la SARM, MDR, Mycobacterium tuberculosis, ERV, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae. Outre la diffusion de plaques de gélose test présenté ici, croissance inhibition peut également être effectuée à l’aide des milieux liquides appropriés inoculés avec l’espèce bactérienne et additionné de AMP. À l’aide de méthodes de dilution en bouillon, la concentration minimale inhibitrice (CMI) peut être déterminée à l’aide de peptides pure55. Le dosage de l’activité présenté ici permet également d’estimer la bioactivité et la puissance des solutions contenant de l’AMP par rapport aux composés de référence, la nisine par exemple disponible dans le commerce.
Production par recombinaison génétique de RiPPs est souvent faisable39, qui comprend généralement la co-expression de gènes PTM. Dès que la souche de production est transférée dans un milieu minimal chimiquement défini ou synthétique contenant une ncAA adapté, le remplacement de résidus spécifiques de la cAA correspondant a lieu. Ainsi, autres RiPPs peuvent être produites par la même méthode, pourvu que leur production recombinante est réalisable et conditions se retrouvent lorsque l’incorporation de la ncAA et PTM rendement une quantité suffisante de produit cible. Notez qu’outre le protéome de cellule hôte, la machinerie PTM peptide peut aussi devenir ncAA modifiés au cours de SPI. En conséquence, le moment de l’induction d’expression cible et de la durée de la période d’incubation suivant peuvent exiger optimisation. Étant donné que l’incorporation de ncAA dans les enzymes PTM peut affecter leur stabilité et leur activité, la production de la RiPP transformé peut en principe être affectée. Suffisante efficacité enzymatique PTM est indiquée par la formation de prépeptide transformé, tel que détecté par MS et bioactivité des essais. Tel que présenté ci-dessus, différents promoteurs inductibles pourraient être employées pour produire le PTM gènes tout d’abord (en l’absence de la ncAA) suivie de l’induction du gène peptide précurseur en présence de la ncAA. En général, la production du peptide cible cAA-contenant doit être supprimée avant l’addition de la ncAA, c’est pourquoi la répression serrée du gène précurseur est requise. Dans ce protocole, ceci est réalisé par la répression catabolique par l’addition de glucose dans le milieu de croissance. Surtout depuis que les enzymes PTM requises pour le traitement prepeptide proviennent habituellement d’un hôte génétiquement éloigné, utilisation de température et codon d’expression des gènes correspondants peut nécessiter l’optimisation si production recombinante n’a pas encore été mis en place. En principe, la présence de l’ANAC dans le prépeptide peut interférer avec la reconnaissance et le traitement des enzymes PTM, dans le cas de la nisine, NisBC et NisP. Pour l’incorporation de ncAA dans SAP, il est donc recommandé d’effectuer des expériences à petite échelle expression tout d’abord pour identifier les conditions de l’expression appropriée et la fiabilité du test de l’activité de l’AMP.

La découverte des antibiotiques dans le XXe siècle et le développement parallèle de nouveaux composés antimicrobiens contre les microorganismes pathogènes activées ciblée traitements des infections bactériennes. Cependant, en raison de l’émergence de pathogènes multirésistants comme résistant à la méthicilline Staphylococcusaureus (SARM), les entérocoques résistant à la vancomycine (ERV), MDR (pharmaco-résistante) Salmonella typhimurium phage type 10 (DT10 ), et Klebsiella pneumoniae, il est urgent générer de nouveaux agents antimicrobiens1. Peptides antimicrobiens (ampères) sont des composés polyvalents, souvent très spécifiques qui sont prometteurs pour le développement de nouveaux médicaments grâce à leurs propriétés physico-chimiques, flexibilité, taille, hydrophobie et mode d’action2. Ampères sont de petits peptides se compose habituellement d’acides aminés 7-100. Souvent, ils ont une structure cationique riche en résidus chargés positivement d’arginine et la lysine, qui interagissent avec la membrane cellulaire microbienne ciblée, qui est chargée de façon opposée3. Un sous-groupe particulier des amplis sont des peptides ribosomally synthétisés et après modification (RiPPs)4. Elles sont produites par nombreux organismes du Royaume des champignons et du domaine des bactéries. L’un des plus connus et largement utilisés RiPPs est la nisine, naturellement produite par la bactérie lactique acide Lactococcus lactis (L. lactis). Active contre un groupe de bactéries à Gram positif, la nisine a été utilisée comme un biopreservative dans l’industrie alimentaire depuis plus de 50 ans en raison de ses propriétés antimicrobiennes et l’absence de résistance évoluée dans les souches microbiennes ciblées5. Études ont montré que la nisine déstabilise et génère des pores dans les membranes cellulaires bactériennes, conduisant à une activité antimicrobienne contre les deux agents pathogènes Gram-positifs et Gram-négatives6. En se liant au lipide II, synthèse de la paroi cellulaire bactérienne est inhibé7. La nisine est codée par CSRN comme un peptide précurseur linéaire, qui est composé d’un chef de file et une région de peptide de base (Figure 1). Après la synthèse ribosomique, prenisin modifie tout d’abord le déshydratase NisB. Ici, les résidus sérine et thréonine dans la région de noyau prepeptide sont déshydratés à dehydroalanine (Dha) et dehydrobutyrine (Dhb)8. Par la suite, les résidus déshydratés sont couplés avec la cystéine à anneaux lanthionine forme (d'où le nom « lantibiotique » pour lanthionine anneau contenant antibiotiques) par une addition de Michael catalysées par les enzymes. Cette modification post-traductionnelle (PTM) est catalysée par l’adénylcyclase NisC. Chez L. lactis, le mis à jour le prenisin est ensuite transporté hors de la cellule par transporteur NisT et peptide leader est clivé par la protéinase NisP pour libérer la nisine mature et active forme9. La peptidase de dirigeant responsable NisP a une spécificité de substrat élevé, puisqu’il uniquement les processus modifiés nisine efficacement10.
En général, RiPPs actives résultent de l’action des enzymes PTM (par exemple NisBC), qui augmentent considérablement l’espace chimique des peptides courts, par exemple, par acétylation, glycosylation, méthylation ou phosphorylation. Ce niveau de complexité peut être étoffé par l’incorporation directe de l’ANAC. Alors que souvent c’est possible, la synthèse chimique des amplis est un défi pour une production à grande échelle en raison de leur complexité structurelle. Par exemple, la synthèse chimique totale de la lactosin lantibiotique S dans 71 étapes réactionnelles a été atteint avec un rendement final de 10 % et celui de la nisine avec un rendement brut de seulement 0,003 %11,12. Par conséquent, la production biologique offre une alternative viable, en raison de la génération de stéréocentres correcte et de la concentration élevée du produit.
Jusqu'à aujourd'hui, plus de 150 ANAC, par exemple, avoir des groupes fonctionnels contenant du fluor ou azotures, ont été incorporés dans les protéines recombinantes, et plusieurs exemples des amplis ncAA modifiés ont été déclarés13,14, 15,16. Avec l’introduction de l’ANAC, nouvelles propriétés physico-chimiques peuvent être générées par rapport à la mutagenèse classique. La diversité des peptides existants peut être augmentée, pouvant conduire à nouveaux antibiotiques.
Une méthode pour l’incorporation de l’ANAC recombinants peptides est incorporation de pression sélective (SPI) fondée sur l’utilisation de souches de bactéries auxotrophes17. Ces souches ne sont pas capables de synthétiser l’analogique cAA correspondant de la ncAA. La méthode utilise la spécificité de substrat détendue fréquemment observées, une caractéristique de nombreux naturel aminoacyl-ARNt synthétases (aaRSs)18. En dehors de leurs substrats naturels de la cAA, ces enzymes sont souvent capables de reconnaître et d’activer la ncAA désiré et de le charger sur leurs tRNA(s) apparentés. Cela conduit à ribosomique incorporation de la ncAA dans le produit du gène cible de façon spécifique de résidus (c.-à-d., cAA → ncAA substitution). C’est bien sûr possible seulement lorsque la ncAA désirée est structurellement et chimiquement similaire à l’acide aminé canonique et toléré par la physiologie cellulaire, de la machinerie de traduction et de la séquence cible de peptides ou de protéines. Dans un montage expérimental particulier, les cellules auxotrophes hôtes sont cultivées en milieu défini fourni avec une concentration limite de l’acide aminé natif soit substitué. La croissance cellulaire ou l’échange par un milieu sans cAA entraîne une déplétion intracellulaire de la cAA. Dans l’étape suivante, la ncAA est ajouté et l’expression du gène cible est induite. Inévitablement, ANAC est maintenant également incorporées dans plusieurs autres protéines dans la cellule hôte au cours de cette phase d’expression du gène cible. Néanmoins, la toxicité de l’installation SPI est maintenue à un niveau faible, puisque la souche d' Escherichia coli (e. coli) est transformée avec un plasmide porteur du gène cible sous contrôle d’un promoteur fort (généralement très compétitif T7 promoteur / Système de RNA polymérase)19. Immédiatement après l’induction (généralement lorsque la cAA est épuisé), l’hôte les cellules cessent de se développer et leurs mécanismes enzymatiques cytoplasmiques sont utilisés principalement pour l’expression du gène cible axée sur le plasmide. Mutagenèse dirigée peut être utilisé pour définir l’ou les lieux de l’installation de ncAA de résidus spécifiques du gène de cible20.
Comme un peptide de modèle pour l’incorporation de l’ANAC, la nisine de AMP pentacyclique A a été choisie. C’est 34 acides aminés et a seulement un résidu proline unique dans la séquence peptidique de base (Figure 1). Comme dans la subtilisine, ericin A et S et utilise aussi bien comme dans la nisine Z et la nisine Q, la proline conservée semble être essentielle pour l’activité9,21. La proline cAA joue un rôle particulièrement important dans la rotation amide peptidyl-prolyl et stabilisation de la structure secondaire. Sa chaîne latérale bague conformations (exo / endo fronce) sont responsables d’une stabilisation thermodynamique de la liaison amide. Modifications chimiques ciblées (par exemple hydroxylations, fluorinations, méthylations) de prolyl fronces influencent souvent critique stabilité, rigidité de l’échafaudage et de fonctions de nombreuses structures biologiques22pliant. Ainsi, il est plausible d’attendre que les substitutions analogiques de proline Pro→ vont doter l’anneau B, le deuxième cercle de nisine, avec roman et propriétés inhabituelles.
Ici, une proline-auxotrophes souche e. coli a été utilisée pour la production de la nisine recombinant. Cela nécessite l’expression de la prepeptide gène CSRN ainsi que la modification de gènes enzyme nisBC. Le produit de peptide codé génétiquement transporte un leader en position N-terminale His-tag pour purification par chromatographie d’affinité sur. Pour la détermination de l’activité, L. lactis exprimant et sécrétant des NisPT est utilisé pour activer les variantes de la nisine recombinante de lysats de cellules d’Escherichia coli ou des échantillons de peptide purifié (Figure 1). L’AMP mature est sorti après clivage du leader NisP. Dans cette méthode de diffusion en gélose, l’échantillon de AMP diffuse dans le milieu de croissance solide et peut inhiber la croissance des microorganismes Gram positif. Après incubation, cela peut être observée visuellement par les halos de l’inhibition de la croissance. En plus de L. lactis comme indicateur, modifié la nisine variantes ont montré une activité antimicrobienne contre Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus et Lactobacillus johnsonii 21,,23.
Une méthode alternative et expérimentalement différente d’incorporer l’ANAC dans RiPPs est stop codon suppression (SCS)24. Pour ce faire, un ARNt orthogonale / paire d’aminoacyl-tRNA synthétase (RAA) est nécessaire pour la ncAA correspondante. Idéalement, tous ces trois composantes sont bioorthogonal, c'est-à-dire qu’ils n’interagissent pas avec le tRNA endogènes et les aaRSs. Un RAA ncAA spécifiques peut être généré par la modification du site actif de l’enzyme et de criblage des bibliothèques génétiques mutantes synthétases25. En outre, l’introduction d’une ncAA exige un codon qui est réassigné et qui n’encode pas le CAA. Le codon ambre est généralement utilisé24,26.
Récemment, SPI a été créé pour l’incorporation de l’ANAC contenant du α-chloroacétamide et clic-chimie-compatible NisA27. Par exemple, Nε- alloc-lysine a été incorporé dans le captistruin de peptide de lasso avec in situ (SCS) et méthodes d’incorporation de résidus spécifiques (SPI) et par la suite modifié in vitro par métathèse de ruthénium catalyse28 . En comparaison avec SPI, la méthode SCS est plus compliquée depuis un ARNt orthogonale / aaRS paire doit être exprimée conjointement. A ce jour, o-paires pour l’incorporation de la proline ont été développés29, mais au mieux de notre connaissance, aucun exemple d’incorporation analogiques de la proline n’a été signalée.
Il est à noter que pas tous ANAC peut être incorporé en utilisant la méthodologie SPI. Tout d’abord, l’absorption de l’ANAC dans le cytoplasme est régie par une multitude de protéines de transport qui sont incorporées dans la membrane cytoplasmique, qui est la membrane interne des bactéries à Gram négatif comme Escherichia coli. Normalement, les e. coli est capable de transporter une large gamme d’analogues d’acides aminés dans la cellule avec des chaînes latérales structurellement et chimiquement similaire à canonique des acides aminés. Deuxième, nombreux ANAC chimiquement réactives ou instable pourrait agir comme un inhibiteur de la croissance cellulaire, car ils sont toxiques pour le métabolisme et la physiologie de l’hôte cellule30. Ainsi, l’absorption et la toxicité de la ncAA pour l’hôte de production doivent être testés au préalable. Pour éviter l’inactivation de la machinerie PTM comme un effet secondaire, une installation d’expression strictement contrôlée des gènes responsables peut être utilisée pour intégrer les enzymes de modification (par exemple, nisBC) de l’acide aminé naturel et la ncAA dans le gène cible ( par exemple, nisA). Ceci peut être accompli à l’aide de deux promoteurs différents et l’induction de l’expression du gène cible, comme le montre spécialement conçu de protocoles SPI31. Comme indiqué ci-dessus, la méthode SPI s’appuie sur la spécificité de substrat détendue de l’aaRS, qui permet pour l’activation de la ncAA et apparentés tRNA de charge. Par la suite, l’ARNt est distribué dans le ribosome, suivie de la formation de la liaison amide et pliage du peptide cible (poly). Dans ce processus, correction d’épreuves et de mécanismes d’édition peuvent devenir pertinente32. Pour ces raisons, il est très important d’avoir une cible en ncAA structurellement et chimiquement semblable à la cAA. Autres points cruciaux sont une stabilité suffisante (tant dans les milieux de culture et exposés au métabolisme cellulaire) et la solubilité de la ncAA. En outre, il devrait être soit disponible commercialement ou facile à être synthétisé chimiquement.
Nous décrivons ici un protocole pour SPI, permettant l’incorporation de résidus spécifiques d’ANAC dans RiPPs recombinant. En particulier, analogues de différents proline sont incorporés dans la nisine peptide antimicrobien A comme organisme hôte à l’aide d’e. coli . Spectrométrie de masse est utilisée pour vérifier le remplacement de l’acide aminé et produits peptidiques sont analysées à l’aide de tests d’inhibition de la croissance et la microscopie de fluorescence à l’aide de souches microbiennes indicatrices de bioactivité.
L’exigence fondamentale d’expression nisine recombinant réussie avec une définition ANAC nécessite une proline adapté auxotrophe souche e. coli . Pour cela auxotrophie, proA doit être dysfonctionnelle, par exemple obtenus par knock-out génomique. Cellules entièrement privé de biosynthèse de Pro intracellulaire (c'est-à-dire la suppression des proABC) sans possibilité de réversion sont stables auxotrophes. Gène couramment knockout méthodes sont monogéniques opercule selon Datsenko & Wanner33ou transduction du phage. En outre, souches de proA knockout peuvent provenir de dépôts publics tels que Addgene, CGSC ou la collection de Keio. Puisque l’expression recombinante nisABC montrée ici repose sur l’utilisation de promoteurs T7, l’expression hôte possède transporter un gène inductible de l’ARN polymérase T7. Ceci peut être accompli par introduction dans le génome de l’hôte, par exemple à l’aide de la trousse commerciale du prophage λDE3. Alternativement, des souches comme BL21 (DE3) peuvent être faits auxotrophes comme décrit ci-dessus.

<table><tbody><tr><td>chlorure de sodium</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrate de guanidine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>0035.2</td><td></td></tr><tr><td>hydrogénophosphate dipotassique</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>P749.3</td><td></td></tr><tr><td>dihydrogénophosphate de potassium</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3904.3</td><td></td></tr><tr><td>dihydrogénophosphate de sodium monohydraté</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>hydrogénophosphate disodique</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>L-alanine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3076.2</td><td></td></tr><tr><td>L-arginine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3144.3</td><td></td></tr><tr><td>L-asparagine monohydrate</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>HN23.1</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-aspartique</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>T202.1</td><td></td></tr><tr><td>L-cystéine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3467.3</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3772.1</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-glutamique</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3774.1</td><td></td></tr><tr><td>L-glycine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3187.3</td><td></td></tr><tr><td>L-histidine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3852.3</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3922.3</td><td></td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3984.3</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine monohydrate</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>4207.2</td><td></td></tr><tr><td>L-méthionine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>9359.4</td><td></td></tr><tr><td>L-phénylalanine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>4491.2</td><td></td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>T205.3</td><td></td></tr><tr><td>L-sérine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>4682.4</td><td></td></tr><tr><td>L-thréonine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>T206.2</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptophane</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>4858.2</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrosine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>T207.2</td><td></td></tr><tr><td>L-valine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>4879.4</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3746.3</td><td></td></tr><tr><td>magnésium sulfate</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>0261.2</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>6780</td><td>préparer une solution à 20 % (p/v) pour l’ajouter dans de la gélose fondue</td></tr><tr><td>chlorure de calcium</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>PN93.2</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de fer(II)</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>372870</td><td></td></tr><tr><td>chlorhydrate de thiamine</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>biotine</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3822.2</td><td></td></tr><tr><td>sulfate de cuivre(II)</td><td>Merck, Allemagne</td><td>102792</td> chlorure de <td></td></tr><tr><td>manganèse(II)</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>KK36.2</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de zinc</td><td>Merck, Allemagne</td><td>108816</td><td></td></tr><tr><td>orthomolybdate d’immonium</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>277908</td><td></td></tr><tr><td>glycérol</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>7533.3</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>ampicilline sel sodique</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>K029.5</td><td>concentration de travail 100 &micro ; g/mL pour E. coli, préparer une quantité de 100 mg/mL dans du sulfate de kanamycine ddH2O</td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>T832.2</td><td>concentration de travail 50 &micro ; g/mL pour E. coli, préparer une quantité de 50 mg/mL dans du chloramphénicol ddH2O</td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3886.1</td><td>concentration de travail 5 &micro ; g/mL pour L. lactis, préparer une quantité de 37 mg/mL dans de l’éthanol</td></tr><tr><td>(4S)-fluoroproline</td><td>Bachem, Suisse</td><td>F-3970</td><td></td></tr><tr><td>(4R)-fluoroproline</td><td>Bachem, Suisse</td><td>F-3975</td><td></td></tr><tr><td>(4S)-hydroxyproline</td><td>Bachem, Suisse</td><td>F-1395</td><td></td></tr><tr><td>(4R)-hydroxyproline</td><td>Bachem, Suisse</td><td>F-2980</td><td></td></tr><tr><td>(4S)-méthanoproline</td><td></td><td></td><td>synthétisé chimiquement</td></tr><tr><td>(4R)-méthanoproline</td><td></td><td></td><td></td></tr> acide <tr><td>chlorhydrique (HCl)</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>P074.4</td><td></td></tr><tr><td>éthanol</td><td>VWR, Allemagne</td><td>20825.324</td><td></td></tr><tr><td>M17-bouillon</td><td>Sigmal-Aldrich, Allemagne</td><td>56156</td><td>produit commercial, voir Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6) :807-13 pour le contenu et la préparation</td></tr><tr><td>de l’agar-agar</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>Nisine de Lactococcus lactis&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>N5764</td><td>produit commercial, peut être utilisé comme référence pour la bioactivité</td></tr><tr><td>du diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>imidazole</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>3899.3</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL flacon d’échantillonneur automatique pour LC-MS</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>Supelco 854165</td><td></td></tr><tr><td>acétonitrile</td><td>VWR, Allemagne</td><td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA pour LC-MS, 83642</td><td>grade LC-MS requis</td></tr><tr><td>acide formique</td><td>VWR, Allemagne</td><td>HiPerSolv CHROMANORM pour LC-MS, 84865</td><td>grade LC-MS requis</td></tr><tr><td>1 mL Colonne IMAC Ni-NTA, par exemple HisTrap FF Crude</td><td>GE Healthcare, UK</td><td>29-0486-31</td><td>différents fabricants et résines disponibles pour IMAC</td></tr><tr><td>0.45 & micro ; Unité de filtration pour bouteilles m</td><td>VWR, Allemagne</td><td>10040-470</td><td>filtration stérile des solutions à l’aide d’une pompe à vide</td></tr><tr><td>0,45 & micro ; m filtre à seringue Membrane PVDF</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>CCY1.1</td><td>filtration stérile des solutions à l’aide d’une seringue et pour éliminer les particules des lysats cellulaires</td></tr><tr><td>seringue luer-lock, PP, 50 ml</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>T552.2</td><td>filtration stérile des solutions&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes Eppendorf de 1,5 mL</td><td>Eppendorf, Allemagne</td><td>30120086 boîtes de</td><td></td></tr><tr><td>Pétri (polystyrène, stérile)</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>TA19</td><td></td></tr><tr><td>Rouge du Nil</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>72485</td><td></td></tr><tr><td>E. coli & Delta ; souche proA</td><td>CGSC, collection Keio</td><td>JW0233-2</td><td>proline-auxotrophe E. coli K-12 souche</td></tr><tr><td>E. coli B834(DE3)</td><td>Novagen (Merck), Allemagne</td><td>69041</td><td>méthionine-auxotrophe E. coli souche B</td></tr><tr><td>&lambda ; DE3 Kit de lysogénisation</td><td>Novagen (Merck), Allemagne</td><td>69734-3</td><td></td></tr><tr><td>Lactococcus lactis NZ9000 souche bactérienne indicatrice pNG nisPT</td><td></td><td></td><td>, voir Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890</td></tr><tr><td>centrifugeuse de paillasse pour tubes Eppendorf de 1,5 mL</td><td>Eppendorf, Allemagne</td><td>5427 R</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>GE Healthcare, Royaume-Uni</td><td>P1</td><td></td></tr><tr><td>Système FPLC</td><td>GE Healthcare, Royaume-Uni&</td><td>Auml ; kta Purifier 10 ou similaire</td><td></td></tr><tr><td>microscope inversé</td><td>Nikon</td><td>TI Eclipse microscope à fluorescence grand champ&nbsp ; avec objectif 100x (N.A. 1.4) et lampe à mercure</td><td>exemple de configuration pour la microscopie à fluorescence</td></tr><tr><td>Caméra CCD multiplicatrice d’électrons (EMCCD)</td><td>Andor Technologies, UK</td><td>Andor Luca&nbsp ;</td><td>Exemple de configuration pour la microscopie à fluorescence</td></tr><tr><td>filtre d’excitation de fluorescence</td><td>Thorlabs, États-Unis</td><td>Cube dichroïque (TLV-U-MF2-TRITC)</td><td>exemple de configuration pour la microscopie à fluorescence</td></tr><tr><td>Filtre d’émission de fluorescence</td><td>AHF Analysentechnik, Allemagne</td><td>T 560 LPXR</td><td>exemple de configuration pour la microscopie à fluorescence</td></tr><tr><td>24 x 60 mm</td><td>Carl Roth, Allemagne</td><td>LH26.1</td><td>exemple de configuration pour la microscopie à fluorescence</td></tr><tr><td>Huile d’immersion</td><td>Carl Zeiss, Allemagne</td><td>Immersol 518 F</td><td>exemple de configuration pour sonde de microscopie à fluorescence</td></tr><tr><td></td><td>Bandelin, Allemagne</td><td>Sonopuls HD3200 avec sonotrode MS-72</td><td>200 W sortie HF maximale</td></tr><tr><td>Colonne HPLC C5 (2,1 x 100 mm, 3 & micro ; m taille des particules)</td><td>Sigma-Aldrich, Allemagne</td><td>567227-U</td><td>exemple de configuration pour la spectrométrie de masse</td></tr><tr><td>ESI-TOF couplé au système HPLC</td><td>Agilent, États-Unis</td><td>Agilent 6530 QTOF de masse précis avec 1260</td><td>Exemple de configuration pour la spectrométrie de masse</td></tr></tbody></table>

peptides antimicrobiens produites par l’incorporation de la pression sélective d’amino-acides non canoniques

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

La nature a une variété de possibilités pour créer de nouvelles fonctions de la protéine en modifiant la séquence des éléments constitutifs des acides aminés individuels. Cependant, toutes les variantes sont basées sur les 20 acides aminés canoniques (cAAs). Comme un moyen d’introduire davantage de propriétés physico-chimiques des polypeptides, l’incorporation des acides aminés non canoniques (ANAC) est plus utilisée dans l’ingénierie des protéines. En raison de leur longueur relativement courte, la modification des peptides synthétisés ribosomally et modifiées post-traductionnellement par ANAC est particulièrement intéressante. Nouvelles fonctionnalités et poignées chimiques peuvent être générées par des modifications spécifiques des résidus individuels. La méthode d’incorporation (SPI) de pression sélective utilise des souches auxotrophes hôte qui sont privés d’un acide aminé essentiel dans les milieux de culture définis chimiquement. Plusieurs analogues d’acides aminés structurellement et chimiquement similaires puis peuvent être activées par le correspondant aminoacyl-ARNt synthétase et fournissent des résidus spécifiques cAA(s) substitutions ncAA(s) → dans la séquence cible de peptides ou de protéines. Bien que, dans le cadre de la méthode SPI, ANAC est également incorporées dans le protéome hôte pendant la phase d’expression du gène recombinant, la majorité des ressources de la cellule est assignée à l’expression du gène cible. Cette mesure efficace axée sur les résidus incorporation d’ANAC souvent accompagnées de fortes quantités de cible modifiée. Le travail présenté décrit l’incorporation in vivo des six analogues de proline dans la peptide antimicrobien nisine, un lantibiotique naturellement produite par Lactococcus lactis. Propriétés antimicrobiennes de la nisine peuvent être changées et étoffées au cours de sa fermentation et d’expression en auxotrophes Escherichia coli souches dans les milieux de culture définis. Ainsi, les effets des résidus spécifiques remplacement du cAAs avec ANAC peuvent livrer des changements dans la spécificité et l’activité antimicrobienne. Tests d’activité antimicrobienne et microscopie de fluorescence sont utilisés pour tester les nouvelles variantes de nisine pour l’inhibition de la croissance d’une souche témoin de Gram positif Lactococcus lactis . Spectroscopie de masse sert à confirmer l’incorporation de la ncAA en variantes de nisine bioactifs.

Ce protocole est conçu pour permettre la production de variantes de nisine modifiés ncAA avec incorporation de résidus spécifiques des analogues de la proline par la méthode SPI. Auparavant, la faisabilité et les rendements de 24 mg/L ont été signalés pour la production recombinante d’entièrement mis à jour le sauvage nisine39. À l’aide de la méthode SPI, rendements de peptides/protéines cibles sont souvent bons et peuvent atteindre quantités près de type sauvage production48. Comme les premières expériences, production RiPP par recombinaison génétique sauvage doit être testée chez l’hôte auxotrophe choisie. Ici, la proline-auxotrophes Escherichia coli MG1655 ΔproBA:: frt ΔproC:: frt (DE3) a servi de souche hôte. Pour l’incorporation de l’ANAC, culture et induction température et composition calendrier comme moyenne peuvent être optimisés vers le rendement maximal de peptide.
Dosage de l’activité antimicrobienne Purification et production de nisine recombinant de type sauvage ont été réalisées selon le protocole ci-dessus. Dans ce cas, la proline a été utilisé au lieu de ses dérivés en ncAA à l’étape 3.6. Un dosage de l’activité antimicrobienne a été utilisé pour vérifier la production RiPP et de comparer l’activité antimicrobienne avant et après la purification. Pour le dosage de l’activité, élution fractions et accréditives IMAC ont été utilisés directement et testés contre la souche indicatrice de Gram positif L. lactis (Figure 2). Comme cette souche exprime NisP, les variantes de la nisine contenues dans les lysats de cellules d’Escherichia coli ou des échantillons de peptide purifié, deviennent respectivement, activées par clivage protéolytique du peptide leader. Evidemment, le cheminement a montré une activité inhibiteurs de croissance. Cela peut s’expliquer par matériau bioactif ne lie pas à la colonne de l’IMAC. Les fractions d’élution testé tous ont montré une activité accrue par rapport à l’échantillon non-purifié, ce qui indique une concentration du peptide His marqués par IMAC. Notez que la mémoire tampon d’élution (comme contrôle négatif) n’a pas influencé la croissance de L. lactis dans cet essai.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig2.jpg"> Figure 2 . Activité antimicrobienne d’essai après que purification IMAC d’inoculation produit sauvage nisine. D’élution fractions 5 à 15 et le flux par le biais de la purification de l’IMAC ont été testés en comparaison avec le lysat cellulaire non-purifié (dilué à la normalisation de600 OD) contre la souche témoin de L. lactis . La taille des halos de l’inhibition de la croissance indique une activité antimicrobienne. Chloramphénicol à une concentration de 400 µg/mL a été utilisé comme témoin positif et de la mémoire tampon d’élution IMAC comme contrôle négatif. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Pour prouver l’activité antimicrobienne d’inoculation produit nisine variantes contenant six analogues de différents proline, un dosage de l’activité a été réalisé afin de tester l’inhibition de la souche témoin de L. lactis . La figure 3 montre l’inhibition de la croissance pour cinq des six échantillons produites à l’aide d’analogues de la proline. Les meilleurs résultats (en juger des tailles de halo) ont été observées pour les expériences d’incorporation de l’analogique (4R) - fluoroproline, (4R) - hydroxyproline et (4S)-methanoproline. En comparant la taille de halo de l’inhibition de croissance à la nisine sauvage produit et testé en parallèle, toutes les trois variantes de la nisine a montré force semblable de l’inhibition. Toutefois, la taille de halo seule ne peut pas être utilisé pour évaluer une activité spécifique, étant donné que la concentration de l’AMP n’a pas été déterminée. Par conséquent, les essais servent uniquement à tester qualitativement si l’activité antimicrobienne des variantes nisine qui en résulte est conservée ou perdue. Pour déterminer l’activité spécifique, la concentration des nisine variantes doit être quantifié (voir Discussion).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig3.jpg"> Figure 3 . Analyse de l’activité antimicrobienne des lysats de cellules contenant des variantes de la nisine produite via SPI avec les analogues de la proline. Comparaison des variantes de la nisine avec échantillons recombinants de type sauvage. Tous les échantillons étaient OD600-normalisée après la lyse cellulaire par rapport à la densité de culture de cellules récoltées. Halos indiquent bioactivité sous forme d’inhibition de croissance de la souche témoin. Première rangée, de gauche à droite : (4R)-fluoroproline, (4R) - hydroxyproline, (4R) - methanoproline et le chloramphénicol (400 µg/mL ; antimicrobiens contrôle positif). Deuxième rangée : (4S)-fluoroproline, (4S) - hydroxyproline, (4S) - methanoproline et la proline (contrôle de type sauvage). Remarque la nomenclature chimique ; par exemple, (4R) - fluoroproline est également dénommé trans-4 - fluoroproline. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
LC-ESI-TOF spectrométrie de masse À la suite de purification de l’IMAC, l’incorporation de l’ANAC nisine a été analysée par spectrométrie de masse LC-ESI-TOF. La figure 4 montre les spectres de masse déconvoluées d’une variante de la nisine contenant (4R)-fluoroproline. Cette variante a été IMAC purifiée comme décrit ci-dessus et par la suite analysé par spectrométrie de masse LC-ESI-TOF, ainsi il a toujours porté le leader. Le pic principal dans la Figure 4A correspond à la nisine mis à jour le contenant (4R)-fluoroproline d’une masse déconvoluée de 6883.18 Da (masse calculée 6882.05 Da, calcule masse du peptide correspondant sauvage avec proline à la position 9 est Da 6864.06). Les deux sommets avec plus faible abondance et de la masse plus élevée correspondent à des adduits de sodium comme indiqué. Figure 4 B regroupe des espèces chargées différemment des principaux composés que l'on trouve par l’algorithme de déconvolution. Par exemple, le pic à m/z 1148.11 correspond à l’espèce chargée sextuplé ([M + 6H]6 +).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig4.jpg"> Figure 4 . LC-ESI-TOF spectrométrie de masse des variantes de la nisine recombinant purifié IMAC contenant (4R)-fluoroproline. (A) déconvolutée chromatogramme de la spectrométrie de masse (zoomé arrière dans le médaillon) pour la variante de la nisine (portant encore le leader) avec (4R)-fluoroproline (attendue des masses (Da) : [M + H]+ = 6882.05, [M + Na]+ = 6904.03, [M + 2Na]2 + = 6926.02). (B) composé des spectres pour les espèces [M + H]+. Attendus des masses (Da) : [5 M + H]+ 5 = 1377.41, [6 M + H]6 + = 1148.01, [7 M + H]+ 7 = 984.15, [8 M + H]+ 8 = 861.26, [9 M + H]+ 9 = 765.67, [10 M + H]+ 10 = 689.21, [11 M + H]+ 11 = 626.64, [12 M + H] 12 + = 574.50. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Microscopie en fluorescence Activité antimicrobienne de nisine recombinante et ses variantes contenant du ncAA peut également montrer par l’observation directe de la L. lactis indicateur souche par microscopie à fluorescence. Nil rouge, un colorant fluorescent fortement hydrophobe, a été utilisé pour colorer la membrane de la cellule bactérienne. La figure 5 illustre le changement qualitatif de l’état d’agrégation de la culture cellulaire et la morphologie de la cellule unique. Les cellules ont été colorées au rouge Nil et déposés sur une lame de microscope couverture. La rangée supérieure montre les cellules directement au début quand le buffer, nisine recombinante de type sauvage, ou contenant de la nisine (4R)-fluoroproline, ou 4R-hydroxyproline ont été ajoutés. Le panneau inférieur montre les images correspondantes au bout de 20 minutes d’incubation.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57551/57551fig5.jpg"> Figure 5 . Microscopie de fluorescence de nisine recombinant effets sur les cellules grampositives. Des images microscopiques de souche d’indicatrice 30 µL L. lactis (OD600 = 1) marqué avec Nil rouge ont été prises avant (du haut) et après (panneau inférieur) 20 min d’incubation avec 1 µL de tampon (A), 0,3 µL recombinant sauvage nisine (B) et Variantes de la nisine µL 0,6 contenant (4R)-fluoroproline (C) et (4R)-hydroxyproline (D). Cercles bleus marquent les régions avec point de flèches de cellules agrégées ou déformées, bleu aux régions où la diffusion des fragments membranaires fluorescents peut être observée. <a href="/files/ftp_upload/57551/57551fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Figure 5 A montre que l’aspect général des cellules n’a pas changé en 20 minutes d’observation. Que le nombre de cellules qui déposés durant la rose du temps et, par conséquent, une plus grande quantité de cellules sont visibles dans le 80 µm x 80 µm de la région observée. Figure 5 B montre que les cellules Gram positifs apparaissent agrégées et floue (marqués par des cercles bleus) après 20 minutes d’exposition à la nisine sauvage, même en faibles quantités (ici, élution de IMAC 0,3 µL) ont été ajoutées. En outre, matériau léger diffus des cellules dans le tampon, ce qui indique que des fragments de membrane marqués avec Nil rouges ont été mobilisés au cours de la période (indiquée par les flèches bleues). Ces résultats indiquent la lyse cellulaire, comme il a été montré à survenir après traitement avec la nisine6,49. Des effets similaires ont été observés après l’incubation avec la nisine variant contenant (4R) - fluoroproline (Figure 5C) et la nisine contenant(4R)- hydroxyproline (Figure 5D) les deux grandes montrant nombres de cellules déformées et agrégées après 20 minutes, en contraste avec l’échantillon de contrôle (Figure 5A).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Composant</td>
			<td>Concentration de</td>
		</tr>
<tr>
<td>(NH4) 2 OUI4 </td>
			<td>7,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>8. 5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>22 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4
</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tous les acides aminés canoniques (à l’exception de celui à remplacer)</td>
			<td>50 mg/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ca2 +
</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe2 +
</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo-éléments (Cu2 +, Zn2 +, Mn2 +, MoOH2 +)</td>
			<td>0,01 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thiamine</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotine</td>
			<td>10 µg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Le tableau 1. Composition du milieu de croissance bactérienne chimiquement défini NMM19 après préparation selon l’étape 2.

Le protocole présente l' Escherichia coli-basée d’incorporation de la pression sélective des acides aminés non canoniques (ANAC) dans la nisine de peptide antimicrobien lactocoques. Ses propriétés peuvent être modifiées au cours de l’expression recombinants par substitution avec désiré ANAC dans les milieux de culture définis. Les changements qui en résultent dans la bioactivité sont mappés par tests d’inhibition de la croissance et la microscopie de fluorescence.

Peptides antimicrobiens produites par l’Incorporation de la pression sélective d’amino-acides Non canoniques

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

L’objectif global de cette méthodologie est d’incorporer des acides aminés non canoniques dans des peptides antimicrobiens synthétisés par voie ribosomique. De nouveaux peptides de dénaturation sont produits, vérifiés pour la présence du ncAA et testés pour l’activité antimicrobienne à l’aide de tests de diffusion de gélose. Cette méthode peut aider à répondre à certaines questions clés dans le domaine des antimicrobiens ou des bactéries, telles que le rôle de certaines positions peptidiques dans le mode d’action ou dans le développement de la résistance.En suivant les mêmes principes de variété de froops tels que des peptides inférieurs ou peuvent être produits et la détectivité peut être testée contre des agents pathogènes tels que le SARM. Des peptides nouveaux dans la nature peuvent être produits pour le développement d’agents antimicrobiens afin de lutter contre les agents pathogènes et de surmonter les carences des médicaments antimicrobiens. Le principal avantage de cette technique est que la variété d’acides aminés non canoniques peut être testée en parallèle sans nécessiter de modifications au niveau génétique.Par conséquent, il est relativement facile de produire plusieurs peptides modifiés en parallèle. Pour commencer cette procédure, préparez 25 millilitres de milieu LB contenant des antibiotiques et un pour cent de glucose dans un erlenmeyer de 100 millilitres. Inoculez-le à l’aide d’une colonie de cellules bactériennes fraîchement transformées, ou de cellules provenant d’un stock de cellules congelées.Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 200 tr/min. Le lendemain, ajoutez 10 millilitres de culture pendant la nuit à un litre de milieu frais stérile. Mélangez et divisez la culture en deux cultures de 500 millilitres chacune dans un erlenmeyer de deux litres et incubez à 37 degrés Celsius et 200 tr/min pendant deux heures Après deux heures, mesurez la DO 600 en utilisant un milieu stérile comme blanc.Poursuivez l’incubation et mesurez la DO à intervalles réguliers jusqu’à ce que la DO 600 soit égale à 0,5. Par la suite, tirez les deux cultures bactériennes et centrifugez-les à quatre degrés Celsius et 4 500 x g pendant 15 minutes. Ensuite, versez et jetez le surnageant.Remettre en suspension la pastille de cellule dans un seau de centrifugeuse placé sur de la glace avec 20 millilitres de NMM19 contenant des antibiotiques et un pour cent de glucose. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres et centrifugez à quatre degrés Celsius et 4 500 x g pendant 10 minutes. Ensuite, mettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres du même milieu frais sur de la glace.Transférez la suspension cellulaire dans 500 millilitres de milieu frais et incubez à 30 degrés Celsius et 200 tr/min pendant une heure. Au bout d’une heure, divisez la culture en deux parties égales dans des flacons individuels, un pour chaque ncAA ou témoin respectivement. À chaque culture, ajouter la mère ncAA à une concentration finale d’un millimolaire et au témoin de type sauvage, ajouter la mère L-proline à une millimolaire.Ensuite, induisez l’expression du gène cible à l’aide d’un IPTG millimolaire. Incuber les cultures pendant la nuit à 28 degrés Celsius et 200 tr/min. Le lendemain, mesurez la DO et prélevez un millilitre de chaque culture pour les dosages d’activité.Prélevez les cellules restantes de chaque culture en les centrifugeant à plusieurs reprises à quatre degrés Celsius et 5 000 x g pendant 20 minutes. À chaque fois, retirez et jetez le surnageant jusqu’à ce que toutes les cellules aient été collectées. Conservez les pastilles cellulaires à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la purification des peptides.Pour préparer des plaques de gélose GM17, préparez d’abord une culture nocturne de cinq millilitres de la souche indicatrice à partir d’un stock de glycérol congelé dans un bouillon M17 avec un pour cent de glucose et cinq microgrammes par millilitre de chloramphénicol dans une fiole Erlenmeyer de 25 millilitres. Incuber les 30 degrés Celsius sans secouer. Le lendemain, mesurez la DO à l’aide du milieu GM17 comme blanc Ajoutez les cinq millilitres de milieu frais dans une nouvelle fiole.Inoculer à une OD 600 égale à 0,1 et poursuivre l’incubation. Au bout de deux heures, mesurez la DO à intervalles réguliers jusqu’à ce que la valeur atteigne 0,4 à 0,6. Ensuite, placez et conservez la pré-culture sur de la glace.Préparez 1,5 % de gélose en pesant 4,5 grammes de gélose dans une bouteille en verre. Ajouter 300 millilitres d’eau distillée doublement, puis mélanger et autoclaver. Préparez deux x M17 bouillon dans 300 millilitres d’eau double distillée et d’autoclave.Ajoutez un millilitre de Lactococcus lactis pré-culture à 25 millilitres de deux bouillons x M17 contenant 10 microgrammes par millilitre de chloramphénicol et deux pour cent de glucose. Ajoutez ensuite 25 millilitres de mélange de gélose fondue tiède et versez la solution dans une grande boîte de Pétri. En maintenant des conditions stériles, séchez la plaque pendant 10 à 15 minutes.Ensuite, stérilisez les extrémités d’une pipette Pasteur en verre à la flamme Une fois la pipette refroidie, utilisez son extrémité large pour créer des trous dans la gélose solidifiée. Étiquetez le fond de la boîte de Pétri pour chaque échantillon à côté de la position du trou correspondant. Pour le dosage de l’activité, prélever les échantillons d’un millilitre des cultures de production d’E. coli et les centrifuger pendant trois minutes à 7 000 x g, aspirer le milieu restant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 microlitres de tampon de phosphate de sodium par pipetage.Ensuite, sonifiez l’échantillon sur de la glace en immergeant l’extrémité de la sonde sonicatrice dans la suspension cellulaire. Lancez la sonication. Ensuite, centrifugez le lysat cellulaire pendant 10 minutes à 13 000 x g pour granuler les débris cellulaires.Transférez le surnageant dans un nouveau tube de réaction sur de la glace. Diluer et normaliser les surnageants à un millilitre d’une OD 600 égale à 0,6, par rapport à la densité cellulaire récoltée, avec un tampon de phosphate de sodium et mélanger. Pour tester l’activité antimicrobienne, ajoutez 40 microlitres de l’échantillon normalisé dans le trou désigné de la gélose indicatrice.Attendez que tous les échantillons soient diffusés dans la gélose. Incuber l’assiette toute la nuit à 30 degrés Celsius. Le lendemain, prenez des photos de la plaque de gélose à l’aide d’un scanner à plat ou d’un appareil photo numérique.La taille du halo d’inhibition de croissance peut être mesurée à la main ou à l’aide d’un logiciel. Pour la microscopie à fluorescence, préparer une solution mère de 10 millimolaires de rouge du Nil dans du DMSO. Pour le dosage de l’activité, la culture de la souche indicatrice à OD 600 est égale à un.Centrifugez un millilitre de la culture pendant trois minutes à quatre degrés Celsius et 5 000 x g. Ensuite, jetez le surnageant et remettez l’échantillon en suspension dans un millilitre de PBS. Ensuite, centrifugez l’échantillon et mettez-le à nouveau en suspension.Ensuite, ajoutez un microlitre de solution mère de rouge du Nil et mélangez doucement. Pour l’acquisition d’images microscopiques, ajoutez 30 microlitres de préparation cellulaire sur une lame de couverture tout en excitant à 520 nanomètres. Réglez le temps d’acquisition sur 0,2 seconde, les séries cinétiques sur 0,1 Hertz et la durée de la série sur 200 images.Ensuite, ajoutez 0,3 à 1,5 microlitre d’échantillons de lysat cellulaire ou de peptides purifiés. Surveillez et enregistrez l’émission de fluorescence à une longueur d’onde égale ou supérieure à 560 nanomètres. Stockez les séquences d’images sous forme de fichiers avi et analysez les images avec ImageJ.Cette figure montre l’inhibition de la croissance de la souche indicatrice bactérienne par des peptides antimicrobiens recombinants contenant des analogues de la proline. Dans le cadre de l’essai de diffusion de la soudure sur gélose, des halos d’inhibition deviennent visibles autour des positions de l’échantillon. Cette vidéo montre la microscopie à fluorescence en accéléré de la souche indicatrice sans ajout de peptides antimicrobiens.Au fil du temps, des cellules bactériennes se déposent sur la lame de couverture puisque seul un tampon a été ajouté, l’apparence des cellules ne change pas dans les 20 minutes d’observation. Ce time lapse de microscopie à fluorescence montre les effets d’un peptide antimicrobien sur les cellules de la souche indicatrice. Au fil du temps, les cellules bactériennes apparaissent agrégées et floues après l’exposition à une variante de la nisine contenant l’acide aminé non canonique 4R hydroxyproline, comme le souligne la flèche.Marqué par des cercles, la matière lumineuse se diffuse des cellules dans le tampon, indiquant que des fragments de membrane ont été mobilisés. Cette figure montre les effets après incubation de la souche indicatrice en présence de nisine de type sauvage ou de variants contenant des acides aminés non canoniques. Après l’exposition au peptide antimicrobien, les cellules bactériennes s’agrègent comme indiqué par les cercles.Indiquant les lysats cellulaires, la matière légère devient visible autour des cellules, comme l’indiquent les flèches. Une grande quantité de cellules déformées et agrégées sont présentes après 20 minutes d’incubation, contrairement au contrôle négatif. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre jours.Cela comprend la production de peptides modifiés au ncAA et des tests d’activité à l’aide de tests de diffusion de soudure en gélose et de microscopie à fluorescence. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser des cultures de bactéries fraîches et des milieux de croissance appropriés et de les manipuler avec soin. Pour les tests d’activité, incluez toujours les contrôles positifs et négatifs appropriés.Suite à cette procédure, d’autres méthodes de purification peptidique par chromatographie d’affinité et/ou HPLC peuvent être effectuées. La spectrométrie de masse est obligatoire pour prouver l’incorporation de l’acide aminé non canonique. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer de nouveaux peptides antimicrobiens : d’autres hôtes antibactériens ou microbiens peuvent être utilisés pour la production sur différents peptides et pour tester l’activité antimicrobienne.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’incorporer des acides aminés non canoniques dans les peptides antimicrobiens.

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Une méthode simple et générale de synthèse de peptides cycliques par irradiation par micro-ondes est décrite. Cette procédure permet la synthèse de peptides cycliques de squelette avec une collection de conformations différentes tout en conservant les chaînes latérales et les fractions pharmacophoriques, et permet donc de dépister la conformation bioactive.

Développement d&#39;un Backbone peptide cyclique Bibliothèque en tant que potentiel Antiparasitaires Therapeutics Utilisation irradiation micro-ondes

Un protocole d’expression acellulaire facile à utiliser pour l’incorporation spécifique de résidus d’analogues d’acides aminés non canoniques dans les protéines, y compris l’analyse en aval, est présenté pour des études médicales, pharmaceutiques, structurelles et fonctionnelles.

Incorporation spécifiques résidus de noncanonical acides aminés en protéines de modèle à l&#39;aide d&#39;un<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Système de transcription-traduction libre Cell-

Ce protocole vise à développer une référence pour les protéines divergentes dans un groupe qui n’a pas de critères cohérents pour la classification et la nomenclature. Cette référence facilitera l’analyse et la discussion du groupe dans son ensemble et peut être utilisée en plus de noms établis.

Créer et appliquer une référence afin de faciliter la Discussion et la Classification des protéines dans un groupe diversifié

Biologie synthétique permet l’ingénierie des protéines avec des propriétés sans précédent à l’aide de l’insertion précurseur des aminoacides non canonique. Ici, nous avons présenté comment une variante spectralement décalée vers le rouge d’un fluorophore GFP-type avec des propriétés spectroscopiques de fluorescence roman, appelée protéine fluorescente « or » (GdFP), est produite par e. coli par incorporation de pression sélective (SPI).

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Nous présentons ici un protocole pour produire des Gram négatif Escherichia coli (e.coli) sphéroplastes et Gram positif Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplastes pour visualiser clairement et rapidement caractériser interactions peptide-bactéries. Cela fournit une méthode systématique pour définir la membrane localisation et translocation des peptides.

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Cette étude présente une stratégie alternative à la méthode analogique toxique conventionnelle en identifiant les surproducteurs d'acides aminés en utilisant des marqueurs rares-codon-riches pour atteindre la précision, la sensibilité, et le haut débit simultanément.

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