Nouvelle méthode de livraison ADN plasmidique aux souris vessie urothélium par électroporation

L’objectif global de cette méthode est d’administrer des plasmides d’ADN dans l’urothélium de la vessie de souris vivantes in vivo pour la surexpression des gènes ou l’édition du génome. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer de la vessie, telles que comment différentes mutations génétiques favorisent-elles la progression du cancer de la vessie ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre un moyen rapide et pratique d’administrer des gènes dans la vessie sans les problèmes de sécurité et les obstacles techniques associés aux vecteurs viraux.

J’ai d’abord eu l’idée de cette méthode d’essayer d’utiliser des virus associés modifiés pour l’administration de l’ADN, ce qui n’a pas bien fonctionné pour la vessie. L’implication de cette technique peut également s’étendre à la thérapie génique, car l’électroporation peut obtenir une livraison efficace de plasmides d’ADN dans les cellules urothéliales. Ofir Stefanson et Yueli Liu de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure.

Pour commencer cette procédure, autoclavez tous les instruments chirurgicaux et stérilisez l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 %. Vaporisez fréquemment les instruments chirurgicaux et les gants avec de l’éthanol à 70 % lors de l’exécution des procédures ultérieures pour maintenir des conditions stériles. Pour commencer, anesthésez la souris et rasez la zone chirurgicale.

Pour épuiser l’urine, appliquez du lubrifiant sur le cathéter et assurez-vous que sa surface externe est entièrement couverte. Ensuite, insérez le cathéter dans l’ouverture de l’urètre de la souris et poussez-le lentement jusqu’à ce qu’il atteigne la vessie. Appuyez doucement sur l’abdomen pour aider à l’épuisement de l’urine.

Ensuite, jetez l’urine à l’aide d’une pipette dans un bécher à déchets, puis pipetez 80 microlitres de PBS dans l’extrémité externe du cathéter avec l’autre extrémité toujours dans la vessie. Ensuite, fixez soigneusement une seringue d’un millimètre au cathéter. Poussez doucement la seringue pour injecter le PBS dans la vessie.

Laissez un peu de PBS dans le cathéter pour éviter de créer des bulles d’air dans la vessie. Ensuite, retirez la seringue et attendez que le PBS s’écoule de la vessie. Appuyez doucement sur l’abdomen pour évacuer le PBS, puis jetez le PBS dans le cathéter avec une pipette dans le bécher à déchets.

Répétez le lavage PBS deux fois de plus. Pour chaque vessie à transfecter, préparez au moins 20 microlitres de plasmide d’ADN à raison d’un microgramme par microlitre. Ensuite, ajoutez un microlitre de bleu trypan aux 20 microlitres de solution plasmidique et un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et une pipette pour bien mélanger.

Pour administrer le plasmide, appliquez de l’éthanol à 70 % sur l’abdomen. Faites une incision verticale d’un centimètre pour ouvrir la peau abdominale au-dessus de la vessie. Ensuite, coupez la couche musculaire pour exposer la vessie.

Pipetez au moins 20 microlitres de solution de plasmide et de bleu de trypan dans l’extrémité externe du cathéter et détachez-le de la seringue. Ensuite, injectez la solution plasmidique dans la vessie. Si la vessie devient bleue, l’injection est réussie.

Laissez un peu de liquide dans le cathéter pour éviter de créer des bulles d’air dans la vessie. Ensuite, saisissez l’oraifice urétral externe et retirez le cathéter et la seringue. Utilisez une ficelle pour resserrer l’orifice urétral externe.

Faites deux boucles avec la ficelle, puis attachez-les avec deux nœuds. Il s’agit d’une étape cruciale qui nécessite la coopération de deux personnes. Assurez-vous que les nœuds sont bien serrés afin que les plasmides ne s’échappent pas.

Maintenant, allumez le générateur d’électroporation. Pincez la vessie avec deux électrodes et appuyez sur la pédale pour effectuer l’électroporation. Pour maintenir la vessie soutenue, on peut pincer l’arrière de l’incision abdominale avec une pince à épiler.

Évitez tout contact entre la pince à épiler et les électrodes car cela pourrait générer une étincelle. Lorsque c’est fait, suturez l’ouverture abdominale et cutanée avec une suture chirurgicale stérile. Retirez la ficelle et appliquez des clips.

Appliquez de l’iode sur la plaie, puis retirez l’animal du système isoflurane. Administrer l’analgésique à base de buprénorphine par voie sous-cutanée pour soulager la douleur post-chirurgicale. Gardez l’animal sur le coussin chauffant et remettez-le dans la cage familiale après sa récupération complète.

Vérifiez l’animal au moins une fois par jour pour une mobilité normale, des comportements d’abreuvement et d’alimentation, et aucun signe d’infection jusqu’à ce que l’incision soit guérie. Puis, une semaine plus tard, retirez les clips. Administrer des injections subséquentes d’analgésique à base de buprénorphine si l’animal présente des symptômes de douleur tels qu’une réduction du toilettage, une agressivité accrue et une vocalisation.

Pour démontrer l’administration réussie du gène dans l’urothélium de la vessie, 20 microlitres de plasmide pCAG-GFP et de solution de bleu de trypan ont été injectés dans l’urètre et cinq impulsions électriques ont été administrées. On voit ici l’électroporation réussie qui a rendu la vessie verte après 48 heures, tandis qu’une vessie de contrôle négatif qui n’a pas subi d’électroporation n’a montré aucun signal GFP. La coloration immunofluorescente des tissus de la vessie sectionnés a été réalisée avec des anticorps CK5, CK18 et GFP.

On a observé que le signal GFP était présent dans les cellules parapluies, intermédiaires et basales, mais pas dans la couche musculaire, ce qui indique une bonne spécificité de l’administration du plasmide dans l’urothélium. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 15 minutes si elle est exécutée correctement. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs dans le domaine du cancer de la vessie pour construire de nouveaux modèles de souris autochtones afin d’étudier les mécanismes de progression de la maladie.