Name: Toute monture Immunofluorescence et Quantification de follicule de souris cultivées ovaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Apprenez l'immunofluorescence sur organe entier et la quantification automatisée de follicules dans des ovaires de souris cultivés. Cette technique préserve l'architecture tridimensionnelle et simplifie l'étude de la biologie de la reproduction.

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Nous remercions Rebecca Williams et Johanna Dela Cruz de l’imagerie de BRC de Cornell et Andrew Recknagel suggestions utiles et assistance technique. Ce travail a été soutenu à des instituts nationaux d’octroi de santé S10-OD018516 (à Cornell Imaging Facility), T32HD057854 à J.C.B. et R01-GM45415 à J.C.S.

L’Université de Cornell animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) a approuvé toutes les méthodes décrites ici, en vertu du protocole 2004-0038 à JCS.
1. préparation des Instruments et des milieux de Culture
<ol><li>Essuyez la zone de travail avec 10 % d’eau de Javel et laisser l’eau de Javel à rester sur l’aire de zone de travail pendant au moins 5 min. Après 5 min, retirer l’eau de Javel excès avec des serviettes en papier propre et 70 % d’éthanol (EtOH). Nettoyer le microscope à dissection avec 70 % EtOH. Remarque : Il est important que la zone de travail soit au moins semi-stérile pour éviter la contamination des cultures d’organes.</li>
	<li>Envelopper les ciseaux et pinces propres avec un essuie-tout humidifié avec 70 % EtOH jusqu’au moment de l’emploi. Remarque : Les outils de dissection idéale peuvent varier selon l’âge/la taille de l’ovaire. Les meilleurs résultats sont obtenus à l’aide d’un ciseaux dissection micro forte, deux pinces à pointe fine (numéro 5 ou 55) et un micro ciseaux iris de dissection.</li>
	<li>Dans un tube à fond conique, compléter à 50 mL de milieu de culture d’ovaire et bien au chaud dans un bain-marie à 37 ° C.<ol>
<li>Pour faire de milieu de culture ovaire4, Supplément 1 x support essentiel minimum (MEM) avec 10 % de sérum bovin fœtal (SVF), 25 mM (acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 (HEPES), 100 unités/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine, 0,25 µg/mL Amphotéricine B (p. ex., 45 mL de MEM, 5 mL de chaleur inactivé FBS, 1,25 mL de HEPES et 0,5 mL de 100 actions de x de la pénicilline, streptomycine et amphotéricine B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer les plaques et plaquettes avant la culture de l’ovaire.<ol>
<li>Sous une hotte de culture de tissus, ajouter 1 mL de milieu de culture ovaire à une plaque de culture de tissus de 35 mm.</li>
		<li>Pré-tremper insert membrane avec le milieu de culture. Ajouter des éléments multimédias suffisante, généralement environ 0,55 mL par bien, à la plaque de culture de tissus de support de 24 puits et placez une culture cellulaire insérer dans le puits. S’assurer que la membrane de l’insert ne touche le support.</li>
		<li>Préparer le nombre de plaques de 35 mm et puits avec inserts de culture cellulaire selon le nombre prévu des ovaires dans l’expérience. Placer les plaques de 35 mm contenant 1 mL de milieu de culture et de la plaque de support de 24 puits contenant des milieux de culture et d’inserts dans un 37 ° C et 5 % de CO2atmosphérique incubateur de2 O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disposer une plaque chauffante à côté de l’étendue de la dissection et de régler la température à 37 ° C. Garder un 37 ° C, 5 % de CO2 et l’incubateur de2 O atmosphérique se trouve à proximité de la salle de dissection.</li>
</ol>2. ovaire Dissection et la Culture de l’orgue
NOTE : Ovaires peuvent être disséqués à température ambiante aussi longtemps que l’exposition à la température non idéal est minime.
<ol><li>Euthanasier les souris femelles à jour après l’accouchement 5, par décapitation, un à la fois. Remarque : L’euthanasie doit être effectuée conformément aux directives IACUC présents dans l’établissement où la recherche est effectuée.</li>
	<li>Pulvériser l’animal avec 70 % EtOH. Placez l’animal sur le dessus de la serviette en papier sèche sous le microscope à dissection. Placez un plat de vitroplants de 35 mm contenant des milieux de culture ovaire près le microscope à dissection.</li>
	<li>Avec une pince ou un ciseaux iris de dissection micro, faites une incision à travers la peau de l’animal et dans la cavité abdominale, utilisation attention ne pas de couper dans les intestins. Poussez les intestins hors de la cavité abdominale et localiser les ovaires. Extraire les ovaires et les placer dans le récipient de culture de tissus de 35 mm contenant des milieux de culture.</li>
	<li>Une fois que les ovaires ont été disséqués de l’animal, augmenter le grossissement du microscope à dissection afin de mieux visualiser les ovaires et une gencive attachée. Avec nettoyer pinces à pointe fine, retirer tous les tissus non-ovarienne, tels que la bourse et le tissu adipeux. Veillez à garder les ovaires intact lors du retrait de la gencive attachée non-ovarien.</li>
	<li>Une fois que les ovaires sont isolés, placez la paire dans les inserts de culture cellulaire préalablement trempés de la plaque de support 24 puits (se référer aux étapes 1.4.2 et 1.4.3) et régler le volume du milieu pour s’assurer qu’il est suffisant pour garder l’organe humide (sans complètement immergeant). ATTENTION : Veillez à ne pas pousser un trou dans la membrane de l’insert de culture cellulaire lorsque vous transférez les ovaires.</li>
	<li>Place explantées organes dans un 37 ° C et 5 % de CO2atmosphérique incubateur de2 O.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.1-2.6 jusqu'à ce que les ovaires de chaque animal sont disséqués et placées sur la culture de cellule insérer de la plaque 24 puits contenant le milieu de culture des ovaires.</li>
	<li>Changement du milieu de culture ovaire tous les 2 jours, à l’aide de réchauffé aliquotes de médias ovaire d’un bain-marie à 37 ° C et procéder à la partie 3 du protocole à l’endroit désiré temps expérimental.</li>
</ol>3. Fixation du tissu
<ol><li>Dans un tube conique de 15 mL, préparer 4 % paraformaldéhyde (PFA) dans 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (par exemple, ajouter 2 mL de 16 % grade PFA au microscope électronique à 6 mL de PBS 1 x). ATTENTION : PFA est une substance dangereuse et doit être manipulé sous une hotte chimique.</li>
	<li>Difficulté les ovaires cultivées, sans enlever le tissu de l’insert de la culture, en couvrant le tissu avec la solution fraîchement préparée de PFA 4 %. Sceller les bords de la plaque avec un adhésif en plastique (pour éviter l’évaporation) et placer les échantillons à 4 ° C durant la nuit. Remarque : Afin de faciliter la manipulation et l’intégrité des tissus, évitez de déplacer les ovaires de l’insert de culture cellulaire pendant toute la procédure. Ovaires cultivées attachés à la surface de la plaquette sont avantageuses pour une manipulation sans endommager ou perdre de l’orgue.</li>
	<li>Rincer le tissu 3 x avec 70 % EtOH et soit passer à l’étape 4.1 ou magasin dans les flacons scintillation rempli avec 70 % EtOH à 4 ° C jusqu'à ce que davantage de traitement. Remarque : Si vous utilisez le tissu endogène exprimant des protéines fluorescentes, stocker les échantillons avec 70 % EtOH peut réduire considérablement le signal. Alternativement, le tissu peut être rincé et stocké dans du PBS avec 0,2 % d’azide de sodium (NaN3). Cependant, NaN3 est hautement toxique et présente un danger d’inhalation grave. Faire la solution mère dans la hotte de laboratoire et gérer le port des équipements de protection individuelle approprié comme un manteau et nitrile des gants de laboratoire.</li>
</ol>4. toute monture Immunofluorescence
<ol><li>Placez le tissu fixe dans du PBS 1 x à ta pendant au moins 4 h avant l’étape de la perméabilisation 4.3.</li>
	<li>Préparer la solution perméabilisation et blocage.<ol>
<li>Préparer la solution de la perméabilisation comme décrit. 1 x PBS, ajouter 0,2 % d’alcool polyvinylique (PVA), solution de (NaBH4) de borohydrure de sodium de 0,1 % (à partir de 12 wt.% dans une solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) 14 M) et 1,5 % tert -octylphényle éther de polyéthylèneglycol (détergent agent tensio-actif non ionique). Dans un tube conique de 50 mL, ajouter 5 mL de 10 x PBS, 0,1 g de PVA et 50 µL de NaBH4750 µL de détergent agent tensio-actif non ionique, puis ajoutez ultrapure à 50 mL d’eau et agitez bien à température ambiante jusqu'à ce que le mélange soit entièrement en solution.</li>
		<li>Préparer la solution de blocage comme décrit. Pour 1 x PBS, ajouter 0,1 % tensioactif non ionique détergent, 0,15 % de 2,5 M glycine pH 7,4, sérum de chèvre normal de 10 %, 3 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,2 % NaN3, 100 unités/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 0,25 µg/mL d’amphotéricine B. préparent une solution de 2,5 glycine de M en dissolvant 93,8 g de glycine en eau ultrapure pour un volume final de 500 mL (pH 7,4) et une solution de 10 % NaN3 en dissolvant 5 g dans 50 mL d’eau ultrapure ; puis, dans un tube conique de 50 mL Préparez la solution de blocage en ajoutant 5 mL de PBS de x 10, 50 µL de détergent agent tensio-actif non ionique, 750 µL de la solution mère de glycine, 5 mL de sérum de chèvre, 1,5 g de BSA, 1 mL de solution mère de NaN3 et 0,5 mL de 100 actions de x de la pénicilline, streptomycine et amphotéricine B. Ajouter eau ultrapure jusqu'à un volume final de filtre de seringue et 50 mL de la solution finale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enlever et jeter le PBS 1 x à partir du flacon et puis ajoutez suffisamment de solution perméabilisation pour submerger complètement les ovaires. Placer l’échantillon dans la solution de la perméabilisation dans un agitateur orbital (p. ex., nutator) à température ambiante pendant 4 h. Remarque : Le temps d’Incubation peut varier selon l’épaisseur de l’orgue.</li>
	<li>Remplacer la solution perméabilisation avec suffisamment de solution bloquante pour submerger complètement les ovaires. Sceller la fiole avec l’adhésif en plastique et laisser le tissu incubant pendant un minimum de 12 h à température ambiante dans un agitateur orbital.</li>
	<li>Préparer la dilution de l’anticorps primaire en solution de saturation selon la fiche technique du fabricant. NOTE : Notez que pas tous les anticorps sont compatibles avec l’agent de compensation. Le volume moyen nécessaire par exemple est environ 750 µL.<ol>
<li>Pour la quantification de l’ovocyte, utilisez TAp63 (marqueur de l’oocyte nuclear) et MVH (marqueurs cytoplasmiques des cellules germinales). Remarque : Les anticorps utilisés dans les images d’immunofluorescence sont souris anti-p63 et lapin anti-MVH). La solution d’anticorps primaires peut être réutilisés 2 x ou plus si stocké à 4 ° C entre souillant des protocoles et correctement manipulés afin d’éviter la croissance bactérienne.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer l’insert contenant le tissu dans une plaque 24 puits et ajouter environ 750 µL de solution d’anticorps primaire. Veiller à ce que les ovaires soient complètement immergés. Sceller la plaque avec de la colle plastique pour minimiser l’évaporation et laisser le tissu en incubant pendant 4 jours à température ambiante dans un agitateur orbital.</li>
	<li>Préparer la solution de lavage.<ol>
<li>Préparer la solution de lavage comme décrit. Faire 1 x PBS, ajouter 0,2 % PVA et 0,15 % de détergent de surfactant non ionique. Dans un tube conique de 50 mL, ajouter 5 mL de 10 x PBS, 0,1 g de PVA, 75 µL de surfactant non ionique détergent et d’eau ultrapure jusqu'à un volume final de 50 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirez la dilution de l’anticorps primaire et ajouter une généreuse quantité de solution de lavage. Assurez-vous toujours de submerger les ovaires. Laisser les ovaires à tremper dans la solution du jour au lendemain à la température ambiante sur l’agitateur orbital.</li>
	<li>Remplacer la solution de lavage et incuber dans l’agitateur orbital pendant 2 h ou plus.</li>
	<li>Répétez l’étape 4.9 un délai supplémentaire.</li>
	<li>Préparer la dilution de l’anticorps secondaire en bloquant la solution. Remarque : Les anticorps secondaires utilisés sont anti-souris 488 colorant fluorescent soulevées dans chèvre et anti-lapin 594 colorant fluorescent déclenché chez les caprins. Voir l’étape 4.5. pour le volume moyen nécessaire par exemple.</li>
	<li>Enlever la solution de lavage des ovaires et ajouter la solution d’anticorps secondaire. Protéger les échantillons de la lumière (plaque envelopper avec du papier aluminium) et sceller la plaque avec de la colle plastique pour minimiser l’évaporation. Incuber les échantillons dans un agitateur orbital à température ambiante pendant 2 jours. NOTE : Continuer à protéger les échantillons de la lumière à l’aide de papier d’aluminium pendant toutes les étapes subséquentes de l’incubation.</li>
	<li>Retirer les échantillons de solution d’anticorps secondaire et ajouter la solution de lavage. Incuber dans un agitateur orbital pendant 8 h. Remarque : Si une coloration 4, 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI) est souhaitée, ajouter 50 ng/mL de DAPI à la première étape de lavage (environ 8 h d’incubation).</li>
	<li>Remplacer la solution de lavage pour un lavage au jour le jour.</li>
	<li>Pendant la préparation de la solution de compensation (voir section 5), remplacer la nuit solution avec une solution fraîche de lavage et conserver les échantillons dans l’agitateur orbital à température ambiante.</li>
</ol>5. cellules ovariennes de compensation et d’imagerie
<ol><li>Préparer ScaleS(0) solution de compensation.<ol>
<li>Préparer ScaleS(0) clearing solution10 en ajoutant des réactifs dans la proportion donnée : 40 % D-(-) sorbitol (p/v), 10 % de glycérol, urée de 4,3 M et 20 % de diméthyl sulfoxide (DMSO), pH 8,1 (p. ex. dans un tube conique de 50 mL, ajouter 2,5 mL de glycérol, 10 g de sorbitol , 5 mL de DMSO et 12 mL d’urée de 9 M pour un volume total de 25 mL. Mélanger la solution en le retournant à 50 ° C pendant 30 min et dégazer avant l’utilisation.)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enlever la solution de lavage et submerger les échantillons en solution de compensation. Pour de meilleurs résultats conserver des échantillons dans l’agitateur orbital.</li>
	<li>Remplacer la solution de nettoyage 2 fois par jour jusqu'à ce que le tissu devient transparents (environ 2 jours).</li>
	<li>Une fois que le tissu est effacé, préparation des échantillons pour l’imagerie en enlevant soigneusement la membrane insert contenant les ovaires cultivées avec une fine pointe bistouri et en plaçant l’échantillon sur une lame de verre.</li>
	<li>Passez à l’imagerie des échantillons sur un microscope capable de sectionnement optique.</li>
</ol>6. Quantification de l’ovocyte
Remarque : Il existe de nombreux logiciels différents qui sont en mesure de quantifier les cellules. Décrit ci-dessous est un protocole de quantification d’ovocytes en utilisant le paquet de traitement image non-commerciale, Fidji-ImageJ14.
<ol><li>Utilisant une projection de l’intensité maximale aplatie de la Z -série d’image pile pour les marqueurs cellulaires spécifiques d’intérêt (sans la chaîne DAPI), convertir l’image en noir et blanche image 8 bits sous Type dans la liste déroulante Image menu.</li>
	<li>Sous le menu d’Image en menu déroulant, sélectionnez l’onglet ajuster , puis sélectionnez seuil.</li>
	<li>Régler manuellement le seuil à un niveau qui identifie mieux chaque ovocyte individuel. Une fois que le niveau est déterminé, cliquez sur appliquer pour générer une image en noir et blanc. Une fois terminé, quantifier l’échantillon délimiter à l’aide de l’icône de forme ovale ou Freehand . NOTE : Fidji-ImageJ a différentes options pour affiner l’image qui sera utilisée pour la quantification des particules. Par exemple, dans processus | Binaire onglet, il y a différentes options qui peuvent servir à améliorer la détection de ce qui sera compté. Dans la Figure 4, les options permettant de mieux individualiser follicules a Erode, suivie de remplir les trouset enfin le bassin versant.</li>
	<li>Sous le menu déroulant ci- analyser , sélectionnez analyser les particules. Réglez les paramètres selon la résolution souhaitée.</li>
</ol>

<ol><li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li>
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<li>Laronda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioprosthetic+ovary+created+using+3D+printed+microporous+scaffolds+restores+ovarian+function+in+sterilized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice.</a> Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’étude de la reproduction chez les mammifères nécessite à l’aide et à la quantification des cellules spécialisées qui ne sont pas systématiquement se prêtent à la culture cellulaire. Cependant, ex vivo systèmes de culture sont efficaces pour maintenir l’ovaire et le follicule viabilité1,15. Au cours de la culture de l’ovaire, le tissu nécessite une plus grande surface pour l’échange d’éléments nutritifs par diffusion. Par conséquent, 5 - jour vieille so...

Afin d’étudier la composition cellulaire et les caractéristiques morphologiques des ovaires chez les mammifères, scientifiques reposent souvent sur des expériences in vivo suivies immunohistological coloration des ovaires de paraffine incorporé. Plus récemment cependant, culture d’organes entiers ovaire s’est avéré pour être une alternative efficace pour étudier la fonction ovarienne1,2,3,4 , parce que la technique peut être couplée avec une meilleure visualisation et outils de quantification. Traditionnellement, analyse de la morphologie ovarienne dépend de reconstruire en trois dimensions architecture ovarien de coupes sériées de paraffine incorporé, mais, en plus d’être laborieuse et chronophage, coupes en série tissu paraffine incorporé ne garantie pas de bonne reconstruction de l’orgue, et les sections sont souvent perdues ou mal classées dans le processus.
Outre les défis techniques liés au sectionnement série, il y a des variations dans les méthodes couramment utilisées pour quantifier le nombre de follicules par ovaire5,6. La variabilité méthodologique utilisée actuellement altère la méta-analyse de réserve ovarienne ensemble études5,7. Par exemple, nombre de follicule d’articles de recherche différents peut varier de 10 fois ou plus entre les âges de développement similaires au sein d’une souche spécifique de6. Ces grandes différences dans la quantification du follicule signalées peuvent prêter à confusion et ont entravé la Croix-étude des comparaisons. Expérimentalement, les approches traditionnelles de la quantification de la follicule de coupes sériées sont effectuées par le comptage des follicules d’un nombre prédéfini de sections (par exemple, chaque cinquième, dixième, ou autre article). Variabilité des comtes de follicule à l’aide de cette approche découle non seulement de la périodicité dans quelles sections sont comptées, mais aussi des variations dans l’épaisseur de coupe et une expérience technique dans la génération de coupes sériées5,6. En plus de sa variabilité, un autre inconvénient des coupes de tissu traditionnel est que le sectionnement de petits ovaires d’animaux jeunes est particulièrement difficile et fortement tributaire des tissus orientation8.
Le protocole ci-dessous décrit une technique de culture ovaire systématiquement utilisé1 mais améliore grandement sur la quantification du follicule traditionnel en remplaçant les coupes physiques avec tissu de compensation et sectionnement optique à l’aide de la microscopie confocale8 ,,9. Compensation à l’aide d’immersion de tissu (sans la nécessité d’une perfusion transcrânienne ou électrophorèse) dans un et sorbitol-base d’urée solution (par exemple, ScaleS(0)10) s’est avérée compatible avec l’immunomarquage et autorisés pour la réduction des temps de compensation sans compromettre la profondeur de l’imagerie. Autres méthodes déclarées (p. ex., ScaleA28,10, SeeDB11, Clear12et ClearT212) sont plus consommer de temps ou ne permettent pas une résolution optique approfondie de l’échantillon. Optique de sectionnement est avantageux car il est moins intensive de travail et maintient architecture tridimensionnelle7,8 de l’orgue. Un autre avantage de cette approche est que la préparation des échantillons n’exige pas des réactifs coûteux pour dégager le tissu et peut être effectuée avec une relative facilité.
Plus précisément, le protocole décrit a été optimisé pour les ovaires de souris cultivées à jour après la naissance cinq mais a été mené sur les ovaires allant de jour après la naissance 0 - 10. La méthode utilise un système de culture ovaire dans laquelle le tissu s’attache naturellement à la membrane sur lequel il est cultivé, facilitant la manipulation de l’orgue et la manipulation. Le système de culture décrit peut servir à maintenir explantés ovaires pendant 10 jours et d’évaluer comment les différentes conditions expérimentales peuvent interférer avec l’ovocyte survie13. La procédure de quantification décrite est réalisée en utilisant le paquet Fidji-ImageJ14 de traitement d’image non commerciale et peut être effectuée sur la plupart des ordinateurs personnels. En outre, images utilisées pour la quantification peuvent être largement diffusés pour la communauté scientifique, ce qui permet de meta-analyse future.

<table><tbody><tr><td>Micro ciseaux de dissection 4.5 », droits, pointes acérées</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Micro ciseaux de dissection</td></tr><tr><td>Pince de style bijoutier 4-3/8 », style 5</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305X</td><td>Pince à pointe fine</td></tr><tr><td>Micro ciseaux à iris 4 », droits, pointes acérées Integra</td><td>Miltex</td><td>18-1618</td><td>Micro ciseaux de dissection de l’iris ou micro ciseaux à ressort de dissection</td></tr><tr><td>1X Minimal Essential Media (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-antimycosique (100X)</td><td>Gibco</td><td></td><td>15240062 utilisé à l’étape 1.3.1</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire traitée de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&commerce ; Plaque porteuse à 24 puits pour inserts de culture cellulaire</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>141006</td><td>Taille des pores : 8&mu ; m</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td>Solution à 16 %</td></tr><tr><td>1X Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur Nutator GyroTwister&trade ;</td><td>Agitateur tridimensionnel</td> <td>Labnet</td><td>S1000-A-B</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>VWR</td><td>103219-578</td><td></td></tr><tr><td>Albumen sérique bovin (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Solution de borohydrure de sodium (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452904-25ML</td> Utilisez <td>la solution, plutôt que le sous forme de comprimés ou de poudre&nbsp ;</td></tr><tr><td>Alcool polyvinylique (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td>Triton soluble dans l’eau froide</td></tr><tr><td>& trade ; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>polyéthylène glycol tert-octylphényléther</td></tr><tr><td>Filtres pour seringues</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>725-2520</td><td>25mm</td></tr><tr><td>10mL Seringues</td><td>BD</td><td>309695</td><td></td></tr><tr><td>Souris anti-p63 (4A4)</td><td>Biocare Medical</td><td>CM 163A</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-MVH</td><td>anticorps Abcam</td><td>ab13840</td><td>Dilution 1:600</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg ; chèvre anti-souris 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>Dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg ; chèvre anti-lapin 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Dilution 1:1000</td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI)&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)sorbitol&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240850-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>FIJI-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Logiciel de traitement d’images</td></tr><tr><td>Pipettes de transfert en plastique jetables</td><td>VWR</td><td>414044-034</td><td></td></tr></tbody></table>

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Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Recherche dans le domaine de la biologie de la reproduction chez les mammifères souvent consiste à évaluer l’intégrité globale des ovaires et des testicules. Plus précisément, chez les femelles, l’ovaire remise en forme est souvent évaluée par visualiser et quantifier les follicules et les ovocytes. Parce que l’ovaire est un tissu opaque en trois dimensions, les approches traditionnelles nécessitent laborieusement découper le tissu dans nombreuses coupes sériées afin de visualiser les cellules tout au long de l’organe entier. En outre, parce que la quantification de cette méthode consiste généralement à marquer qu’un sous-ensemble des sections séparées par le diamètre approximatif d’un ovocyte, elle est sujette à l’inexactitude. Un protocole est décrit ici, qui utilise plutôt la compensation tissus organes entiers et immunofluorescence souillant des ovaires de souris pour visualiser les follicules et les ovocytes. Par rapport aux approches plus traditionnelles, ce protocole est avantageux pour la visualisation des cellules à l’intérieur de l’ovaire pour de nombreuses raisons : 1) l’ovaire reste intacte tout au long de la préparation des échantillons et du traitement ; 2) petits ovaires, qui sont difficiles à section, peuvent être examinées avec facilité ; 3) quantification cellulaire est obtenue plus facilement et avec précision ; et 4) l’organe entier imagé.

Ce protocole comporte 6 étapes majeures après dissection des ovaires, comme indiqué dans la Figure 1. Figure 2 , Figure 3 , Figure 4 mettre en évidence les caractéristiques plus nouvelles du présent protocole, qui comprennent l’optimisation du tissu de compensation pour les ovaires et tissus toute quantification de l’...

Nous présentons ici un protocole visant à quantifier les follicules dans les ovaires de jeunes souris sans sectionnement serial. Selon immunofluorescence de la totalité de l’organe et de tissus de compensation, sectionnant physique est remplacé par sectionnement optique. Cette méthode de préparation des échantillons et visualisation maintient l’intégrité de l’organe et facilite la quantification automatique des cellules spécifiques.

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Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des images d’ovaires entiers en culture compatibles avec la quantification automatique des follicules. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la reproduction, telles que la façon dont différentes conditions interfèrent avec la forme ovarienne. Le principal avantage de cette technique est qu’elle demande moins de main-d’œuvre et qu’elle maintient l’architecture tridimensionnelle de l’orgue.Bien que cette méthode ait été optimisée pour les ovaires de souris en culture au cinquième jour postnatal, elle peut également être appliquée à d’autres âges et tissus tels que les gonades embryonnaires ou les testicules de jeunes souris. Commencez par une surface de travail propre. Essuyez avec dix pour cent d’eau de Javel et laissez l’eau de Javel rester sur la surface de travail pendant au moins cinq minutes.Après cinq minutes, retirez l’excès d’eau de Javel avec des serviettes en papier propres et de l’éthanol à 70 %. Nettoyez soigneusement le microscope de dissection avec de l’éthanol à 70 % et placez une serviette en papier sèche sur la platine. Enveloppez les pinces et les ciseaux propres avec une serviette en papier imbibée d’éthanol à 70 %.Ensuite, faites 50 millilitres de milieu de culture d’ovaires dans un tube conique et réchauffez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Une fois que le milieu s’est réchauffé, préparez les plaques et les inserts en ajoutant d’abord un millilitre de milieu de culture d’ovaires à des plaques de culture tissulaire de 35 millimètres. Ajoutez ensuite environ 0,55 millilitre de milieu dans les puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits et placez un insert dans chaque puits contenant le milieu.Assurez-vous que les membranes touchent le support. Placez les plaques de 35 millimètres et la plaque porteuse de 24 puits dans un incubateur à 37 degrés Celsius, cinq pour cent de dioxyde de carbone et d’oxygène atmosphérique. Placez ensuite une plaque chauffante à côté de la sonde de dissection et réglez la température à 37 degrés Celsius.Si l’incubateur de culture tissulaire n’est pas proche de la zone de dissection, placez l’une des boîtes de culture tissulaire de 35 millimètres contenant un milieu de culture d’ovaires sur la plaque chauffante. Ensuite, commencez la dissection en vaporisant la femelle fraîchement euthanasiée avec de l’éthanol à 70 % et placez-le sur l’essuie-tout sec sous le microscope de dissection. Après avoir fait une incision dans la cavité abdominale, extrudez les intestins et localisez les ovaires.Extrayez les ovaires et placez-les dans le milieu de culture dans la boîte de 35 millimètres. Une fois les ovaires disséqués, augmentez le grossissement du microscope de dissection pour mieux visualiser les ovaires et tout tissu attaché. À l’aide d’une pince à pointe fine propre, retirez tous les tissus non ovariens tels que les bourses et les tissus adipeux sans endommager les ovaires.Ensuite, placez chaque paire d’ovaires sur un insert de culture cellulaire pré-trempé et ajustez le volume du milieu pour vous assurer qu’il est suffisant pour garder l’organe humide sans l’immerger complètement. Placez les organes explantés dans un incubateur à 37 degrés Celsius, cinq pour cent de dioxyde de carbone et d’oxygène atmosphérique. Au moment expérimental souhaité, retirez le milieu de culture d’ovaires de la plaque et fixez les ovaires cultivés sur l’insert en recouvrant le tissu d’une solution de PFA à quatre pour cent fraîchement préparée.Scellez les bords de la plaque avec un film de paraffine pour éviter l’évaporation et placez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Rincez le mouchoir trois fois avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, stockez dans des flacons à scintillation remplis d’éthanol à 70 % à quatre degrés Celsius jusqu’à un traitement ultérieur.Commencez la coloration en retirant l’éthanol à 70 % des flacons et en lavant le tissu fixé avec du PBS à température ambiante en agitant pendant au moins quatre heures. Après avoir retiré le PBS, ajoutez suffisamment de solution de perméabilisation pour immerger complètement les ovaires. Placer sur un agitateur orbital et incuber à température ambiante pendant quatre heures.Remplacez la solution de perméabilisation par une solution de blocage suffisante pour immerger complètement les ovaires. Ensuite, incubez les flacons scellés à température ambiante pendant au moins 12 heures sur un agitateur orbital. Après le blocage, placez les inserts dans une plaque à 24 puits et ajoutez environ 750 microlitres de solution d’anticorps primaires en veillant à ce que les ovaires soient complètement immergés.Placez ensuite la plaque scellée sur l’agitateur orbital et incubez pendant quatre jours à température ambiante. Après quatre jours, retirez l’anticorps primaire et ajoutez une quantité généreuse de solution de lavage. Lavez les ovaires pendant la nuit.Le lendemain, remplacez-le par une solution de lavage fraîche et incubez sur l’agitateur orbital pendant deux heures ou plus. Après les lavages, ajoutez une solution d’anticorps secondaire. Protégez les échantillons de la lumière et incubez sur un agitateur orbital à température ambiante pendant deux jours.Après deux jours, retirez la solution d’anticorps secondaire des échantillons et ajoutez la solution de lavage. Commencez par préparer la solution de nettoyage ScaleS0. Mélangez la solution par inversion et incubez à 50 degrés Celsius pendant 30 minutes.Dégazez la solution de déblaiement ScaleS0. Retirez ensuite la solution de lavage des ovaires immunomarqués. Ajoutez la solution de clarification.Couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium et remettez-la dans l’agitateur orbital. Il est extrêmement important d’être patient pendant les étapes de coloration et de nettoyage. Une fois que le tissu est devenu transparent, à l’aide d’un scalpel à pointe fine, retirez soigneusement les membranes d’insertion contenant les ovaires en culture.Placez l’échantillon sur une lame de verre et recouvrez doucement l’échantillon avec une lamelle. Procédez ensuite à l’imagerie des échantillons sur un microscope capable de sectionnement optique. Cette image montre un ovaire postnatal du cinquième jour qui n’a pas été dégagé.Ici, l’ovaire est montré une heure après l’ajout de la solution éclaircissante. L’ovaire commencera à devenir translucide quelques minutes après avoir été immergé dans une solution éclaircissante. La section optique des ovaires cultivés sans dégagement est possible, mais les cellules profondes du tissu ont un signal difficile à différencier du fond, ce qui empêche une bonne quantification des ovocytes.En revanche, cette image représentative montre un échantillon clairci dans lequel la quantification de l’ovocyte dans l’ensemble de l’organe est possible. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que les anticorps doivent se diffuser à travers les tissus ; Ainsi, les tissus plus épais nécessiteront un temps d’incubation plus long. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver, de colorer et d’imager des ovaires entiers.Le texte décrit l’utilisation d’un logiciel libre, Fiji ImageJ, qui peut être utilisé pour la quantification simple des follicules. N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde et de l’azoture de sodium peut être dangereux et que des précautions telles que l’utilisation de hottes et d’équipements de protection individuelle doivent toujours être prises lors de cette procédure.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Ce protocole décrit la culture primaire / co-culture de tissu ovarien de la souris, en utilisant des ovaires de souris nouveau-nées et des follicules ovariens provenant de souris individuelles prépubères. Les techniques de culture de soutenir le développement d'une manière hautement physiologique, ce qui permet étude de l'effet d'agents extrinsèques sur l'ovaire, et des interactions entre les follicules ovariens.

Culture et co-culture de souris ovaires et follicules ovariens

Les cultures de tissus ovariens peuvent être utilisés comme modèles de l’atrésie folliculaire développement, ovulation et follicule et indiquer les mécanismes de régulation de processus ovariens dynamiques.

Culture de tissus ovariens pour visualiser les phénomènes dans les ovaires de souris

Ici, nous décrivons, comparons, et contrastons deux techniques différentes pour le comptage précis de follicule des tissus ovariens fixes de souris.

Dénombrement précis des follicules chez les ovaires de souris adultes

Nous présentons ici un protocole optimisé pour l’imagerie d’ovaires entiers pour des analyses quantitatives et qualitatives utilisant l’immunocoloration à montage entier, la microscopie multiphotonique et la visualisation et l’analyse 3D. Ce protocole prend en charge un traitement à haut débit, fiable et reproductible applicable à la toxicologie, au diagnostic clinique et aux tests génomiques de la fonction ovarienne.

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Le protocole décrit ici détaille l’induction d’un programme hémogénique dans des fibroblastes embryonnaires de souris via la surexpression d’un ensemble minimal de facteurs de transcription. Cette technologie pourrait être transposée au système humain afin de fournir des plateformes pour l’étude future de l’hématopoïèse, des maladies hématologiques et de la greffe de cellules souches hématopoïétiques.

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