Utilisation des ultrasons guidés axés sur les tissus cellulaire Implantation pour la mise en place de xénogreffes tumorales métastatiques biologiquement pertinente

L’objectif de cette méthode est d’établir des xénogreffes orthotopiques cancéreuses biologiquement pertinentes pour les études précliniques. Les cellules de neuroblastome dérivées du patient sont injectées dans la glande surrénale murine par guidage échographique sans chirurgie ouverte ni récupération prolongée. Cette méthode peut aider à répondre à des questions critiques en biologie du cancer et dans la recherche translationnelle, telles que l’étude de l’évolution tumorale, les réponses thérapeutiques dans le microenvironnement natif et les métastases.

Une telle connaissance permettrait d’améliorer considérablement la fiabilité des études précliniques et de faciliter la découverte de médicaments. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est dérivée du patient, dirigée par les tissus, efficace et fiable dans la production d’un modèle xénographe orthotopique pour la recherche sur le traitement du cancer. Sahiti Chukkapalli, technicienne supérieure et directrice de notre laboratoire, ainsi que Tina Thomas, chargée de recherche dans notre laboratoire, démontreront les étapes critiques de la procédure.

Générez une suspension de cellules cancéreuses unique dérivée d’un patient à partir de tissu tumoral à l’aide d’un kit de dissociation tumorale. Commencez par transférer environ un demi-gramme de tissu tumoral dans une boîte de culture cellulaire de 100 millimètres contenant cinq millilitres de tampon RPMI supplémenté en enzymes. Ensuite, utilisez des ciseaux et des pinces à tissus pour hacher la tumeur en petits morceaux de deux à quatre millimètres.

Pipetez le mélange tumoral dans un tube dissociateur et fermez le tube. Inversez le tube, fixez-le sur le manchon d’un dissociateur de tissus et dissociez le tissu à l’aide du programme approprié. Après dissociation, incubez la suspension de cellules tumorales sur une grille rotative à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Triturez la suspension cellulaire toutes les 15 minutes pendant l’incubation. Après l’incubation, transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et ajoutez 10 millilitres de RPMI. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 314 g pendant cinq minutes.

Après la centrifugation, retirez le surnageant et suspendez la pastille dans cinq millilitres de RPMI. Faites passer la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 microns et recueillez la solution filtrée dans un tube frais de 50 millilitres. Après avoir lavé la passoire avec cinq millilitres de média RPMI, centrifugez la suspension cellulaire à 314 g pendant cinq minutes pour recueillir une pastille.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, suspendez la pastille dans RPMI pour obtenir une concentration finale de quatre fois 10 à cinq cellules par volume de 10 microlitres. Transférez cinq microlitres de cette suspension cellulaire par injection dans un tube frais, et le même volume de matrice de membrane basale pour faire 10 microlitres de solution cellulaire pour chaque injection et placez-le sur de la glace.

Transférez la souris sur la plate-forme d’imagerie avec le côté abdominal vers le bas. Ajustez et fixez le cône nasal pour maintenir l’anesthésie à l’isoflurane. Commencez la procédure d’implantation à l’aide d’une lotion dépilatoire et d’un rasoir pour épiler le dos et le flanc d’une souris NSG correctement anesthésiée âgée de six à huit semaines.

Appliquez une pommade optique sur les yeux de l’animal pour éviter le dessèchement. Ensuite, collez la souris en place pour éviter tout mouvement involontaire. Ensuite, utilisez la visualisation par ultrasons pour identifier le foie murin, la veine cave, la rate, le rein gauche et la glande surrénale gauche adjacente.

Chargez une seringue Hamilton réfrigérée, équipée d’une aiguille de petit calibre, avec 10 microlitres de solution cellulaire. Ensuite, sous guidage échographique, insérez doucement un cathéter réfrigéré de calibre 22 à travers la peau et les muscles du dos, directement dans la glande surrénale gauche pour fournir un canal d’injection cellulaire. Retirez l’aiguille et laissez le cathéter en place.

La visualisation de la glande surrénale tout au long de l’insertion du cathéter, ainsi que de l’aiguille et de sa trajectoire, est impérative pour garantir des lésions minimales aux structures et organes environnants et réduire la morbidité murine. Ensuite, guidez la seringue à travers le cathéter situé au centre de la glande surrénale. Lorsque la seringue est guidée à travers le cathéter, il est important de maintenir la stabilité du cathéter et de regarder l’aiguille avancer.

Notez que l’aiguille elle-même s’étend sur environ deux millimètres au-delà de la terminaison du cathéter, sa position étant facilement visible à l’échographie. Injectez les cellules dans le tissu surrénalien ciblé. Laissez l’aiguille en place pendant une à deux minutes pour permettre à la matrice de la membrane basale de prendre.

Une fois que la matrice de la membrane basale a pris, retirez lentement l’aiguille, puis retirez le cathéter. Enfin, placez la souris dans une cage de récupération jusqu’à ce qu’elle retrouve une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal avant de retourner dans la cage d’origine. L’imagerie par ultrasons surveille la progression tumorale in vivo.

Cette image montre une image échographique de la glande surrénale, une semaine après l’injection. Ici, l’imagerie par luminescence d’une souris injectée dans un neuroblastome une semaine après l’injection montre des lectures non indicatives d’une greffe tumorale. Après deux semaines, l’imagerie par échographie montre la greffe tumorale et sa progression vers une zone d’environ 40 millimètres carrés.

La bioluminescence deux semaines après l’injection a montré une radiance de 10 à la septième, ce qui suggère une corrélation entre l’absorption cellulaire et la croissance tumorale et les résultats de l’échographie. L’imagerie par échographie huit semaines après l’injection a montré une croissance tumorale continue avec une mesure de surface supérieure à 100 millimètres carrés. Encore une fois, la bioluminescence a confirmé les résultats de l’échographie avec une augmentation des niveaux de radiance de 10 à neuf.

L’imagerie par ultrasons 3D de la tumeur a montré un volume supérieur à 100 millimètres cubes, la base de référence que notre laboratoire utilise pour le lancement d’essais thérapeutiques précliniques. Tumeur excisée mesurée grossièrement de plus d’un centimètre, en corrélation avec les mesures par ultrasons et les signaux de luminescence. Ce média démontre comment établir avec succès des xénographes orthotopiques surrénaliens avec des cellules de neuroblastome dérivées de patients, en utilisant le guidage par échographie.

Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en moins de 12 minutes par injection si elle est bien réalisée.