Une plate-forme de Microfluidic ultra haute capacité pour le séquençage du génome de cellules individuelles

L’objectif global de cette expérience est de générer des données de séquençage génomique à code-barres à partir de dizaines de milliers de cellules uniques à l’aide d’une série de dispositifs microfluidiques. Cette méthode permet d’obtenir un débit de séquençage unicellulaire inégalé. Nous utilisons la microfluidique pour encapsuler, lyser et coder individuellement les cellules, préservant ainsi l’hétérogénéité génomique sous-jacente, qui est perdue lors des chocs conventionnels dans les études de séquençage.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle est à haut débit et capable de produire des données unicellulaires à partir de dizaines de milliers de cellules. Bien que nous travaillions avec des microbes dans cette démonstration, le flux de travail peut être adapté pour être utilisé avec différents types de cellules grâce à des modifications mineures des dimensions du dispositif microfluidique. Pour commencer le protocole, préparez un millilitre d’agarose à basse température de fusion de 3 % en poids par volume dans un tampon 1X Tris-EDTA, ou TE.

Conservez la solution d’agarose sur un bloc de chaleur à 90 degrés Celsius jusqu’à ce que la seringue soit chargée. Remettez les cellules en suspension dans un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate, ou PBS, et faites tourner les cellules. Aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu à gradient de densité volume à volume de 17 % dans du PBS, et maintenez les cellules sur de la glace jusqu’au chargement de la seringue.

Ensuite, chargez une seringue de trois millilitres avec de l’huile fluorée, ou HFE, contenant un tensioactif PFPE-PEG de 2 % en poids par poids. Ajustez-le d’une aiguille de calibre 27 et placez-le dans une pompe à seringue. Chargez la suspension cellulaire et l’agarose fondue dans des seringues d’un millilitre, toutes deux équipées d’aiguilles de calibre 27, et placez-les dans des pousse-seringues.

Ensuite, réglez un radiateur d’appoint à haute température et positionnez la surface chauffante à 10 centimètres de la seringue. Assurez-vous que la température mesurée à la seringue est d’environ 80 degrés Celsius. Avant d’insérer les tubes dans l’appareil, amorcez les pompes pour évacuer l’air de la conduite.

Connectez les aiguilles de la seringue aux entrées du dispositif microfluidique à l’aide de morceaux de tube en polyéthylène ou PE. Connectez un morceau de tube à la sortie et placez l’extrémité libre dans un tube de collecte de 15 millilitres. Après la fabrication du drop, placez le tube de collecte à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes pour assurer la gélification complète de l’agarose.

Retirez la couche inférieure d’huile du tube de prélèvement à l’aide d’une seringue de trois millilitres munie d’une aiguille de calibre 20, en prenant soin de ne pas perturber la couche supérieure des gouttelettes d’agarose. Ajoutez un millilitre de 10 % de volume par volume de PFO dans HFE pour briser les gouttes d’agarose de leur couche tensioactive. Pipetez la solution de haut en bas pendant une minute pour bien enrober les émulsions, qui doivent être homogènes et exemptes de grumeaux.

Faites tourner le tube conique à 2 000 fois g pendant une minute pour recueillir les microgels d’agarose. Aspirez le surnageant PFO/HFE et assurez-vous que les microgels sont maintenant débarrassés de leur couche tensioactive et sont clairs. Après avoir lavé les microgels, vérifiez l’encapsulation cellulaire dans les microgels au microscope à un grossissement de 400X en colorant une aliquote de 10 microlitres de gels avec une coloration d’acide nucléique 1X.

Branchez l’entrée des cellules d’un dispositif de dropmaker à co-flux avec un petit morceau de soudure au plomb. Avant d’insérer les tubes dans l’appareil, amorcez les pompes pour évacuer l’air de la conduite. Connectez un morceau de tube à la sortie et placez l’extrémité libre dans un tube PCR de 0,2 millilitre.

Utilisez les débits à l’écran pour faire des gouttes. Collectez les gouttes dans les tubes PCR avec environ 50 microlitres de gouttes dans chaque tube. Après la fabrication des gouttes, retirez soigneusement la couche inférieure d’huile HFE des émulsions à l’aide des pointes de pipette à chargement de gel, et remplacez-la par de l’huile fluorée FC-40 contenant un tensioactif PFPE-PEG de 5 % en poids par poids.

Ensuite, programmez le cycle thermique. Avant d’insérer les tubes dans l’appareil, amorcez les pompes pour évacuer l’air de la conduite. Connectez les seringues contenant du HFE, du mélange de marquage et des microgels aux entrées du dispositif microfluidique à l’aide de morceaux de tube en PE.

Connectez un morceau de tube à la sortie et placez l’extrémité libre dans une seringue vide d’un millilitre avec le piston tiré sur la ligne d’un millilitre. Ensuite, vérifiez le taux d’encapsulation du microgel au microscope optique à un grossissement de 400X. Ajustez la seringue contenant les émulsions de marquage à l’aide d’une aiguille et incubez-la debout dans un bloc de chaleur ou un four pendant une heure à 55 degrés Celsius pour fragmenter l’ADN génomique.

Préparez les gouttelettes de code-barres pour la fusion en remplaçant la fraction d’huile FC-40 par HFE 2 % poids par poids PFPE-PEG. Transférez soigneusement les gouttes dans une seringue d’un millilitre, ajustez-la avec une aiguille et placez-la dans un tire-seringue. Chargez la seringue à gouttelettes de microgel incubée et étiquetée dans un pousse-seringue.

Ensuite, connectez les trois seringues de chlorure de sodium aux deux entrées d’électrodes et à l’entrée unique du fossé à l’aide de morceaux de tube en PE. Avant d’insérer les tubes dans l’appareil, amorcez les pompes pour évacuer l’air de la conduite. Connectez les trois seringues HFE montées sur des pompes aux deux entrées d’huile d’espacement et à l’entrée d’huile de fabrication à l’aide de morceaux de tube en PE.

Ensuite, tirez sur tous les tubes de réinjection de gouttelettes avec un pistolet antistatique avant de connecter le tube aux aiguilles de la seringue. Connectez la seringue de mélange PCR, la seringue de goutte de microgel et la seringue de goutte de code-barres à leurs entrées respectives avec un tube en PE. Connectez l’aiguille de la seringue d’électrode à un onduleur fluorescent à cathode froide à l’aide d’une pince crocodile.

Réglez l’alimentation CC de l’onduleur sur deux volts. Faites fonctionner le dispositif à double fusion avec les débits recommandés. Collectez les gouttes dans des tubes PCR avec environ 50 microlitres d’émulsion dans chaque tube.

Avant le cycle thermique, retirez soigneusement la couche inférieure d’huile HFE des émulsions à l’aide d’embouts de pipette à chargement de gel, et remplacez-les par de l’huile fluorée FC-40 contenant un tensioactif PFPE-PEG de 5 % en poids par poids. Ensuite, programmez le cycle. Pour récupérer l’ADN des gouttelettes du cycle thermique, regroupez les gouttelettes dans un tube de microcentrifugation et brisez les émulsions à l’aide de 20 microlitres de PFO.

Mélangez-les pendant 10 secondes pour mélanger. Faites tourner le tube. Retirez délicatement la couche aqueuse supérieure du tube à l’aide d’une pipette et transférez-la dans un nouveau tube de microcentrifugation.

Jetez la phase huileuse. Enfin, passez aux étapes de préparation, de séquençage et d’analyse de la bibliothèque. Un histogramme du nombre de codes-barres en fonction de la taille du groupe montre qu’une partie importante des groupes de codes-barres valides se situe juste au-dessus des paires de 7,5 kilobases par taille de seuil de groupe, ce qui exclut les orphelins mutés par PCR.

L’abondance relative des types de cellules d’une communauté synthétique de 10 cellules composée de trois bactéries à Gram négatif, de cinq bactéries à Gram positif et de deux levures a été calculée en comptant les lectures brutes et les groupes de codes-barres. Une carte de couverture circulaire des lectures de B. subtilis de tous les groupes de codes-barres illustre l’uniformité des lectures SiC-seq, sans régions d’abandon observables, où la couverture moyenne était de 5,55X. L’uniformité de la couverture a été vérifiée à l’aide d’une distribution de fréquence de valeurs de couverture normalisées.

Lors de cette procédure, il est important de maintenir un taux d’encapsulation d’environ un code-barres ou une cellule pour 10 gouttelettes. Cela limite la probabilité d’un événement de double encapsulation, qui peut compliquer les données d’une seule cellule. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la configuration et de l’utilisation des dispositifs microfluidiques utilisés pour générer des données de séquençage de cellules uniques.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée en huit heures ou en deux journées de quatre heures.