Name: Protocole pour créer des blessures chroniques chez les souris diabétiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Découvrez un protocole pour créer des blessures chroniques chez les souris db/db-/- diabétiques en induisant un stress oxydatif et en inhibant les enzymes antioxydantes. Ce modèle reproduit fidèlement les plaies chroniques humaines.

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Les auteurs n'ont aucune reconnaissance.

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Une fois que les blessures chroniques sont créées sur les souris, le modèle peut être utilisé pour étudier les processus de cicatrisation des plaies altérées impliqués dans l'initiation de la chronicité. Le modèle peut également être utilisé pour tester l'efficacité d'un large éventail de produits chimiques et de médicaments qui peuvent inverser le développement des plaies chroniques et une altération de la guérison et conduire à la fermeture des plaies et la guérison. Différents moments après l'début de la chronicité pe...

La cicatrisation des plaies implique des processus cellulaires et moléculaires complexes qui sont réglés temporellement et spatialement, organisés en étapes séquentielles et qui se chevauchent, qui impliquent de nombreux types de cellules différentes, y compris, mais sans s'y limiter, la réponse immunitaire et le vasculaire système1. Immédiatement après que la peau supporte une blessure, les facteurs et les cellules sanguines s'agrégent au site de la plaie et initient la cascade de coagulation pour former un caillot. Après l'homéostasie est atteint, les vaisseaux sanguins se dilatent pour laisser entrer l'oxygène du site de la plaie, les nutriments, les enzymes, les anticorps et les facteurs chimiotactiques qui chemoattract polymorphonucléocytes pour effacer le lit de blessure de débris étrangers et sécréter des enzymes protéolytiques 2. Les plaquettes activées sécrètent une variété de facteurs de croissance pour stimuler les kératinocytes au bord de la plaie pour réépithéhélier la zone blessée. Les monocytes recrutés sur le site de la plaie se différencient en macrophages qui phagocytose les bactéries et les neutrophiles morts et sécrètent des facteurs supplémentaires pour maintenir la prolifération des kératinocytes et les signaux pro-migrateurs. Dans la phase de prolifération, tandis que la réépithélialisation continue, le nouveau tissu de granulation composé des fibroblastes, des monocytes/macrophages, des lymphocytes, et des cellules endothéliales continuent le processus de reconstruction2. L'angiogenèse est stimulée par la promotion de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales, ce qui entraîne le développement de nouveaux vaisseaux. L'épithélialisation et le remodelage de la matrice extracellulaire construisent une barrière contre l'environnement. Comme la plaie guérit et le tissu de granulation évolue en cicatrice, l'apoptose élimine les cellules inflammatoires, les fibroblastes et les cellules endothéliales sans causer de dommages supplémentaires aux tissus. La force de tension du tissu est augmentée par des fibroblastes transformant divers composants de la matrice extracellulaire, comme le collagène, de sorte que le tissu nouvellement formé soit presque aussi fort et flexible que la peau non blessée2.
Toute déviation de cette progression très concertée vers la fermeture des plaies conduit à des blessures altérées et/ou chroniques3. Les blessures chroniques sont caractérisées par l'effort oxydant accru, l'inflammation chronique, la microvasculature endommagée, et la matrice anormale de collagène dans la blessure4. Le stress oxydatif, particulièrement dans la blessure, peut retarder la fermeture de blessure2,5. Lorsque, dans la première étape de la cicatrisation des plaies, la phase inflammatoire devient non réglementée, le tissu hôte assume des dommages importants dus à un afflux continu de cellules inflammatoires5 qui libèrent des enzymes cytotoxiques, une augmentation des radicaux libres d'oxygène, et médiateurs inflammatoires non réglementés, entraînant la mort cellulaire6,7.
Dans ce microenvironnement destructeur, les bactéries qui forment des biofilms tirent parti des nutriments de l'hôte et contribuent aux dommages du tissu hôte2. Ces biofilms sont difficiles à contrôler et à éliminer parce que les substances polymères extracellulaires hydratées composées de protéines, d'ADN, d'ARN et de polysaccharides permettent aux bactéries hébergées à l'intérieur d'être tolérantes aux thérapies antibiotiques conventionnelles et d'éviter le réponse immunitaire innée et adaptative de l'hôte2,8,9.
L'étude des plaies chroniques est cruciale parce qu'elles ont un impact de 6,5 millions de personnes et coûtent 40 milliards de dollars par an aux États-Unis seulement10. Les patients atteints de diabète ont des risques accrus de développer des plaies chroniques qui nécessitent une amputation afin de contenir la propagation de l'infection. Ces patients ont un risque de mortalité de 50% dans les 5 ans de l'amputation qui est attribué au mécanisme de pathophysiologie du diabète11. La relation entre le système immunitaire de l'hôte et le microbiome dans la cicatrisation des plaies est un sujet vital de la recherche en cours parce que les conséquences des blessures chroniques, si elles ne sont pas résolues, comprennent l'amputation et la mort12.
Bien qu'un effort significatif ait été investi dans la compréhension de la façon dont les blessures chroniques se développent chez l'homme, on ne sait toujours pas comment et pourquoi les blessures chroniques se forment. Les expériences visant à étudier les mécanismes de guérison altérée sont difficiles à mener chez l'homme, et les spécialistes de la cicatrisation des plaies ne voient que les patients atteints de plaies chroniques qui ont déjà atteint la chronique pendant des semaines à des mois. Ainsi, les spécialistes sont incapables d'étudier quels processus ont mal tourné qui conduisent la plaie à se développer pour devenir chronique2. Il y a un manque de modèles animaux qui récapitulent la complexité des blessures chroniques humaines. Jusqu'à ce que notre modèle ait été développé, aucun modèle pour des études chroniques de blessure n'a existé.
Le modèle de blessure chronique a été développé chez les souris qui ont une mutation dans le récepteur de leptine (db/db-/-)13. Ces souris sont obèses, diabétiques, et ont altéré la guérison, mais ne développent pas de blessures chroniques14. Les niveaux de glucose sanguin sont en moyenne d'environ 200 mg/dl, mais peuvent atteindre 400 mg/dl15. Lorsque des niveaux élevés de stress oxydatif (OS) dans le tissu de la plaie sont induits immédiatement après la blessure, la plaie devient chronique16. Les plaies db/db-/- sont considérées comme chroniques de 20 jours et restent ouvertes pendant 60 jours ou plus. Biofilm produit par des bactéries peut être vu se développer à partir de trois jours après la blessure; un biofilm mature peut être vu 20 jours après la blessure et persiste jusqu'à la fermeture de la plaie. Les bactéries biofilm-formant que nous trouvons dans ces souris sont également trouvées dans les blessures chroniques diabétiques humaines.
Le stress oxydatif est induit par le traitement des plaies avec deux inhibiteurs des enzymes antioxydantes, la catalase et le peroxidase de glutathion, deux enzymes avec la capacité de décomposer le peroxyde d'hydrogène. Le peroxyde d'hydrogène est une espèce réactive d'oxygène et peut causer des dommages cellulaires par l'oxydation des protéines, des lipides, et de l'ADN. La catalase catalyse la décomposition du peroxyde d'hydrogène en produits chimiques moins nocifs, l'oxygène et l'eau. 3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) inhibe la catalase en se liant spécifiquement et de façon covalente au centre actif de l'enzyme, l'inactivant17,18,19. ATZ a été utilisé pour étudier les effets du stress oxydatif à la fois in vitro et in vivo par l'inhibition de la catalase20,21,22,23,24. Le peroxidase de glutathion catalyse la réduction du peroxyde d'hydrogène par l'antioxydant, le glutathion, et est une enzyme importante qui protège la cellule contre le stress oxydatif25. L'acide mercaptosuccinique (MSA) inhibe le peroxidase de glutathion en se liant au site actif de sélénocystéine de l'enzyme avec le thiol, l'activant26. MSA a été utilisé pour étudier les effets du stress oxydatif in vitro et in vivo ainsique 20,27,28.
Ce nouveau modèle de blessures chroniques est un modèle puissant à étudier parce qu'il partage plusieurs des mêmes caractéristiques observées dans les plaies chroniques diabétiques humaines, y compris l'inflammation prolongée de l'OS accru et la formation naturelle de biofilm du microbiome de peau. Les blessures ont altéré l'interaction dermale-épidermique, le dépôt anormal de matrice, l'angiogenèse pauvre et la vascularisation endommagée. Les blessures chroniques se développeront chez les souris mâles et femelles, de sorte que les deux sexes peuvent être utilisés pour étudier les plaies chroniques. Par conséquent, le modèle de blessure chronique peut contribuer de manière significative à faire progresser la compréhension fondamentale de la façon dont ces blessures commencent. L'utilisation de ce modèle de plaie chronique peut fournir des réponses à des questions fondamentales sur la façon dont la chronicité est initiée/réalisée grâce à des contributions de la physiologie de la cicatrisation des plaies altérées et du microbiome de l'hôte.

<table><tbody><tr><td>N° B6. BKS(D)-Leprdb/J&nbsp ;</td><td>Le Laboratoire Jackson&nbsp ;</td><td>00697</td><td>Homozygotes et hétérozygotes disponibles&nbsp ;</td></tr><tr><td>Nair Hair Epilover Lotion à l’Aloe Apaisant et à la Lanoline</td><td>Nair</td><td></td><td>un dépilatoire chimique</td></tr><tr><td>Buprenex (buprénorphine HCl)</td><td>Henry Stein Animal Health</td><td>059122</td><td>0,3 mg/ml, Classe 3</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ)</td><td>TCI</td><td>A0432</td><td></td></tr><tr><td>Acide mercaptosuccinique (MSA)</td><td>Aldrich</td><td>88460</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon de phosphate (PBS)</td><td></td><td></td><td>stérilisé en autoclave</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein Santé animale</td><td>029405</td><td>NDC 11695-6776-2</td></tr><tr><td>Le réservoir d’oxygène</td><td></td><td></td><td>doit être compatible avec le système de vaporisation</td></tr><tr><td>Vaporisateur d’isoflurane</td><td>JA Baulch & Associés&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tondeuse à cheveux Wahl</td><td></td><td></td><td>Lithium Ion Pro</td></tr><tr><td>Acu Punch 7mm poinçons de biopsie cutanée</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P750</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm&nbsp ;</td><td>3M</td><td>Réf : 1624W</td><td>Film transparent pansement (6 cm x 7 cm)</td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Conair</td><td></td><td>Moist Dry Heating Pad</td></tr><tr><td>Seringues à insuline</td><td>BD</td><td>329461</td><td>0,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2")</td></tr><tr><td>70 % éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux tranchants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spatule</td><td></td><td></td><td></td>en métal mince</tr><tr><td>Tube Cône de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nez</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de souris Gants</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petits récipients</td><td></td><td></td><td></td> en plastique</tr></tbody></table>

protocole pour créer des blessures chroniques chez les souris diabétiques

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Les blessures chroniques se développent à la suite d'une régulation défectueuse dans un ou plusieurs processus cellulaires et moléculaires complexes impliqués dans une bonne guérison. Ils ont un impact de 6,5 millions d'euros et coûtent 40 milliards de dollars par an aux États-Unis seulement. Bien qu'un effort important ait été investi pour comprendre comment les blessures chroniques se développent chez l'homme, des questions fondamentales restent sans réponse. Récemment, nous avons développé un nouveau modèle de souris pour les plaies chroniques diabétiques qui ont de nombreuses caractéristiques des blessures chroniques humaines. En utilisant db/db-/- souris, nous pouvons générer des blessures chroniques en induisant des niveaux élevés de stress oxydatif (OS) dans le tissu de la plaie immédiatement après la blessure, en utilisant un traitement unique avec des inhibiteurs spécifiques aux enzymes antioxydantes catalase et peroxidase de glutathion. Ces plaies ont des niveaux élevés de système d'exploitation, développent le biofilm naturellement, deviennent entièrement chroniques dans les 20 jours après le traitement et peuvent rester ouvertes plus pendant plus de 60 jours. Ce nouveau modèle a beaucoup de dispositifs des blessures chroniques diabétiques chez l'homme et peut donc contribuer de manière significative à faire progresser la compréhension fondamentale de la façon dont les blessures deviennent chroniques. Il s'agit d'une percée majeure parce que les blessures chroniques chez l'homme causent une douleur et une détresse importantes aux patients et entraînent une amputation si elles ne sont pas résolues. De plus, ces blessures sont très coûteuses et prennent beaucoup de temps à traiter et entraînent une perte importante de revenu personnel pour les patients. Les progrès dans ce domaine d'étude grâce à l'utilisation de notre modèle de plaie chronique peuvent améliorer considérablement les soins de santé pour des millions de personnes qui souffrent de cette maladie débilitante. Dans ce protocole, nous décrivons en détail la procédure pour causer des blessures aigues pour devenir chronique, qui n'a pas été faite avant.

La figure 5 illustre un exemple de blessure sans traitement d'inhibiteurs progressant vers la fermeture de la plaie et une plaie avec le traitement des inhibiteurs progressant vers la chronicité. Le pansement transparent a été laissé en place sur la plaie chronique afin que le biofilm et l'accumulation de liquide puissent être vus.
L'initiation chronique de blessure a lieu en moins de 6 heures et la...

Les blessures chroniques sont développées des blessures aigues sur un modèle diabétique de souris en induisant des niveaux élevés de stress oxydatif après une blessure cutanée pleine épaisseur. La plaie est traitée avec des inhibiteurs pour la catalase et le peroxidase de glutathion, ayant pour résultat la guérison altérée et le développement de biofilm par les bactéries présentes dans le microbiome de peau.

Protocole pour créer des blessures chroniques chez les souris diabétiques

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Ce modèle de souris peut aider à répondre aux questions dans le domaine médical de la chronicité des plaies. L’avantage majeur de ce modèle est que les blessures chroniques chez la souris imitent de nombreux aspects des blessures chroniques chez l’homme. Pour commencer, placez la souris sur une surface propre et maintenez-la en place en pinçant la base de sa queue.Ensuite, préparez les tondeuses à cheveux et être prêt à les retirer rapidement si la souris fait des mouvements soudains. Raser tout le dos du cou à la queue, y compris tout autour de la queue. Exécutez légèrement la lame contre la direction de la croissance des cheveux pour la coupe la plus efficace.N’appuyez pas sur les tondeuses profondément dans la peau car cela peut meurtrir ou couper. Ensuite, préparez la peau pour une application de lotion depilatory. Humidifier la peau avec une serviette en papier imbibé d’eau pour prévenir les brûlures chimiques.Appuyez légèrement avec suffisamment de pression pour mouiller les cheveux coupés contre la peau. Ensuite, pendant que la peau est mouillée, frotter une petite cuillerée de lotion depilatory dans la région rasée pendant 15 à 20 secondes. Une fois appliquée, laisser la lo

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Nous avons développé une technique mini-invasive pour créer un lapin modèle ischémique plaie oreille en divisant l'artère centrale et le nerf et le paquet vasculo-nerveux crânienne. Un tunnel sous-cutané coupe alors tous les tissus sous-cutanés. Cette procédure entraîne des perturbations minimes et la peau peut être utilisé sans danger chez les animaux diabétiques.

Une technique simplifiée pour produire un modèle de plaie ischémique

Un modèle murin de la cicatrisation cutanée qui peut être utilisé pour évaluer les composés thérapeutiques dans des contextes physiologiques et physiopathologiques.

Modèle murin de la cicatrisation

Cellules souches dérivées d’adipeux (ASCs) sont facilement isolées et récoltées dans la graisse des rats normaux. Feuilles de NCP peuvent être créés à l’aide de la cellule-fiche technique et peuvent être transplantés dans Zucker rats gras diabétiques présentant pleine épaisseur défauts avec OS exposé de l’épiderme et ensuite recouvert d’une double couche de peau artificielle.

Création et la Transplantation d’une feuille adipeux dérivées de cellules souches (ASC) dans un modèle de cicatrisation diabétique

Nous décrivons ici un nouveau modèle murin diabétique utilisant des souris sans poils pour en temps réel, non invasif, surveillance des infections de plaies du biofilm de bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode peut être adaptée pour évaluer l’infection d’autres espèces de bactéries et micro-organismes génétiquement modifiés, y compris les biofilms multi-espèces et tester l’efficacité des stratégies antibiofilm.

Venez sur le côté de la lumière: In Vivo surveillance des Infections à Pseudomonas aeruginosa Biofilm dans les plaies chroniques dans un modèle murin glabres diabétique

L’échafaudage DOX-CL préparé satisfaisait aux conditions préalables d’un pansement DW idéal en matière de résistance mécanique, de porosité, d’absorption d’eau, de taux de dégradation, de libération prolongée, d’antibactérien, de biocompatibilité et de propriétés anti-inflammatoires, qui sont considérées comme essentielles pour la récupération des tissus endommagés chez les DW.

Échafaudage composite collagène-chitosane chargé en doxycycline pour la guérison accélérée des plaies diabétiques

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Un protocole pour la construction d’un modèle de plaie de rat du diabète de type 1

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Découvrez un protocole pour créer des blessures chroniques chez les souris db/db-/- diabétiques en induisant un stress oxydatif et en inhibant les enzymes antioxydantes. Ce modèle reproduit fidèlement les plaies chroniques humaines.

Protocole pour créer des blessures chroniques chez les souris diabétiques

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