Visualisation du microbiote dans Guts Tick par hybridation entier-Montez In Situ

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’entomologie des tiques, telles que l’évaluation de la présence de bactéries viables dans la tique dans l’espace et dans le temps. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle ne nécessite pas de sectionnement des tiques ou d’équipements coûteux, et qu’elle permet la visualisation spatiale et temporelle des transcrits de gènes. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront du mal car elle implique plusieurs étapes et réactifs.

Cependant, cette technique n’est pas laborieuse. Bien que cela puisse prendre environ trois jours, le temps de manipulation n’est que de quelques heures par jour. En préparation, nourrissez les tiques collectées pendant 48 à 72 heures avant le prélèvement intestinal.

Pour disséquer l’intestin de la tique, ajoutez 20 à 30 microlitres de solution MEMFA sur une lame de verre propre. Placez ensuite la tique dans le MEMFA et ajustez la mise au point sur la tête de la tique. Maintenant, à l’aide d’une paire de lames de rasoir stériles en acier à haute teneur en carbone, coupez la région de la tête au niveau du scutum, laissant le corps de la tique intact.

Ensuite, appuyez doucement sur le corps pour pousser les diverticules intestinaux et les glandes salivaires hors de la cuticule du corps. Ensuite, sans endommager les intestins, séparez-les soigneusement des glandes salivaires et déposez soigneusement les coupures sur une lame de rasoir. Collectez tous les entrailles récoltées dans un tube de 1,5 millilitre dans 500 micromètres de MEMFA.

Ensuite, incubez le tube à température ambiante en le balançant doucement pendant une heure. Le lendemain, déshydratez le tissu comme indiqué dans le protocole textuel et stockez-le à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer un panier en filet, utilisez d’abord une lame à un seul tranchant chauffée sur un scalpel pour couper le fond d’un tube à centrifuger de deux millilitres ou cinq millilitres.

Il peut être nécessaire de réchauffer la lame plusieurs fois avant que la coupe ne soit terminée. Ensuite, coupez un carré d’un treillis en nylon de 110 microns légèrement plus grand que les nouvelles ouvertures. Ensuite, collez le treillis à l’ouverture en appuyant légèrement le tube dans le grillage sur une plaque chauffante réglée à feu moyen/doux jusqu’à ce qu’un bon verre soit fait.

Une fois refroidi, coupez l’excédent de maille et assurez-vous qu’il n’y a pas d’espaces. Faites 24 de ces paniers pour correspondre à une assiette de 24 puits. Ensuite, découpez des trous dans le couvercle d’une plaque à 24 puits, de sorte que la lèvre du panier d’échantillon saisisse le trou et ne tombe pas à travers.

Une fois terminés, les paniers d’échantillons assemblés doivent se trouver jusqu’au fond des puits. Maintenant, utilisez ce porte-panier ajusté pour transférer des paniers d’une plaque à une autre avec une relative facilité tout au long de l’hybridation in situ. Utilisez deux plaques de ce type pour que l’échantillon puisse être préparé pour le lavage suivant pendant que l’échantillon est en incubation dans l’une.

Cette section couvre certaines étapes de l’hybridation in situ. Voir le protocole textuel pour une description complète. Pour commencer, transférez chaque échantillon de tissu fixé dans un panier d’échantillons étiqueté.

Organisez la plaque par conditions expérimentales et colorez au moins cinq boyaux par condition. Tout d’abord, réhydratez doucement les échantillons. Évitez d’introduire des bulles d’air en augmentant progressivement le rapport PBS-T / éthanol à chaque lavage.

Au cours de la première journée, après l’étape de pré-hybridation de deux heures, au lieu de jeter le tampon d’hybridation, stockez-le pour une utilisation future pendant l’essai. Plus tard, lors du traitement des échantillons avec une solution d’hybridation de sonde, couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium pour éviter l’évaporation de la solution. Le deuxième jour, chargez le tampon d’hybridation réservé dans la plaque à 24 puits et réchauffez la plaque jusqu’à 60 degrés Celsius.

Plus tard dans la journée, pour éliminer toute trace de sonde et de tampon d’hybridation, laver les échantillons deux fois avec 2x SSC pendant trois minutes par lavage. Ensuite, lavez les échantillons trois fois avec 2x SSC pendant 20 minutes par lavage à 60 degrés Celsius. Préparez ensuite l’anticorps primaire dans le tampon de blocage.

Chargez 500 microlitres de ce mélange dans chaque puits. Après l’étape de blocage, incubez à température ambiante pendant environ quatre heures ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le troisième jour, exécutez la réaction de couleur dans un substrat chromogène.

Couvrez la plaque d’échantillon avec du papier d’aluminium. Et pendant la réaction, vérifiez périodiquement la présence d’une coloration excessive avec le microscope de dissection. Le quatrième jour, il est important d’incuber et de blanchir sur une boîte à lumière, car cela permet d’éliminer toute pigmentation dans les échantillons ou coloration de la solution de Bouin, et améliore le signal de la sonde pour une visualisation claire.

Ensuite, après le lavage avec SSC, transférez soigneusement les échantillons d’intestin en inversant le panier dans une nouvelle plaque à 24 puits. Pendant que vous êtes dans les puits, rincez abondamment les paniers avec de l’éthanol à 70 %. Procédez ensuite à l’imagerie des échantillons.

Il est essentiel d’estimer la qualité des sondes d’ARN avant de les utiliser. Les sondes peuvent être vérifiées sur un gel de formaldéhyde. S’ils apparaissent sous forme de bandes brillantes et discrètes, ils sont de bonne qualité.

Lors de la coloration, une certaine variation de distribution est normale entre les réplicats biologiques ainsi qu’entre les sept paires de diverticules des intestins individuels. Par conséquent, il est préférable de teindre au moins cinq entrailles par condition pour avoir une idée du modèle de coloration moyen. La meilleure façon de mesurer le succès global est de comparer la coloration des échantillons sensoriels et antisens pour chaque condition.

Les deux doivent être développés pendant la même durée. Les échantillons sensoriels doivent avoir une couleur violette minimale ou nulle, tandis que les échantillons antisens doivent présenter une coloration robuste avec un arrière-plan minimal. Il est essentiel que les tissus soient entièrement émers dans la tache pour une exposition uniforme.

Il est important d’éviter un développement excessif de la réaction de couleur. Cela peut entraîner une grande quantité de taches de fond, et les échantillons sensoriels peuvent commencer à ressembler à des échantillons antisens. Un autre facteur qui affecte les résultats est la quantité de tiques nourries à l’avance.

Les tiques qui ne sont pas nourries ou qui ne sont nourries que pendant 24 heures sont difficiles à travailler. Leurs intestins sont plus facilement endommagés et ne se tachent pas bien. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours et demi à trois jours si elle est bien exécutée.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder toutes les fournitures énumérées dans le tableau des réactifs et des matériaux prêtes avant de commencer votre expérience. Merci d’avoir regardé, et bonne chance dans vos expériences.