Name: Nouvelle méthode de livraison ADN plasmidique aux souris vessie urothélium par électroporation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Découvrez une méthode d'électroporation pour la livraison de plasmides ADN dans l'urothélium vésical de souris. Cette technique rapide permet la surexpression génique et l'édition du génome pour la recherche sur le cancer de la vessie.

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Nous remercions le professeur Bin Chen, m. Yue Zhang et Kendy Hoang pour aide à la mise en place du système d’électroporation. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Santa Cruz Cancer avantage Group et le NIH à Z.A.W.

Toutes les procédures décrites ici ont été réalisées selon les directives et les règlements de l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Californie à Santa Cruz.
1. le plasmide et préparation des outils
<ol><li>Pour chaque vessie à transfecter, préparer au moins 20 µL de plasmides d’ADN (1 µg/µL).</li>
	<li>Ajouter 1 µL de bleu Trypan dans les 20 µL de solution de plasmide dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Pipette pour bien mélanger.</li>
	<li>Autoclave tout surgical instruments et stériliser l’espace de travail avec l’éthanol à 70 %. Vaporiser les instruments chirurgicaux et des gants d’éthanol à 70 % fréquemment ou utiliser un stérilisateur de perle de verre lorsque vous effectuez les étapes suivantes pour maintenir des conditions stériles.</li>
</ol>2. anesthésier l’Animal
<ol><li>Utilisent un système d’anesthésie top table à anesthésier l’animal à l’isoflurane. Le réservoir de2 O et régler le débitmètre oxygène à 1 L/min.</li>
	<li>Placez une souris de C57BL/6J femelle adulte dans la chambre de l’induction. Allumer et régler le vaporisateur isoflurane à 3 % pour l’induction. La souris doit être en anesthésie dans 2 min. administrer buprénorphine analgésique (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée après le retrait de la souris de la salle d’induction pour l’analgésie préventive. Remarque : Dans le présent protocole, les souris femelles sont utilisés, car ils sont plus faciles à manipuler au cours du cathétérisme de l’urètre. Le protocole fonctionne également pour les souris mâles, mais il faut redoubler de prudence lorsque vous effectuez l’étape 3.</li>
	<li>Appliquer la pommade ophtalmique aux yeux de l’animal pour prévenir le dessèchement. Placez votre souris anesthésiée vers le haut sur un coussin chauffant avec son nez dans le cône de nez. Tournez l’interrupteur de circuit d’air pour laisser l’isoflurane passent par le cône de nez.</li>
	<li>Retenir la tête et le cône de nez avec du ruban adhésif. Ajuster le vaporisateur isoflurane à 2 % pour l’entretien.</li>
	<li>Retenir les branches avec du ruban adhésif. Effectuer des tests d’orteil-pincée pour s’assurer que l’animal soit en anesthésie profonde et ensuite se raser la zone abdominale.</li>
</ol>3. urines appauvrissement et rinçage de vessie
<ol><li>Appliquer du lubrifiant sur le cathéter (24G, longueur de 2,11 cm, diamètre extérieur de 0,045 cm) et faire en sorte que sa surface extérieure est entièrement couvert.</li>
	<li>Introduire le cathéter dans l’ouverture de l’urètre et pousser doucement jusqu'à ce qu’il atteigne la vessie, date à laquelle l’urine devrait sortir dans le cathéter. Appuyez doucement sur l’abdomen pour aider l’appauvrissement de l’urine.<ol>
<li>Vérifiez si le cathéter est correctement inséré dans la vessie par l’observation automatique urine hors-flux. Éviter la perforation de la paroi de l’urètre et la vessie et appliquer du lubrifiant plusieurs fois si nécessaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jeter l’urine avec une pipette dans un bécher de déchets.</li>
	<li>Pipetter 80 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans l’extrémité du cathéter, avec l’autre extrémité reste dans la vessie. Fixer attentivement une seringue de 1 mL au cathéter. Poussez doucement la seringue pour injecter le PBS dans la vessie. Laissez quelques PBS dans le cathéter pour éviter de créer des bulles d’air dans la vessie.</li>
	<li>Retirer la seringue. Attendez que PBS s’écouler hors de la vessie. Appuyez doucement sur l’abdomen pour évacuer les PBS.</li>
	<li>Jeter le PBS dans le cathéter avec une pipette dans le bécher de déchets.</li>
	<li>Répétez les PBS de lavage (étapes 3,4-3,6) pour deux fois plus. Remarque : Il est indispensable de travailler doucement au cours de ces étapes de lavage. Sang dans le cathéter ou l’échec d’automatique hors-flux du liquide indique habituellement que l’urètre est transpercée. Il est également important d’éviter l’introduction de bulles d’air, puisqu’ils diminuerait l’efficacité de l’électroporation.</li>
</ol>4. plasmide livraison
<ol><li>Appliquer l’éthanol à 70 % à l’abdomen de la souris et utiliser un scalpel pour pratiquer une incision verticale de 1 cm pour ouvrir la peau abdominale au-dessus de la vessie.</li>
	<li>Pipetter, au moins 20 µL de solution de bleu de Trypan plus de plasmide dans l’extrémité du cathéter et connecter la seringue.</li>
	<li>Injecter la solution de plasmide dans la vessie. Si la vessie devient bleue, l’injection est réussie. Laisser peu de liquide dans le cathéter pour éviter de créer des bulles d’air dans la vessie.</li>
	<li>Prenez l’orifice urétral externe à l’aide de pinces à épiler et puis retirer le cathéter et la seringue. Utilisez une corde pour serrer l’orifice urétral externe. Faites deux boucles avec la chaîne et puis lier avec deux noeuds. Remarque : Resserrement de l’urètre est important pour empêcher le reflux du liquide de plasmide.</li>
	<li>Mettre en marche le générateur d’électroporation avec les paramètres suivants : 33V, 50 ms de temps de travail et Mme 950 intervalle de temps.</li>
	<li>Tenez la vessie avec des pincettes et pincer la vessie avec deux électrodes. Poussez la pédale pour effectuer l’électroporation. Remarque : Les impulsions électriques sont configurées produisant 5 fois à intervalles courts après chaque pédale poussoir. La souris peut se contracter dans ce processus. En poussant la pédale plusieurs fois peut accroître l’efficacité de la livraison, mais trop d’impulsions électriques peuvent endommager l’intégrité des tissus de l’urothélium.<ol>
<li>Évitez tout contact entre les pinces et les électrodes, car cela va générer une étincelle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. le recouvrement
<ol><li>L’ouverture abdominale et de la peau avec stériles pour sutures chirurgicales et agrafes de suture. Appliquer l’iode sur la plaie.</li>
	<li>Enlever l’animal du système isoflurane. Administrer un analgésique de buprénorphine (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée pour soulager la douleur postopératoire.</li>
	<li>Garder l’animal sur le coussin chauffant et renvoyez-le à la cage après récupération complète. Vérifier l’animal au moins une fois par jour pour la mobilité normale et d’abreuvement des comportements et aucun signe d’infection jusqu'à ce que l’incision est guérie et puis retirez les clips. Administrer les injections ultérieures de buprénorphine analgésique si l’animal affiche symptôme douleur tels que la diminution de toilettage, augmente l’agressivité et vocalisation.</li>
</ol>

<ol><li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mighty+mouse%3A+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li>
<li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li>
<li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+engineering+of+oncogenic+chromosomal+rearrangements+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li>
<li>Xue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+direct+mutation+of+cancer+genes+in+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Sanchez-Rivera, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modelling+of+cooperating+genetic+events+in+cancer+through+somatic+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing.</a> Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).</li>
<li>Romero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1+loss+promotes+Kras-driven+lung+cancer+and+results+in+dependence+on+glutaminolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis.</a> Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).</li>
<li>Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+properties+of+the+intact+mammalian+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium.</a> Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).</li>
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<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syn3+provides+high+levels+of+intravesical+adenoviral-mediated+gene+transfer+for+gene+therapy+of+genetically+altered+urothelium+and+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).</li>
<li>Engler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+improves+adenovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+to+the+bladder+epithelium+of+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents.</a> Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).</li>
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<li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+technologies+for+medicine%3A+principles%2C+applications%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), e1883(2008).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Électroporation améliore la perméabilité de la membrane cellulaire et est une technologie puissante pour le gène Electrotransfert16. Livraison de gène dans la vie des rongeurs par électroporation a été fréquemment utilisé en neurobiologie champs17,18,19,20,21. Ses applications potentielles dans de nombreux autres organes n’ont pas été e...

Modèles de souris génétiquement modifiées (edged) jouent un rôle essentiel dans l’expansion de nos connaissances sur le développement animal, fonctions gène in vivoet mécanismes de la progression de la maladie1,2. Gregory de la lignée germinale sont traditionnellement développés de deux façons. La première est la création de souris transgéniques par injection pronucléaire de plasmides d’ADN suivie par la transplantation des zygotes dans les femelles pseudo-gravides. L’autre est la génération de souris knock-out/knock-in par recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires et le développement des chimères. Masquage conditionnel des gènes chez le type spécifique de tissus ou de cellules d’intérêt consiste à l’élevage des allèles génétiquement avec Cre et flox sites depuis plusieurs générations. L’ensemble du processus peut être long et coûteux, surtout si l’objectif est de cibler des gènes multiples tissu-spécifique. Récemment, édition de gène des technologies telles que les répétitions de courtes palindromiques régulièrement dois‑je cluster (CRISPR) ont été appliquées à plusieurs organes des souris pour provoquer des altérations génétiques tissu-spécifique du cancer autochtone modélisation3, 4,5,6,7 ou maladie correcte des mutations in situ8,9. Dans ces études, la livraison des vecteurs gRNA est habituellement réalisée par infection adénovirale ou des gènes de l’organe ou l’injection hydrodynamique de queue veineuse. La relative facilité de livraison des composants CRISPR pour le poumon et le foie a grandement amélioré la commodité et l’efficacité du cancer modélisation dans ces organes par rapport à des modèles de souris Cre-Lox basés traditionnels.
L’urothélium de vessie est d'où sont originaires la plupart des tumeurs de la vessie. La livraison des vecteurs d’ADN à l’urothélium vessie pour le traitement de modélisation ou de gène du cancer est entravée par une couche de glycosaminoglycanes sur la surface apicale urothéliales, qui agit comme une barrière pour l’adhérence des virus infectieux10,11. Plusieurs agents de prétraitement tels que Syn3 et dodécyl-β-d-maltoside ont été utilisés pour perturber cette barrière et améliorer les adénovirus infection efficacité12,13,14. Si les virus adéno-associés (AAVs) peuvent infecter efficacement la vessie n’a été signalé. Dans l’ensemble, une méthode de livraison basée non viraux serait souhaitable. Nous décrivons ici une nouvelle méthode développée en laboratoire pour la prestation efficace de plasmide d’ADN à l’urothélium de souris par cathétérisme de l’urètre et électroporation. Parce que notre approche n’implique pas de prétraitement chimique de la couche de glycosaminoglycanes ou la production de virus, il a considérablement simplifie la livraison de plasmides d’ADN à l’urothélium de vessie de souris et devrait faciliter diverses des études in vivo des maladies de la vessie.

<table><tbody><tr><td>BD 1mL TB Seringue</td><td>Fisher</td><td>148232E</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>Sigma</td><td>B9275-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pince à épiler</td><td>Roboz Institut chirurgical</td><td>RS-5005</td><td>Traiter avec 70 % d’éthanol avant utilisation chirurgicale</td></tr><tr><td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td><td>Harvard</td><td>Apparatus 450052</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Disposable Safelet I.V. Cathéters</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24G, longueur 2,11 cm, diamètre extérieur 0,045 cm</td></tr><tr><td>Micro dissection extra fine Ciseaux</td><td>chirurgicaux Roboz Instr</td><td>RS-5135</td><td>Traiter avec 70 % d’éthanol avant utilisation chirurgicale</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>K& H Tapis de repos chauffant pour petits animaux, 9 x 12 pouces</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Couvrir le tapis chauffant avec des serviettes en papier</td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique</td><td>Fisher</td><td>NC0849514</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Embouts de pipette 200 &micro ; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette, ajustement universel ; 0,1 à 10 & micro ; L</td><td></td><td>Fisher 02707438(CS)</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P2</td><td>Gilson</td><td>F144561</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P200N</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>plasmide CAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>16664</td><td></td></tr><tr><td>Platinum tweezertrode 5 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450489</td><td>5 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5880</td><td>Traiter avec 70 % d’éthanol avant utilisation chirurgicale</td></tr><tr><td>Cordon de corde</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm 1mm couture en cuir plat fil ciré cordon</td></tr><tr><td>Ruban adhésif, Scotch</td><td>Fisher</td><td>19047257</td><td></td></tr><tr><td>Therio-gel Lubrifiant vétérinaire</td><td>PBS santé animale</td><td>353-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Dessus de table système d’anesthésie</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl violet suture 18" FS-2 coupe 5-0</td><td>Fisher</td><td>NC0578475</td><td></td></tr><tr><td>Walgreens Povidone Iodine 10 %</td><td>Walgreens</td><td>953982</td><td></td></tr><tr><td>Clip de plaie</td><td>Fisher</td><td>018045</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur de clip de plaie</td><td>Fisher</td><td>01804</td><td></td></tr></tbody></table>

nouvelle méthode de livraison adn plasmidique aux souris vessie urothélium par électroporation

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Modèles de souris génétiquement modifiées (edged) sont extrêmement précieux en révélant de nouveaux aperçus biologiques sur les mécanismes de déclenchement et la progression des maladies humaines comme le cancer. L’ablation des tissus spécifiques ou d’un cellule types in vivoou souris transgéniques et conditionnel ont été fréquemment utilisés pour la surexpression du gène. Cependant, la génération de modèles de souris de lignée germinale peut être lente et coûteuse. Des avancées récentes gène édition de technologies et la faisabilité de délivrer des plasmides d’ADN par infection virale ont permis la génération rapide des modèles de cancer de souris autochtone non germinale pour plusieurs organes. La vessie est un organe qui a été difficile pour les vecteurs viraux accéder, en raison de la présence d’une couche de glycosaminoglycanes couvrant l’urothélium. Nous décrivons ici une nouvelle méthode développée en laboratoire pour une prestation efficiente des plasmides d’ADN dans la souris vessie urothélium in vivo. L’instillation intravésicale de plasmides d’ADN pCAG-GFP et électroporation de vessie chirurgicalement exposée, nous montrons que le plasmide d’ADN peut être livré plus précisément dans les cellules urothéliales de vessie pour expression transitoire. Notre méthode fournit un moyen rapide et pratique pour la surexpression et inactivation de gènes dans la vessie de souris et peut être appliqué à la construction de négociants de cancer de la vessie et d’autres maladies urologiques.

Pour démontrer le succès de la livraison de gène dans la vessie urothélium, nous avons utilisé le plasmide de15 pCAG-GFP électroporation. 20 µL de plasmides et de solution de bleu de Trypan est injecté à travers l’urètre et 5 impulsions électriques ont été administrées. Après 48 h, nous disséqué la vessie de souris et observé des patchs de fluorescence GFP sous le microscope de fluorescence de dissection, alors qu’un négatif contrôler la vessie qui n’a pas subi d’é...

Nous décrivons une nouvelle méthode pour la livraison de plasmides d’ADN dans les cellules urothéliales de souris la vessie in vivo par cathétérisme de l’urètre et électroporation. Il offre un moyen rapide et pratique pour générer des modèles autochtones murins de maladies de la vessie.

Nouvelle méthode de livraison ADN plasmidique aux souris vessie urothélium par électroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

L’objectif global de cette méthode est d’administrer des plasmides d’ADN dans l’urothélium de la vessie de souris vivantes in vivo pour la surexpression des gènes ou l’édition du génome. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer de la vessie, telles que comment différentes mutations génétiques favorisent-elles la progression du cancer de la vessie ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre un moyen rapide et pratique d’administrer des gènes dans la vessie sans les problèmes de sécurité et les obstacles techniques associés aux vecteurs viraux.J’ai d’abord eu l’idée de cette méthode d’essayer d’utiliser des virus associés modifiés pour l’administration de l’ADN, ce qui n’a pas bien fonctionné pour la vessie. L’implication de cette technique peut également s’étendre à la thérapie génique, car l’électroporation peut obtenir une livraison efficace de plasmides d’ADN dans les cellules urothéliales. Ofir Stefanson et Yueli Liu de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure.Pour commencer cette procédure, autoclavez tous les instruments chirurgicaux et stérilisez l’espace de travail avec de l’éthanol à 70 %. Vaporisez f

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Une méthode de transfert de gènes dans le cerveau de souris en développement est décrit en utilisant une méthode unique de chirurgie et la forme particulière des électrodes. Cette technique unique permet la transfection d'ADN plasmidique temporellement et spatialement, ce qui aidera de nombreux neuroscientifiques à étudier le développement du cerveau.

Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure basée sur un cathéter pour vider et rincer la vessie d’un modèle murin. La souris préparée peut ensuite être utilisée pour d’autres procédures expérimentales.

Appauvrissement de l’urine et rinçage de la vessie dans un modèle murin : une procédure basée sur un cathéter pour vider et laver la vessie urinaire murine

Cette vidéo démontre l’administration du plasmide d’ADN dans l’urothélium de la vessie de souris à l’aide d’une combinaison de techniques de cathétérisme urétral et d’électroporation. La procédure décrite permet de générer des modèles de cancer de la vessie chez la souris.

Administration de plasmides d’ADN dans l’urothélium de la vessie de souris : une procédure basée sur l’électroporation pour administrer efficacement des plasmides d’ADN dans les cellules urothéliales de la vessie murine afin de générer des modèles génétiquement modifiés

Dans cette vidéo, nous présentons le protocole d’injection hydrodynamique de plasmides dans le bassinet du rein de souris pour la transfection d’acides nucléiques. Cette technique permet l’administration de plasmides spécifiques à un organe en utilisant le principe de la pression hydrostatique élevée, qui pousse avec force les plasmides dans le site spécifique sans causer de lésions tissulaires.

Injection hydrodynamique du bassinet du rein : une technique pour délivrer directement de l’ADN dans les cellules rénales d’un modèle murin

Cette vidéo démontre l’administration de l’ADN plasmidique dans les cellules neuronales cérébelleuses d’embryons murins en utilisant l’électroporation in utero. Cette méthode est utile pour comprendre la fonction in vivo des gènes dans le développement normal du cerveau et les changements dans l’expression des gènes des cellules neuronales au cours de la progression tumorale.

Livraison de gènes basée sur l’électroporation in utero : une technique pour injecter de l’ADN plasmidique dans des cellules cérébelleuses embryonnaires d’embryons murins

Cette vidéo présente la technique d’électroporation qui introduit de l’ADN plasmidique codant pour des protéines fluorescentes dans des précurseurs de cellules granulaires cérébelleuses primaires de souris.

Administration de gènes in vitro médiée par électroporation : une technique d’impulsion électrique pour introduire des plasmides codant pour des protéines rapporteures fluorescentes dans des cellules en culture

L'implantation de cellules cancéreuses dans l'organe d'origine peut servir de modèle préclinique utile pour évaluer de nouvelles thérapies. Des cellules de carcinome de la vessie MB49 peuvent être cultivées à l'intérieur de la vessie après l'instillation intravésicale. Ce protocole illustre le cathétérisme de la vessie de la souris dans le but d'implantation de la tumeur et la livraison adénoviral.

Un modèle de cancer de la vessie orthotopique d&#39;études livraison Gene

La surface piale est une zone de progéniteur unique dans le système nerveux central qui reçoit une attention croissante. Ici, nous détaillons une méthode de manipulation génétique rapide de cette zone souches en utilisant une méthode d'électroporation modifié. Cette procédure peut être utilisée pour les enquêtes cellulaires et moléculaires de lignées cellulaires et les voies de signalisation impliquées dans la différenciation cellulaire et d'élucider le sort et les propriétés des cellules...

Néonatale Pial électroporation de surface

Cet article décrit la micro-injection et l'électroporation de testicule de souris in vivo en tant que technique de transfection de cellules testiculaires de souris pour étudier les procédés uniques de la spermatogenèse. Le protocole présenté implique des étapes de préparation capillaire en verre, la micro-injection par le conduit efférent, et la transfection par électroporation.

In Vivo L&#39;électroporation et microinjection de testicule de souris

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique est une méthode viable pour moduler l’expression des gènes sans compromettre la contractilité musculaire chez la souris.

Électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris

Des méthodes sont décrites pour la génération de grandes quantités d’adénovirus recombinants, qui peuvent ensuite être utilisés pour transduire l’urothélium de rongeur natif permettant l’expression de transgènes ou la régulation négative de produits géniques endogènes.

Expression de transgènes dans l’urothélium vésical natif par transduction médiée par adénovirus

Découvrez une méthode d'électroporation pour la livraison de plasmides ADN dans l'urothélium vésical de souris. Cette technique rapide permet la surexpression génique et l'édition du génome pour la recherche sur le cancer de la vessie.

Nouvelle méthode de livraison ADN plasmidique aux souris vessie urothélium par électroporation

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