Un protocole en vue d’acquérir la Tenocyte dégénérative de l’homme

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la biologie des ténocytes dégénératifs humains, car seules quelques études ont décrit en détail l’isolement et la culture des ténocytes dégénératifs humains. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons obtenir un ténocyte dégénératif humain sans blessure supplémentaire du patient, car le tissu dégénératif est acquis lors de la chirurgie standard de l’épicondylite. La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Soo-Hong Han, Minjung Baek et Hyung Kyung Kim de mon niveau trois.

Pour obtenir un échantillon de tissu tendocytaire dégénératif, utilisez un scalpel chirurgical numéro 15 pour faire une incision cutanée de trois à cinq centimètres juste en avant de l’épicondyle latéral et proximale au niveau de l’articulation pour exposer le coude latéral et localiser visuellement l’extenseur du carpe radial long dans l’interface de l’aponévrose extensrice. À l’aide du scalpel, faites une incision de fendillement de deux à trois millimètres de profondeur entre l’extenseur du carpe radial long et l’extenseur de l’aponévrose à l’interface. Après la rétraction antérieure de l’extenseur radial du carpe long, localisez le tissu dégénératif pathologique par sa couleur grisâtre terne caractéristique et son tissu typiquement œdémateux et friable, et utilisez le scalpel et les mini-lames pour réséquer soigneusement, mais nettement, tout le tissu dégénératif.

Lorsque tout le tissu a été prélevé, fermez la plaie avec un matériau de suture non résorbable conformément aux protocoles standard et retirez soigneusement tous les tissus environnants d’un morceau d’échantillon de tissu d’environ un centimètre cube, en plaçant le tissu tendineux propre dans 10 millilitres de PBS dès qu’il a été coupé. Ensuite, fixez environ la moitié du tissu récolté dans du formol 10 % tamponné neutre dans une hotte chimique pendant 12 heures. Pour mettre en place une culture de ténocytes, transférez l’autre moitié des échantillons de tissus témoins et dégénérés récoltés dans des boîtes de culture de tissus individuelles contenant du PBS frais et hachez les tissus en un mètre cube ou en petits morceaux, digérez les fragments de tissu dans 30 millilitres de DMEM complétés par 30 milligrammes par millilitre de collagénase, deux par groupe de tissus à 37 degrés Celsius pendant une heure.

À la fin de la digestion, filtrez les solutions cellulaires à travers des passoires cellulaires individuelles de 100 microns et désactivez la collagénase avec un millilitre de FBS par tube. Collectez les ténocytes par centrifugation et remettez les granules en suspension à trois fois 10 à cinquièmes cellules pour 10 millilitres de DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de concentration de solution antibiotique et antimycosique. Ensuite, ensemencez les cellules dans une boîte de culture de 100 centimètres par condition, et cultivez les ténocytes dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une semaine, en changeant de milieu de culture tous les trois jours jusqu’à ce qu’une confluence de 80 % ait été atteinte.

Pour l’analyse immunocytochimique, transférez deux fois 10 à la cinquième cellules dans 200 microlitres de milieu frais dans chaque puits d’une lame de chambre à huit puits par groupe expérimental et faites croître les cellules jusqu’à la confluence pendant 24 heures. Le lendemain, laver les cellules avec du PBS, suivi d’une fixation avec 500 microlitres de formaldéhyde à 4 % par puits, et d’une perméabilisation avec 0,5 % de triton X 100 dans du PBS pendant 10 minutes. Pour bloquer toute liaison non spécifique, incuber les cellules avec 1 % d’albumine sérique bovine et 0,05 % de Tween 20 dans du PBS, selon le niveau expérimental approprié, suivi d’une incubation avec les anticorps primaires d’intérêt marqués par fluorescence à quatre degrés Celsius pendant la nuit, à l’abri de la lumière.

Le lendemain matin, étiquetez les cellules avec les anticorps secondaires appropriés pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière, et montez les échantillons avec 0,5 microlitre d’un milieu de montage de fluorescence approprié par chambre. Ensuite, imagez les échantillons à l’aide d’un microscope à fluorescence sous un objectif 400 fois. Pour l’analyse pathologique du tissu, intégrez les échantillons de tissu de contrôle formel et fixe et de tissu tendineux dégénéré dans quatre à cinq millilitres de paraffine et acquérez des sections de quatre à cinq microns de chaque bloc de paraffine.

Pour l’hématoxyline dans l’éosine, ou la coloration H&E, déparaffinisez les échantillons avec trois immersions de cinq minutes dans du xylène, suivies d’une hydratation avec des immersions graduées à l’éthanol et d’un lavage à l’eau du robinet de deux minutes. Ensuite, étiquetez les échantillons avec de l’hématoxyline pendant cinq minutes, puis un autre lavage à l’eau de deux minutes. Trempez les échantillons rincés dans de l’acide chlorhydrique à 1 % et de l’éthanol à 70 % pendant trois secondes, puis dans un lavage à l’eau de trois minutes.

Neutralisez l’acide avec un trempage de 10 secondes dans de l’ammoniac à 0,5 %, suivi d’un autre lavage à l’eau de trois minutes. Étiquetez les échantillons neutralisés avec l’éosine pendant cinq minutes et déshydratez les échantillons colorés H&E avec des immersions graduées à l’éthanol. Après trois immersions au xylène, montez les échantillons avec un support de montage approprié et une lame de couverture.

Pour effectuer une analyse immunohistochimique des échantillons de tissus, utilisez le kit de détection affiné du polymère de liaison conformément aux instructions du fabricant, avec les modifications mineures suivantes. Après la déparaffinisation au xylène, comme démontré, immerger les échantillons dans une solution de récupération d’épitopes de liaison pendant 30 minutes à 100 degrés Celsius pour la récupération de l’antigène, suivie d’une incubation de cinq minutes dans du peroxyde d’hydrogène pour éteindre toute peroxydase endogène. Ensuite, étiquetez les sections pendant quinze minutes à température ambiante avec les anticorps primaires d’intérêt.

À la fin de l’incubation, étiquetez les échantillons avec le système conjugué d’anticorps secondaires de liaison polymère de raifort sans biotine et de peroxydase pendant 50 minutes à température ambiante. Ensuite, montez les coupes à l’aide d’une lamelle dans le support de montage approprié et imagez les échantillons au microscope optique avec un grossissement de 400 fois. Les analyses H&E révèlent que le tissu prélevé à partir de l’épicondylite latérale dégénérée présente des faisceaux de collagène désorganisés avec une perte de polarité et des structures de fibres parallèles fines, droites et fortement tassées.

En effet, les faisceaux de collagène sont positifs pour la coloration au bleu d’Alcian dans les sections de tissus dégénérés, indiquant une présence accrue de protéoglycanes et de glycosaminoglycanes dans les tissus endommagés. L’analyse immunohistochimique des tendons dégénérés indique également une réaction positive granulaire cytoplasmique au facteur de croissance de l’endothélium vasculaire qui n’est pas observée dans les échantillons de tissu tendineux sains de contrôle. Les deux types de cellules d’échantillons de tissus cultivés peuvent être confirmés comme étant des ténocytes par immunofluorachimie, la plupart des cellules cultivées exprimant des marqueurs de ténocytes représentatifs tels que les protéines mohawk et ténomoduline et démontrant une apparence allongée.

Il convient de noter que les ténocytes dégénératifs présentent également un taux de prolifération plus élevé en culture par rapport aux ténocytes prélevés sur des témoins sains, ainsi qu’une expression plus élevée de plusieurs gènes connus pour être liés au développement de la tendinopathie. En conclusion, ce protocole validé utilisant des ténocytes dégénératifs ouvre la voie à de futures investigations en biologie tendineuse et à l’expérimentation de nouvelles interventions.