Oral Infection bactérienne et excrétion chez Drosophila melanogaster

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’infection et de l’immunité, telles que comment les individus réagissent-ils aux différentes racines de l’infection ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’examiner les immunocompétents intestinaux qui jouent un rôle important dans la défense de l’hôte contre les infections, qui sont principalement acquises par l’alimentation. Cette méthode a le potentiel d’être utilisée chez d’autres espèces que la drosophile, et peut également être utilisée pour étudier d’autres agents pathogènes, tels que les virus.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à faire en raison de la rigueur expérimentale requise lors de ces protocoles de microbiologie. Conservez les mouches dans des flacons en plastique de 23 millilitres contenant sept millilitres de milieu Lewis fraîchement préparé. Pour boucher les flacons, utilisez un coton non absorbant.

Conservez-les à 25 degrés Celsius sous un cycle lumière-obscurité de 12-12 avec une humidité relative d’environ 60 %Tous les 14 jours, transférez 20 à 30 adultes dans un nouveau flacon alimentaire, avec un trait de levure sèche ajoutée à la surface. Après deux à trois jours, jetez les mouches adultes si suffisamment d’œufs ont été pondus. Pour collecter les œufs, préparez une cage de population.

Tout d’abord, ajoutez du coton imbibé d’eau pour apporter de l’humidité. Ensuite, pour un substrat, utilisez une plaque de 75 millilitres remplie d’agar aux pommes et d’une pâte de levure. Enfin, chargez les adultes dans une cage de population.

Toutes les 24 heures, remplacez la plaque et vérifiez la présence d’œufs. Une fois qu’un nombre suffisant d’œufs est pondu, retirez les mouches mortes de l’assiette et la pâte de levure restante de l’assiette collectée. Ensuite, plongez la gélose dans 20 millilitres de PBS et délogez doucement les œufs à l’aide d’un pinceau fin.

Transférez les œufs dans le PBS dans un tube de 50 millilitres. Laissez ensuite les œufs couler au fond pendant environ cinq minutes. Ensuite, raccourcissez l’extrémité d’une pointe p1000 d’environ 4 millimètres, puis utilisez-la pour aspirer les œufs en solution.

Un dégagement instantané du piston est efficace pour les tirer. Transférez ensuite les œufs dans le PBS dans un tube de 1,5 millilitre et laissez les œufs se déposer. Maintenant, coupez quatre millimètres d’une pointe p20 filtrée, puis utilisez-la pour transférer une aliquote d’œufs sur une fiole de nourriture à développer.

Pour cultiver des cultures de P. entomophila et de P. aeruginosa, inoculez 10 millilitres de bouillon LB avec 100 microlitres d’un bouillon congelé et incubez-le pendant la nuit avec 150 tr/min d’agitation. Ensuite, transférez la culture dans une fiole conique de deux litres et remplissez-la de LB jusqu’au début de la pente des parois de la fiole. Lorsque la sous-culture atteint la phase de croissance exponentielle, transférez des volumes égaux dans un nombre pair de tubes de 50 millilitres, puis faites-les tourner.

Ensuite, récupérez les surnageants et faites-les tourner à nouveau. Combinez maintenant les granulés bactériens de tous les tubes en remettant chaque palette en suspension dans cinq millilitres de surnageant, puis recombinez les suspensions dans un seul tube de 50 millilitres. Ensuite, après un autre essorage, remettez les bactéries en suspension dans une solution à 5 % de saccharose.

Diluez maintenant un échantillon de cette suspension 100 fois pour mesurer de manière fiable la DO de la suspension et ajustez la concentration finale de la suspension en fonction de la dose infectieuse souhaitée. Deux à quatre heures avant l’infection buccale, transférez les mouches dans des flacons de gélose standard ne contenant pas de nourriture. Pendant ce temps, pour chaque mouche, préparez un flacon d’infection.

Tout d’abord, chargez le couvercle d’un tube d’échantillon de sept millilitres avec 500 microlitres de gélosée au sucre standard et laissez-le se solidifier. Ensuite, collez un disque de papier filtre dans la gélose, puis pipetez 100 microlitres de culture bactérienne directement sur le disque filtrant. Pour les contrôles, utilisez 5 % d’eau de saccharose.

Après la période de famine, transférez les mouches simples dans les tubes préparés. Après avoir incubé les mouches pendant 18 à 24 heures, stérilisez les mouches en surface. Chargez les individus dans un tube contenant 100 microlitres d’éthanol à 70 %.

Après 20 à 30 secondes, retirez l’éthanol et remplacez-le par 100 microlitres d’eau distillée trois fois. Après encore 20 à 30 secondes, retirez l’eau. Ajoutez ensuite 100 microlitres de PBS et homogénéisez la mouche.

Transférez l’homogénat dans la rangée supérieure d’une plaque de 96 puits et ajoutez 90 microlitres de 1x PBS dans chaque puits en dessous. Ensuite, à l’aide d’aliquotes de 10 microlitres, diluez en série cet échantillon pour distinguer une plage de valeurs CFU. Ensuite, plaquez les dilutions en série sur une plaque de gélose nutritive LB en gouttelettes de cinq microlitres.

Positionnez les gouttelettes de manière à ce qu’elles soient discrètement placées sur la plaque. Ensuite, incubez l’assiette pendant la nuit. Le lendemain, calculez le nombre d’UFC à partir de la dilution qui produit 10 à 60 colonies bien visibles.

Pour mesurer la charge bactérienne, transférez une seule mouche infectée dans un tube à microcentrifuger stérile de 1,5 millilitre. Ensuite, comme décrit précédemment, stérilisez les mouches en surface, puis homogénéisez-les et effectuez une analyse UFC. Pour mesurer l’excrétion bactérienne, transférez les mouches simples dans des tubes de 1,5 millilitre contenant environ 50 microlitres de milieu Lewis.

Changez le tube toutes les 24 heures. Après que trois tubes ont été remplis pendant 24 heures, jetez les mouches. Après chaque transfert, mesurez les bactéries contenues dans le tube.

Mélangez le contenu du tube avec 100 microlitres de PBS à l’aide d’un vortex. Mesurez ensuite les UFC dans le mélange en plaquant des dilutions en série. À l’aide du protocole décrit, l’effet de l’infection bactérienne buccale a été étudié par le biais de la mortalité et de l’excrétion bactérienne.

L’excrétion a été mesurée longitudinalement chez les mêmes mouches et à des moments uniques le long d’une charge bactérienne interne. D. melanogaster a été infecté par voie orale par P. aeruginosa ou P. entomophila. L’infection buccale réussie s’est produite après une période d’exposition de 12 ou 24 heures à des cultures bactériennes.

Il a été nécessaire d’utiliser une culture plus concentrée de P. entomophila. Les mouches Oregon R mâles et femelles ont éliminé l’infection à P. aeruginosa au même rythme et ont excrété le même nombre d’UFC de P. aeruginosa. Cependant, lorsqu’elles étaient infectées par P. entomophila, les mouches Oregon R mâles et femelles différaient dans le nombre de bactéries excrétées en fonction du temps.

Les mâles et les femelles sont morts de P. aeruginosa et de P. entomophila à des rythmes différents. En comparaison, les mouches mutantes qui n’ont pas la matrice péritrophique protectrice dans l’épithélium intestinal meurent plus rapidement, tout comme les mutants qui n’ont pas de voie immunitaire MI fonctionnelle. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’infecter la drosophile par voie orale avec des bactéries et de mesurer les aspects clés de la pathologie qui en résulte, tels que la durée de vie et l’excrétion bactérienne.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être pratiquée environ six à huit heures, sur une période de deux jours, si elle est correctement exécutée. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la qRT-PCR peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que la façon dont l’infection modifie l’expression des gènes immunitaires. N’oubliez pas que travailler avec des agents pathogènes bactériens peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port de l’équipement de protection individuelle approprié et le travail à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures.