Détection des petits GTPase prénylation et GTP Binding utilisant le fractionnement Membrane et GTPase-linked Immunosorbent Assay

Le petit Rho GTPase est une protéine d’une superfamille à fonction cellulaire diversifiée. Par exemple, ces protéines sont impliquées dans la régulation du destin cellulaire, la réponse cellulaire à un stress, la motilité cellulaire, et le cycle cellulaire. L’activité d’une petite protéine Rho GTPase est régulée par modification post-translationnelle.

Ces modifications sont impliquées dans une réglementation stricte de leur activité. À titre d’exemple, la prénylation des protéines et la liaison GTP sont la modification post-translation la plus importante de ces protéines. Mon laboratoire a récemment modifié et développé une méthode simple pour étudier la modification post-translationnelle de ces protéines superfamiliales.

À cette fin, nous avons utilisé 251 lignées cellulaires de glioblastome, et les ciblons avec la simvastatine, et mesuré la modification post-translationnelle de ces protéines. La méthode implique la fractionnement sous-cellulaire et la protéine liée gtp à cette superfamille protéique. À cette fin, nous avons utilisé la localisation de RhoA, et GTP lié à RhoA pour mesurer la modification post-translationnelle de cette protéine.

Retirer les cellules de l’incubateur à 37 degrés. Regardez les cellules sous le microscope pour confirmer la confluence. Les cellules devraient être à 70 à 80 pour cent confluent.

Lavez les cellules une fois avec du PBS froid. Ajouter cinq millilitres d’EDTA et remettre les cellules dans l’incubateur à 37 degrés pendant cinq minutes. Après cinq minutes d’incubation, recueillir EDTA avec des cellules dans un tube de 15 mil.

Placez le tube dans une glacis et passez à la centrifugeuse. Mettre en place la centrifugeuse à 1500g à quatre degrés, et faire tourner les cellules pendant cinq minutes. Après le spin, retirer le superné, et ajouter un millilitre de PBS froid.

Triturer les cellules bien. Transférer le mélange cellulaire dans un nouveau tube de 1,5 millilitre étiqueté. Après le transfert, procéder à la centrifugeuse.

Réglez la centrifugeuse à 1500g à quatre degrés, et faites tourner les cellules pendant cinq minutes. Vérifiez la taille des granulés. Placez les échantillons sur la glace.

Jeter complètement le superné, sans déranger la pastille. Ajouter Buffer One. Bien mélanger en pipetting de haut en bas.

Passez à la sonication. Réglez le sonicateur pendant cinq cycles, cinq secondes chacun, et répétez trois fois. La sonication doit se faire sur la glace, mais elle n’est pas affichée dans la vidéo, à des fins illustratives.

Procéder à l’ultracentrifugeuse. Utilisez une ultracentrifugeuse pour séparer les homogénéisations cellulaires en fractions cytoplasmiques et membranaires. Réglez la centrifugeuse à 100 000g pendant 35 minutes, à quatre degrés.

Vérifiez la taille des granulés. Séparez la supernée. Recueillir le supernate complètement, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.

Le superné est la fraction cytosolique. Placer le supernate dans un tube nouvellement étiqueté. Ajouter le tampon deux à la pastille.

C’est la fraction membranaire. Bien mélanger en pipetting de haut en bas. Procéder à la détermination des protéines et à la préparation de l’échantillon de taches occidentales.

Chargez les échantillons sur un SDS-PAGE à l’aide d’un gel de 15%. Confirmez le transfert de protéines en visualisant le marqueur de poids moléculaire ou en utilisant une tache Ponceau. Ajouter des anticorps primaires pour l’analyse de l’immunoblotting.

Nous utilisons Rac1/2/3, Cdc42 et RhoA. Sortez les assiettes de culture de l’incubateur. Regardez les cellules sous le microscope pour confirmer la confluence.

Les cellules doivent être confluentes à 70 à 80 %. Placez la plaque de culture sur la glace. Aspirez les médias et lavez les cellules avec du pH’d PBS froid à 7,2.

Aspirez le PBS. Inclinez les plaques sur la glace pendant une minute supplémentaire pour enlever tous les restes de PBS. PBS résiduel affecte négativement cet essai.

Lyse les cellules dans un volume approprié de tampon de lyse froide de glace contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. La cellule de récolte lysate avec le grattoir de cellules. Inclinez la plaque de culture pour cette technique.

Transférer le lysate dans un tube cryo étiqueté et glacé et garder sur la glace. Bien mélanger à l’aide d’un vortex. Gardez 10 microlitres du lysate pour un essai protéique.

Casser le gel du lysate de la cellule restante dans de l’azote liquide. Transférer les cryotubes congelés à moins 80 congélateur. Stockez ces échantillons.

Notez que les échantillons ne doivent pas être conservés plus de 14 jours. Préparer les lysates cellulaires des autres plaques de culture en répétant les étapes une à huit, une par une. Travaillez rapidement et ne laissez jamais les échantillons sur la glace plus de 10 minutes.

Ne manipulez jamais toutes les plaques de culture simultanément. Mesurer la concentration en protéines. Calculer le volume de tampon de lyse pour normaliser la concentration de protéines entre les échantillons.

Note: un milligramme par millilitre est généralement le meilleur, cependant, 0,3 à deux milligrammes par millilitre peut être détectable. Préparez un contrôle vierge en ajoutant 60 microlitres de tampon de lyse et 60 microlitres de tampon liant à un microtube. Préparez un contrôle positif en ajoutant 12 microlitres de protéines de contrôle Rho, 48 microlitres de tampon de lyse et 60 microlitres de tampon liant.

Sortez la plaque d’affinité Rho de son sac et placez-la sur la glace. Dissoudre la poudre dans les puits avec 100 microlitres d’eau distillée glacée. Gardez la plaque sur la glace.

Décongeler la cellule gelée snap lysates dans un bain d’eau fixé à 25 degrés Celsius. Ajouter le volume calculé de tampon de lyse glacée à chaque échantillon pour normaliser la concentration en protéines. Transférer 60 microlitres d’échantillons normalisés de froid glacé sur des microtubes et ajouter 60 microlitres de tampon liant.

Bien mélanger et garder sur la glace. Retirez complètement l’eau de la microplaque par un scintillement vigoureux, suivi de cinq à sept robinets durs sur un tapis de laboratoire. Ajoutez 50 microlitres des échantillons normalisés, un contrôle vierge et un contrôle positif des puits en double.

Placez la plaque sur un shaker orbital pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Remarque : la vitesse du shaker doit être réglée à 300 rpm. Effacer les échantillons de la plaque en feuilletant, et laver deux fois avec 200 microlitres de tampon de lavage à température ambiante.

Retirez vigoureusement le tampon de lavage des puits après chaque lavage en feuilletant, puis en tapant, et gardez la plaque sur le banc à température ambiante. Ajouter 200 microlitres de tampon présentant des antigènes à température ambiante dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant deux minutes. Feuilletez la solution des puits et lavez-les trois fois avec 200 microlitres de tampon de lavage à température ambiante.

Ajouter 50 microlitres d’anticorps primaires anti-RhoA fraîchement préparés à chaque puits. Placez la plaque sur un shaker orbital pendant 45 minutes à 300 rpm, réglée à 25 degrés Celsius. Feuilletez la solution des puits et lavez-les trois fois avec 200 microlitres de tampon de lavage à température ambiante.

Ajouter 50 microlitres d’anticorps secondaires anti-RhoA fraîchement préparés à chaque puits. Placez la plaque sur le dessus d’un shaker orbital pendant 45 minutes, à 300 rpm, réglée à 25 degrés Celsius. Préparez le réaccente de détection HRP en mélangeant des volumes égaux de Reagent A et reagent B.Flick sur la solution de chaque puits, et lavez-le trois fois avec 200 microlitres de tampon de lavage à température ambiante.

Ajouter 50 microlitres de réaccente de détection HRP fraîchement préparée à chaque puits. Lisez le signal de luminescence dans les trois à cinq minutes pour obtenir un signal maximal. Analyser les résultats à l’aide d’un logiciel approprié.

Nos résultats montrent que la simvastatine a diminué la localisation de RhoA dans la fraction membranaire. Ce qui a augmenté est l’accumulation dans la fraction cytosolic. Fait intéressant, simvastatin augmenté GTP lié à la RhoA.Why?

Nous nous attendons à ce que la simvastatine diminue cette activité. Il est très important qu’ils mesurent à la fois la localisation sous-cellulaire de cette protéine, et mesurent gtp liaison à cette protéine pour avoir une évaluation finale de l’activité des petits Rho GTPases.