Caractérisation des glycoprotéines dont le pli d’immunoglobuline par cristallographie aux rayons x et Techniques biophysiques

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des glycoprotéines. Fournir un aperçu de la fonction de la protéine, du rôle des glycanes liés à l’azote, ainsi que du mécanisme et de l’action des antibiotiques ciblant la glycoprotéine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être appliquée à n’importe quelle glycoprotéine d’intérêt.

Faciliter la caractérisation structurale et biophysique d’un large éventail de cibles glycoprotéiques. Hong Cui, coordinateur de projet de recherche dans notre laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Pour commencer, préparez et transfectez les cellules comme indiqué dans le protocole de texte.

Récoltez les cellules par centrifugation à 6 371 fois g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Conservez le surnageant, puis utilisez un filtre de 0,22 micron pour le filtrer. Chargez le surnageant filtré à quatre millilitres par minute sur une colonne Ni-NTA dans un système de chromatographie de paillasse.

Après cela, lavez la colonne avec trois à quatre volumes de tampon de lavage. Diluer la glycoprotéine purifiée de la colonne à l’aide d’un gradient de tampon d’élution, tout en recueillant les fractions. Tirez les fractions contenant le pic éludé dans un dispositif de filtration centrifuge avec une limite de poids moléculaire nominal de 10 kilodaltons.

Concentrez ensuite par centrifugation à 4 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes ou jusqu’à ce que l’échantillon atteigne un volume de 500 microlitres. Injectez la glycoprotéine concentrée dans une boucle d’échantillonnage de 500 microlitres. Chargez la glycoprotéine sur une colonne d’exclusion granulométrique haute performance pré-équilibrée sur un système FPLC à quatre degrés Celsius tout en collectant des fractions.

À l’aide d’un dispositif de filtration centrifuge dont la limite de poids moléculaire nominal est de 10 kilodaltons, concentrez l’ECD déglycosylée pure à 4 000 fois G et quatre degrés Celsius jusqu’à ce que la concentration souhaitée soit obtenue. Après avoir déterminé la concentration en protéines, centrifugez l’échantillon à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, pour éliminer la poussière et les autres contaminants.

Ensuite, ajoutez 80 microlitres de solution de cristallisation à partir d’un tamis de cristallisation commercial à chaque puits de réservoir dans une plaque de cristallisation à 96 puits. Utilisez un robot de cristallisation pour distribuer des gouttes de protéines dans les puits de la plaque de cristallisation. En utilisant un volume total de goutte de 200 nanolitres à un rapport de protéine purifiée à une solution de cristallisation.

Après cela, scellez la plaque avec du ruban adhésif. Transférez la plaque scellée dans un imageur de plaque pour l’inspection par la lumière visible et ultraviolette. Identifiez les conditions qui donnent les têtes de cristaux de glycoprotéine initiales et optimisez davantage ces cristaux comme décrit dans le protocole de texte.

Cryoprotégez les cristaux en les trempant dans une solution de liqueur mère complétée par 20 % de glycérol. Montez ensuite les cristaux dans CryoLoops. À l’aide d’azote liquide, congelez les cristaux montés avant la collecte des données.

Après avoir produit des cristaux bien diffractants dans une plaque de cristallisation à 24 puits, préparez une solution mère de ligand de 50 millimolaires et de 20 millimolaires de Tris à pH 9,0 avec 150 millimolaires de chlorure de sodium. Ajoutez différentes concentrations de cette solution de ligand à la goutte préalablement préparée contenant les cristaux ECD. Scellez la goutte pour des durées d’incubation allant de cinq minutes à cinq jours.

À l’aide d’un microscope optique, suivez visuellement les cristaux pour identifier tout changement possible de morphologie. Après l’incubation, montez les cristaux à l’aide de CryoLoops et cryoprotégez-les dans une solution de liqueur mère complétée par 20 % de glycérol. Pour commencer l’interférométrie de biocouche, préparez 50 millimètres de tampon cinétique 1X à partir du tampon cinétique 10X, comme indiqué dans le protocole texte.

Ajoutez 200 microlitres de ce tampon dans une plaque de pré-mouillage. Transférez six biocapteurs Ni-NTA dans la plaque et laissez-les s’hydrater dans le tampon pendant 10 minutes. Ensuite, diluez l’ECD marqué His-Tage dans un millilitre de tampon cinétique 1X à une concentration finale de 25 nanogrammes par microlitre.

Et préparer des dilutions en série du FAB purifié. Maintenant, faites cuire les réactifs dans une micro-plaque de 96 puits, comme on le voit ici. Où B représente le tampon cinétique 1X, L représente la charge de glycoprotéine marquée His, les entrées numériques représentent les concentrations de FAB diluées et R représente le tampon de régénération.

Transférez les biocapteurs hydratés dans des puits contenant 1X Kinetics Buffer pendant 60 secondes pour les référencer. Ensuite, chargez la glycoprotéine à une concentration de 25 nanogrammes par microlitre pendant 240 secondes à 1 000 tr/min. Remettez les biocapteurs dans les puits contenant 1X Kinetics Buffer pendant 60 secondes pour une deuxième ligne de base.

Transférez les capteurs dans les puits contenant les dilutions en série de FAB pendant 180 secondes. Après cette phase d’association, transférez les biocapteurs dans le tampon cinétique 1X pour une étape de dissociation de 180 secondes. Ensuite, ouvrez le logiciel d’analyse.

Sous le premier onglet, importez, puis sélectionnez les données. Sous l’onglet deux, première étape de sélection des données, choisissez la sélection du capteur. Mettez en surbrillance les puits de référence, puis cliquez avec le bouton droit de la souris pour définir le puits de référence.

À la deuxième étape, soustraction, sélectionnez les puits de référence. Après cela, sous la troisième étape aligner l’axe Y, sélectionnez la ligne de base et définissez une plage de temps de 0,1 seconde à 59,8 secondes. À l’étape quatre, sélectionnez la correction entre les étapes et alignez-vous sur la dissociation.

Ensuite, à l’étape cinq, traitez le filtrage Savitzky-Golay et cliquez sur traiter les données. La porte de l’onglet trois. À la deuxième étape, analysez avec un modèle un-à-un, sélectionnez association et dissociation, sélectionnez l’ajustement global et regroupez par couleur.

Faites un clic droit sur les courbes, cliquez sur définir la couleur et définissez toutes les courbes sur les couleurs souhaitées. Après cela, sélectionnez ajuster les courbes. Si les données sont bien ajustées, exportez le résultat en cliquant sur Enregistrer le rapport.

Répétez l’expérience pour toutes les conditions souhaitées. Dans cette étude, plusieurs constructions du domaine extracellulaire CD22 sont clonées avec succès dans le vecteur d’expression pHL-sec. Ces constructions sont ensuite surexprimées dans les lignées cellulaires de mammifères HEK293-F et HEK293-S.

Alors que les cultures contenant environ un million et un million et demi de cellules par millilitre, exprimaient des niveaux très similaires de glycoprotéines. Les cultures de seulement un demi-million de cellules par millilitre exprimaient nettement moins. Ensuite, des cultures sont récoltées et la glycoprotéine ECD est isolée par chromatographie d’affinité et d’exclusion stérique pour purifier toutes les constructions afin d’obtenir une homogénéité de taille.

Produisant un échantillon très pur pour la cristallisation et les études biophysiques. À la suite de ces procédures, d’autres méthodes telles que la microscopie électronique à particules uniques peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la structure tridimensionnaliste du domaine extracellulaire complet ou des complexes protéiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’exprimer, de purifier et de caractériser structurellement et biophysiquement les glycoprotéines, leurs ligands et les anticorps ciblés.