Toute monture Immunofluorescence et Quantification de follicule de souris cultivées ovaires

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des images d’ovaires entiers en culture compatibles avec la quantification automatique des follicules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la reproduction, telles que la façon dont différentes conditions interfèrent avec la forme ovarienne. Le principal avantage de cette technique est qu’elle demande moins de main-d’œuvre et qu’elle maintient l’architecture tridimensionnelle de l’orgue.

Bien que cette méthode ait été optimisée pour les ovaires de souris en culture au cinquième jour postnatal, elle peut également être appliquée à d’autres âges et tissus tels que les gonades embryonnaires ou les testicules de jeunes souris. Commencez par une surface de travail propre. Essuyez avec dix pour cent d’eau de Javel et laissez l’eau de Javel rester sur la surface de travail pendant au moins cinq minutes.

Après cinq minutes, retirez l’excès d’eau de Javel avec des serviettes en papier propres et de l’éthanol à 70 %. Nettoyez soigneusement le microscope de dissection avec de l’éthanol à 70 % et placez une serviette en papier sèche sur la platine. Enveloppez les pinces et les ciseaux propres avec une serviette en papier imbibée d’éthanol à 70 %.

Ensuite, faites 50 millilitres de milieu de culture d’ovaires dans un tube conique et réchauffez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Une fois que le milieu s’est réchauffé, préparez les plaques et les inserts en ajoutant d’abord un millilitre de milieu de culture d’ovaires à des plaques de culture tissulaire de 35 millimètres. Ajoutez ensuite environ 0,55 millilitre de milieu dans les puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits et placez un insert dans chaque puits contenant le milieu.

Assurez-vous que les membranes touchent le support. Placez les plaques de 35 millimètres et la plaque porteuse de 24 puits dans un incubateur à 37 degrés Celsius, cinq pour cent de dioxyde de carbone et d’oxygène atmosphérique. Placez ensuite une plaque chauffante à côté de la sonde de dissection et réglez la température à 37 degrés Celsius.

Si l’incubateur de culture tissulaire n’est pas proche de la zone de dissection, placez l’une des boîtes de culture tissulaire de 35 millimètres contenant un milieu de culture d’ovaires sur la plaque chauffante. Ensuite, commencez la dissection en vaporisant la femelle fraîchement euthanasiée avec de l’éthanol à 70 % et placez-le sur l’essuie-tout sec sous le microscope de dissection. Après avoir fait une incision dans la cavité abdominale, extrudez les intestins et localisez les ovaires.

Extrayez les ovaires et placez-les dans le milieu de culture dans la boîte de 35 millimètres. Une fois les ovaires disséqués, augmentez le grossissement du microscope de dissection pour mieux visualiser les ovaires et tout tissu attaché. À l’aide d’une pince à pointe fine propre, retirez tous les tissus non ovariens tels que les bourses et les tissus adipeux sans endommager les ovaires.

Ensuite, placez chaque paire d’ovaires sur un insert de culture cellulaire pré-trempé et ajustez le volume du milieu pour vous assurer qu’il est suffisant pour garder l’organe humide sans l’immerger complètement. Placez les organes explantés dans un incubateur à 37 degrés Celsius, cinq pour cent de dioxyde de carbone et d’oxygène atmosphérique. Au moment expérimental souhaité, retirez le milieu de culture d’ovaires de la plaque et fixez les ovaires cultivés sur l’insert en recouvrant le tissu d’une solution de PFA à quatre pour cent fraîchement préparée.

Scellez les bords de la plaque avec un film de paraffine pour éviter l’évaporation et placez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Rincez le mouchoir trois fois avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, stockez dans des flacons à scintillation remplis d’éthanol à 70 % à quatre degrés Celsius jusqu’à un traitement ultérieur.

Commencez la coloration en retirant l’éthanol à 70 % des flacons et en lavant le tissu fixé avec du PBS à température ambiante en agitant pendant au moins quatre heures. Après avoir retiré le PBS, ajoutez suffisamment de solution de perméabilisation pour immerger complètement les ovaires. Placer sur un agitateur orbital et incuber à température ambiante pendant quatre heures.

Remplacez la solution de perméabilisation par une solution de blocage suffisante pour immerger complètement les ovaires. Ensuite, incubez les flacons scellés à température ambiante pendant au moins 12 heures sur un agitateur orbital. Après le blocage, placez les inserts dans une plaque à 24 puits et ajoutez environ 750 microlitres de solution d’anticorps primaires en veillant à ce que les ovaires soient complètement immergés.

Placez ensuite la plaque scellée sur l’agitateur orbital et incubez pendant quatre jours à température ambiante. Après quatre jours, retirez l’anticorps primaire et ajoutez une quantité généreuse de solution de lavage. Lavez les ovaires pendant la nuit.

Le lendemain, remplacez-le par une solution de lavage fraîche et incubez sur l’agitateur orbital pendant deux heures ou plus. Après les lavages, ajoutez une solution d’anticorps secondaire. Protégez les échantillons de la lumière et incubez sur un agitateur orbital à température ambiante pendant deux jours.

Après deux jours, retirez la solution d’anticorps secondaire des échantillons et ajoutez la solution de lavage. Commencez par préparer la solution de nettoyage ScaleS0. Mélangez la solution par inversion et incubez à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Dégazez la solution de déblaiement ScaleS0. Retirez ensuite la solution de lavage des ovaires immunomarqués. Ajoutez la solution de clarification.

Couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium et remettez-la dans l’agitateur orbital. Il est extrêmement important d’être patient pendant les étapes de coloration et de nettoyage. Une fois que le tissu est devenu transparent, à l’aide d’un scalpel à pointe fine, retirez soigneusement les membranes d’insertion contenant les ovaires en culture.

Placez l’échantillon sur une lame de verre et recouvrez doucement l’échantillon avec une lamelle. Procédez ensuite à l’imagerie des échantillons sur un microscope capable de sectionnement optique. Cette image montre un ovaire postnatal du cinquième jour qui n’a pas été dégagé.

Ici, l’ovaire est montré une heure après l’ajout de la solution éclaircissante. L’ovaire commencera à devenir translucide quelques minutes après avoir été immergé dans une solution éclaircissante. La section optique des ovaires cultivés sans dégagement est possible, mais les cellules profondes du tissu ont un signal difficile à différencier du fond, ce qui empêche une bonne quantification des ovocytes.

En revanche, cette image représentative montre un échantillon clairci dans lequel la quantification de l’ovocyte dans l’ensemble de l’organe est possible. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les anticorps doivent se diffuser à travers les tissus ; Ainsi, les tissus plus épais nécessiteront un temps d’incubation plus long. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver, de colorer et d’imager des ovaires entiers.

Le texte décrit l’utilisation d’un logiciel libre, Fiji ImageJ, qui peut être utilisé pour la quantification simple des follicules. N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde et de l’azoture de sodium peut être dangereux et que des précautions telles que l’utilisation de hottes et d’équipements de protection individuelle doivent toujours être prises lors de cette procédure.