Isolement des matières réservoir glande mandibulaire de Bornéo ' explosion des fourmis (Formicidae) pour l’analyse par GC-MS et MetaboliteDetector Volatilome

Les travailleurs mineurs de l’espèce de fourmi Colobopsis explodens sont disséqués afin d’isoler la cireuse de contenu stocké dans les réservoirs de leurs glandes mandibulaires hypertrophiés pour ultérieures d’extraction par solvant et l’analyse par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. L’annotation et l’identification des constituants volatils en utilisant le logiciel open source MetaboliteDetector est également décrite.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la métabolomique des insectes. L’approche du profilage des métabolites peut être utilisée pour étudier l’écologie chimique des fourmis en élucidant le rôle des substances volatiles dans l’interaction avec d’autres organismes. Le principal avantage du flux de travail présenté est qu’il se compose de deux parties distinctes qui peuvent être appliquées indépendamment.

Premièrement, l’isolement physique du réservoir de la glande mandibulaire et de son contenu, et deuxièmement, le profilage non ciblé et l’identification des constituants organiques volatils dans l’échantillon biologique d’intérêt. La démonstration de la procédure sera assurée par Michaela Hoenigsberger, une doctorante talentueuse de mon laboratoire. Avant de disséquer les fourmis, dans une hotte, nettoyez une boîte de Pétri en verre et les instruments de dissection à l’aide de mouchoirs en papier et d’un mélange de méthanol et d’eau.

Conservez le plat à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, prenez la masse des flacons à filetage court de 1,5 millilitre, y compris leurs bouchons à vis qui contiennent du silicium PTFE Septa. Conservez les flacons sur de la glace.

Ensuite, placez une compresse froide malléable congelée dans une boîte en mousse de polystyrène. Chargez ensuite la boîte de Pétri sur la compresse froide et mettez une fourmi congelée dans la boîte. Maintenant, examinez la fourmi avec un microscope stéréoscopique.

Vérifiez l’intégrité de ses compartiments gastriques. La fourmi doit avoir une région de gaster intacte. N’utilisez pas de fourmis avec des gasters plats ou des traces de contenu de réservoir de glande mandibulaire durci sur la surface de leur corps.

Maintenant, isolez le contenu du réservoir de la glande mandibulaire de la fourmi. Utilisez une pince pour saisir le propodium et le pétiole, puis séparez doucement ces segments du corps. Ensuite, saisissez le gaster au tergite quatre à l’aide d’une pince fine.

À l’aide d’une autre paire de pinces, saisissez le tergite un et retirez-le doucement en le décollant. Répétez ce processus pour arracher les tergites deux et trois, de sorte que la partie gastrole des réservoirs de la glande mandibulaire soit principalement visible. Les réservoirs des glandes mandibulaires sont de couleur jaune chez les fourmis ouvrières C.Explodens, mais la couleur peut varier du blanc au jaune et au rouge chez d’autres espèces.

Ensuite, à l’aide d’une aiguille de dissection, retirez délicatement le contenu cire des réservoirs de glandes mandibulaires appariés en les grattant hors du compartiment gastrique. N’enlevez que les parties du contenu du réservoir de la glande mandibulaire qui peuvent être isolées sans appliquer de pression sur les autres glandes et structures corporelles présentes dans le fourmi-gaster. Il n’est pas nécessaire de collecter tout le contenu du réservoir de la glande mandibulaire.

Maintenant, prélevez le contenu du réservoir de la glande mandibulaire en le touchant doucement avec la pointe de l’aiguille de dissection jusqu’à ce qu’il y adhère. Transférez ensuite le contenu de la glande dans un flacon froid à filetage court de 1,5 millilitre. Il peut être nécessaire de déplacer la pointe de l’aiguille le long de la paroi du flacon et d’étaler le contenu de la glande sur la paroi du flacon.

Gardez la collection couverte et sur de la glace jusqu’à ce qu’elle puisse être analysée. Entre les dissections, nettoyez à nouveau les instruments et la coupelle avec le mélange de méthanol et d’eau. Pour faire un échantillon analytique, combinez le contenu du réservoir de glandes de plusieurs fourmis.

Dans ce cas, le contenu des glandes de cinq fourmis ouvrières de C. explodens est regroupé. Pour un contrôle, prélever des échantillons composés de la glande de Dufour qui est adjacente aux réservoirs de la glande mandibulaire. Avant d’extraire le contenu glandulaire, déterminez les masses des échantillons analytiques.

Ensuite, ajoutez 14 parties d’acétate d’éthyle de haute pureté glacé en volume, à une partie de tissu en masse. Vortex la préparation pendant cinq minutes dans des conditions refroidies. Ensuite, centrifugez les échantillons pendant 10 minutes et collectez les surnageants.

Environ 55 à 75 microlitres de surnageant sont attendus à partir d’un échantillon de cinq fourmis. Transférez chaque surnageant dans un flacon à filetage court de 1,5 millilitre prérefroidi avec un micro-insert de 0,1 millilitre, et fermez hermétiquement les flacons à l’aide de bouchons à vis contenant des trous et des septa en PTFE en caoutchouc rouge. Pour une séquence de mesure complète du SMGC, préparer un flacon à fil court de 1,5 millilitre avec un mélange étalonné d’indice de rétention, fabriqué en diluant des solutions étalons d’alcanes disponibles dans le commerce dans de l’hexane, à huit milligrammes par millilitre par composé.

Ensuite, préparez un autre flacon d’acétate d’éthyle pur pour servir d’ébauche de solvant. Sur le plateau refroidi de l’échantillonneur automatique du chromatographe en phase gazeuse, chargez d’abord l’ébauche de solvant, deuxièmement, le mélange d’étalonnage de l’indice de rétention, troisièmement, l’extrait du contenu du réservoir de glande mandibulaire et quatrièmement, l’extrait du contenu de la glande de Dufour. Placez les échantillons avec le plateau sur de la glace pour les transporter vers le chromatographe en phase gazeuse.

Insérez le plateau dans l’échantillonneur automatique refroidi. Pour chaque échantillon, injecter un aliquat d’un microlitre dans la spécification de masse GC pour la séparation chromatographique sur une colonne adaptée aux composés cibles. Par exemple, une colonne d’interface utilisateur HP-5MS.

Ensuite, définissez les paramètres GC appropriés. Par exemple, utilisez de l’hélium comme gaz porteur avec un débit constant d’un millilitre par minute. Utilisez une rampe de température du four commençant à 40 degrés Celsius pendant deux minutes, suivie d’une rampe de 10 degrés Celsius par minute jusqu’à 330 degrés Celsius.

Suivi d’une attente de sept minutes. Avec ces paramètres, réglez la température d’entrée sur 270 degrés Celsius. Maintenant, si nécessaire, ajustez les rapports de division pour la spécification de masse GC.

injection afin qu’ils fournissent des formes de pic et des intensités adéquates pour les composés d’intérêt. Réglez la température auxiliaire à 350 degrés Celsius. Pour la spécification de masse.

Utilisez les paramètres suivants. Une température de source MS de 230 degrés Celsius, une température MS quadruple de 150 degrés Celsius, une plage de balayage allant de faible masse 30 à haute masse 500, pour aboutir à une fréquence de balayage d’environ trois balayages par seconde. Et un délai de solvant de 4,1 minutes pour l’ébauche de solvant et les échantillons expérimentaux, ou un délai de solvant de 6,1 minutes pour le mélange d’étalonnage à indice de rétention.

Une fois les mesures terminées, ouvrez le logiciel d’analyse de données du SMGC et exportez les données sous forme de fichier de projet AIA sur un dispositif de stockage portable pour faciliter le transfert des données vers un ordinateur doté d’un système d’exploitation Linux 64 bits. Pour analyser les données, suivez la description textuelle du protocole d’utilisation du logiciel de détection de métabolites. Sur le terrain, les fourmis ont été collectées et congelées à moins 20 degrés Celsius pendant deux jours, puis stockées à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient analysées.

Le contenu du réservoir des glandes mandibulaires de cinq fourmis ouvrières de C. explodens a été regroupé et mesuré par le SMGC. L’analyse des données a révélé des dizaines de composés présumés du contenu des glandes. Les deux métabolites dominants dans l’extrait du contenu du réservoir de la glande mandibulaire ont provoqué une surcharge de la colonne.

C’est pourquoi le même échantillon a été analysé à nouveau à un rapport de division plus élevé de 50 pour un. La contamination croisée du contenu du réservoir de la glande mandibulaire par la constitution de la glande de Dufour a été étudiée en faisant examiner des échantillons de glandes de Dufour. Ces contaminants présentaient des temps de rétention tardifs, commençant à environ 29 minutes.

Les métabolites présumés détectés du contenu du réservoir de la glande mandibulaire ont été identifiés sur la base d’une combinaison de similitude de spectre et d’indice de rétention avec une bibliothèque interne. De cette façon, il a été possible de confirmer l’identité d’environ 10 % des métabolites détectés, dont certains sont répertoriés comme composés un à cinq. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler, d’extraire et de déterminer, un à la fois, les métabolites en choisissant la mesure MS.

Une fois maîtrisés, l’isolement, l’extraction par solvant et l’acquisition de données d’un même échantillon peuvent être effectués en deux heures environ s’ils sont effectués correctement. En fonction de la complexité du profil des composés organiques volatils, le temps nécessaire à l’évaluation des données variera. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder l’échantillon refroidi en permanence, de la collecte à l’analyse.

De plus, avant la section, il faut vérifier que le gaster de la fourmi est physiquement intact. Cette procédure peut également être combinée avec une quantification comparative ou absolue des métabolites, afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la composition métabolique et les différentes conditions environnementales, ou les quantités absolues de constituance en conserve. De manière pratique, les étapes d’extraction, de mesure et d’évaluation des données de ce protocole peuvent également être appliquées à plusieurs systèmes biologiques, tels que d’autres insectes, micro-organismes ou plantes.