Name: Visualisation du microbiote dans Guts Tick par hybridation entier-Montez In Situ (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Découvrez une méthode d'hybridation in situ whole-mount pour visualiser le microbiote viable dans les intestins de tiques. Cette technique accessible permet une analyse spatiale et temporelle sans équipement coûteux.

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Nous remercions sincèrement le Dr Mustafa Khokha, Yale University, permettant l’utilisation de ses ressources de laboratoire. Nous sommes reconnaissants à M. Wu Ming-Jie pour assistance technique excellente. EF est un enquêteur HHMI. Ce travail a été soutenu par un don du John Monsky et Jennifer Weis Monsky Lyme Disease Research Fund.

<ol><li>Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthropod+Vectors+and+Disease+Transmission%3A+Translational+Aspects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107(2015).</li>
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<li>Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+ticks%2C+mice+and+men%3A+understanding+the+dual-host+lifestyle+of+Lyme+disease+spirochaetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).</li>
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<li>Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+an+improved+whole-mount+method+for+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos.</a> Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).</li>
<li>Kernohan, K. D., Berube, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+dual+labelled+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+analysis+in+fixed+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections.</a> MethodsX. 1, 30-35 (2014).</li>
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<li>Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+straightforward+DOPE+%28double+labeling+of+oligonucleotide+probes%29-FISH+%28fluorescence+in+situ+hybridization%29+method+for+simultaneous+multicolor+detection+of+six+microbial+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations.</a> Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).</li>
<li>Pai, V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCN4+ion+channel+function+is+required+for+early+events+that+regulate+anatomical+left-right+patterning+in+a+nodal+and+lefty+asymmetric+gene+expression-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner.</a> Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).</li>
<li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos.</a> JoVE. (71), e50057(2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Il s’agit de la première utilisation d’une technique d’hybridation (WMISH) ensemble-mount sur place pour étudier la flore microbienne d’un arthropod vecteur d’agents pathogènes. Notre protocole est une adaptation de celui utilisé pour étudier le développement chez la drosophile et les embryons de grenouille25,26. Entier-Montez RNA in situ hybridation a été couramment utilisée pour localiser la transcription des gènes dans l’espace et da...

Humaine et animale des pathogènes transmis par les arthropodes vecteurs sont trouvent dans le monde entier et représentent environ 20 % des maladies infectieuses dans le monde1, mais efficace et n’existe pas de vaccin sécuritaire contre la plupart de ces agents pathogènes. Notre compréhension de l’importance du rôle des micro-organismes commensaux, symbiotiques et pathogènes, collectivement connus comme le microbiome2, en modulant et façonner la santé de presque tous les métazoaires3 est en expansion. Il est maintenant évident que les arthropodes vecteurs d’agents pathogènes hébergent également le microbiote intestinal et auraient dû être divulgués ces micro-organismes associés à vecteur d’influencer divers vecteurs pathogènes4,5. Le microbiome arthropod se compose des eubactéries, archées, les virus et les microbes eucaryotes comme les protozoaires, nématodes et champignons6. Cependant, recherche prédominant mis l’accent a sur eubactéries due, en partie, à la disponibilité de gènes marqueurs et bases de données bibliographiques pour identifier des membres bactériens spécifiques.
En mettant l’accent sur les Ixodes scapularis, la tique vectrice de plusieurs agents pathogènes humains, dont Borrelia burgdorferi7, l’agent causal de la maladie de Lyme, l’optimisation d’une technique de visualisation microbienne visait à améliorer notre compréhension des tiques microbiote intestinal dans le cadre d’interactions pathogène-vecteur. Il reste plusieurs questions à trancher dans le domaine de microbiome tique. L’intestin est le site de la première rencontre élargie entre la tique et le pathogène entrant dans le cadre des pathogènes horizontalement transférés ; par conséquent, comprendre le rôle de vecteur microbiote intestinal en modulant les interactions pathogène-vecteur révélera aperçu significatif. Tiques ont un mode unique de la digestion du repas de sang, où le traitement de la farine de sang composants prend place intracellulairement8. La lumière du tube digestif sert apparemment comme récipient pour contenir le repas de sang comme les flux de la tique et assimilation et digestion des éléments nutritifs s’ensuivent tout au long des jours d’alimentation et continuent après réplétion. Les agents pathogènes acquis par la tique pendant l’alimentation entrer la lumière du tube digestif ainsi que les farines de sang et la lumière devient donc un site principal d’interactions entre la tique, pathogène et la microflore résidente. Comme digestion produit par le biais de la réplétion et de la tique Ixodes mue, le tube digestif subit des changements structuraux et fonctionnels9. La composition et l’organisation spatiale des bactéries de l’intestin est également susceptible de varier de concert avec le milieu changeant de tube digestif. Par conséquent, il est important de comprendre l’architecture des bactéries résidentes dans l’intestin de la tique pour bien comprendre l’interaction des tiques, pathogène et microbiote intestinal.
Techniques moléculaires pour décrire le microbiote hôte associés à systématiquement utilisent les parallèles séquençage haut débit stratégies10 amplifier et de séquencer l’ADN ribosomique 16 s bactérienne (ADNr). Ces stratégies de séquençage contournent la nécessité d’obtenir des cultures axéniques de bactéries spécifiques et fournir une description détaillée de tous les membres bactériennes représentées dans l’échantillon. Néanmoins, ces stratégies sont confondus par l’incapacité à distinguer des contaminations environnementales des résidents de bona fide . En outre, lors de l’évaluation d’échantillons, comme les tiques, qui sont de petite taille et donc contiennent de l’ADN de microbiote spécifiques faible rendements, la probabilité de l’amplification des contaminants environnementaux est accrue11 et se traduit par l’interprétation ambiguë de composition de microbiome. Caractérisation fonctionnelle en conjonction avec la visualisation de certaines bactéries viables, par conséquent, sera essentielle pour définir et pour discerner le microbiome du coutil temporellement et spatialement. Pour atteindre cet objectif, nous avons profité de l’entier-Montez RNA in situ hybridation. Cette technique est couramment utilisée pour évaluer les profils d’expression génique dans les organes et les embryons12,13,14 et permet une analyse semi-quantitative de l’expression sur l’ensemble de l’échantillon d’intérêt. Cela diffère des traditionnels in situ hybridation des techniques qui utilisent des sections de tissu et nécessitent souvent une analyse approfondie du matériel sectionné avec un assemblage informatique pour prédire l’expression en entier organes15. Tandis que l’ensemble monture désigne généralement tout organismes12, entier-Montez désigne ici les boyaux entiers et organes. Les avantages d’utiliser l’approche de l’ARN entier-montent en situ hybridation afin d’évaluer l’architecture des tiques microbiote intestinal sont multiples. L’intestin de la tique est composé de 7 paires de diverticules, chaque paire variant en taille16. Les différences fonctionnelles, si il en est, parmi ces diverticules, ne sont pas compris dans le contexte de la biologie de la tique, cocher microbiote ou tique-pathogen interactions. Manipulations de l’intestin qui rompent les diverticules de l’intestin écarteraient microbiote présent dans la lumière du tube digestif ou ceux qui sont associés sans serrer le tube digestif et aboutir à une interprétation erronée de la localisation spatiale du microbiote. Fluorescence-étiquetée RNA in situ hybridation a été utilisée plus tôt pour examiner la tique gut transcriptions17 en fixant et en ouvrant les diverticules gut individuels afin d’assurer l’hybridation de la sonde et de localiser de b. burgdorferi transcriptions en sectionnant la paraffine entier tiques18. Ces deux approches nécessitent des manipulations des tissus tique avant l’hybridation qui influeraient sur l’architecture de microflore intestinale.
Dans ce rapport, nous décrivons en détail le protocole afin d’examiner la tique viable microbiote intestinal entier-montent en situ hybridation (WMISH). L’utilisation de l’ensemble de montage RNA in situ hybridation permet une compréhension globale de la présence et l’abondance des bactéries de l’intestin spécifique dans les différentes régions de l’intestin et peut stimuler de nouvelles connaissances sur la biologie gut tick dans le contexte de la colonisation de l’agent pathogène et la transmission. En outre, l’utilisation de sondes d’ARN dirigée contre des ARN bactérien spécifiques permet la détection de bactéries viables dans l’intestin de la tique.

<table><tbody><tr><td>Maille en nylon Sefar NITEX, 110 microns</td><td>Amazon</td><td>03-110/47</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-T Easy Vector System</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Digoxygenin-11-UTP</td><td>Roche</td><td>1209256910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>New England Biolabs&nbsp ;</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I(sans RNAse)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe SP6 Kit de synthèse d’ARN</td><td>New England Biolabs</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit de synthèse d’ARN à haut rendement</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Eau, sans RNase, traitée DEPC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02128-00500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M, pH 8,0</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde, 37 %</td><td>JT Baker</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600-00500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-4378</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Gibco</td><td>14300-075</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Triéthanolamine HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1502-100G</td><td></td></tr><tr><td>Anhydride acétique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>ThermoScientific/Pierce</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>SSC, 20X</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156-01000</td><td></td></tr><tr><td>ARN de levure torula</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R3629-5G</td><td></td></tr><tr><td>Héparine, sel de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Denhardt’s Solution, 50X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2532-5ML</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS hydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3023-1G</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>RNase T1</td><td>ThermoScientific&nbsp ;</td><td>EN0541</td><td></td></tr><tr><td>Acide maléique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Réactif bloquant</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigénine-AP, Fab fragments</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de lévamisol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Substrat chromogène pour phosphatase alcaline</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>11442074001</tr><tr><td>solution de Bouin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Mallinkrodt Baker, Inc</td><td>2186-01</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ARN simple brin</td><td>Ambion -Millenium</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;#11 Lames en acier à haute teneur en carbone&nbsp ;</td><td>C and A Scientific Premiere</td><td>#11-9411</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>BioRad, CA</td><td>1851148</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>ThermoScientific&nbsp ;</td><td>NanoDrop 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>VWR</td><td>DS-500E Agitateur orbital numérique Agitateur</td><td></td></tr> à <tr><td>bain d’eau</td><td>BELLCO Glass, Inc</td><td>Hot Shaker-7746-12110</td><td></td></tr><tr><td>Système de documentation Gel</td><td>BioRad</td><td>Gel Doc XR+ Système de documentation</td><td></td></tr><tr><td>Gel Microscope à fond clair&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td>NikonSM2745T</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fond clair&nbsp ;</td>Microscope à dissection <td>Zeiss</td><td>AXIO Scope.A1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>STEMI 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Caisson lumineux</td><td>VWR</td><td>102097-658</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification PCR&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de capture d’images</td><td>Zeiss</td><td>Zen lite</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’édition d’images&nbsp ;</td><td>Adobe&nbsp ;</td><td>Adobe Photoshop CS4 version 11.0</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel</td><td>d’analyse d’images National Institutes of Health</td><td>ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Instrumentation compatible avec l’automatisation</td><td>Intavis Bioanalytical Instruments, Tübingen, Allemagne).&nbsp ;</td><td>Intavis, Biolane HT1.16v</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation du microbiote dans guts tick par hybridation entier-montez in situ

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Maladies infectieuses transmises par des arthropodes vecteurs continuent de poser une menace significative pour la santé humaine dans le monde entier. Les pathogènes responsables de ces maladies, n’existent pas isolément lorsqu’ils colonisent le vecteur ; plutôt, ils s’engagent sans doute dans leurs interactions avec les microorganismes résidents dans la lumière du tube digestif. Le vecteur intestinal a été démontré à jouer un rôle important dans la transmission d’agents pathogènes pour plusieurs maladies à transmission vectorielle. Si les bactéries résidant dans l’intestin de la tique Ixodes scapularis , le vecteur de plusieurs agents pathogènes humains, y compris de Borrelia burgdorferi, influent sur la transmission de la tique d’agents pathogènes n’est pas déterminé. Nous avons besoin de méthodes permettant de caractériser la composition des bactéries associées à l’intestin de la tique afin de faciliter une meilleure compréhension des interactions entre les espèces potentielles dans l’intestin de la tique. L’utilisation entier-montent en situ hybridation pour visualiser des ARN transcrits associées à certaines espèces bactériennes permet pour la collecte de données qualitatives concernant l’abondance et la distribution de la microflore dans le tissu intact. Cette technique permet d’analyser les changements dans le milieu de la microflore intestinale au cours de la tique d’alimentation et peut également être appliquée pour analyser l’expression des gènes de la tique. Coloration de toute tique tripes rendement d’informations sur la distribution spatiale brute des ARN dans le tissu cible sans la nécessité d’une reconstruction tridimensionnelle et est moins affectée par la contamination de l’environnement, qui confond souvent basée sur le séquençage Méthodes fréquemment utilisées pour l’étude des communautés microbiennes complexes. Dans l’ensemble, cette technique est un outil précieux qui permet de mieux comprendre les interactions pathogène-vecteur-microbiote et leur rôle dans la transmission de la maladie.

La mesure et estimation de la qualité des sondes d’ARN sont essentiels avant de commencer la coloration. In vitro l’efficacité de transcription dépend fortement de la quantité et la qualité de la matrice d’ADN. Régulièrement, nous avons visualisé les sondes d’ARN sur un gel de formaldéhyde pour vérifier la pureté et la quantité de sonde généré par les réactions de la transcription. Les sondes doivent apparaître sous forme de bandes lumineuses, discrets (Figur...

Nous présentons ici un protocole pour spatialement et temporellement évaluer la présence de la microflore viable dans les tripes de tique à l’aide d’une approche modifiée entier-Montez l’hybridation in situ.

Visualisation du microbiote dans Guts Tick par hybridation entier-Montez In Situ

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’entomologie des tiques, telles que l’évaluation de la présence de bactéries viables dans la tique dans l’espace et dans le temps. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle ne nécessite pas de sectionnement des tiques ou d’équipements coûteux, et qu’elle permet la visualisation spatiale et temporelle des transcrits de gènes. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront du mal car elle implique plusieurs étapes et réactifs.Cependant, cette technique n’est pas laborieuse. Bien que cela puisse prendre environ trois jours, le temps de manipulation n’est que de quelques heures par jour. En préparation, nourrissez les tiques collectées pendant 48 à 72 heures avant le prélèvement intestinal.Pour disséquer l’intestin de la tique, ajoutez 20 à 30 microlitres de solution MEMFA sur une lame de verre propre. Placez ensuite la tique dans le MEMFA et ajustez la mise au point sur la tête de la tique. Maintenant, à l’aide d’une paire de lames de rasoir stériles en acier à haute teneur en carbone, coupez la région de la tête au niveau du scutum, laissant le corps de la tique intact.Ensuite, appuyez doucement sur le corps pour pousser les diverticules intestinaux et les glandes salivaires hors de la cuticule du corps. Ensuite, sans endommager les intestins, séparez-les soigneusement des glandes salivaires et déposez soigneusement les coupures sur une lame de rasoir. Collectez tous les entrailles récoltées dans un tube de 1,5 millilitre dans 500 micromètres de MEMFA.Ensuite, incubez le tube à température ambiante en le balançant doucement pendant une heure. Le lendemain, déshydratez le tissu comme indiqué dans le protocole textuel et stockez-le à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer un panier en filet, utilisez d’abord une lame à un seul tranchant chauffée sur un scalpel pour couper le fond d’un tube à centrifuger de deux millilitres ou cinq millilitres.Il peut être nécessaire de réchauffer la lame plusieurs fois avant que la coupe ne soit terminée. Ensuite, coupez un carré d’un treillis en nylon de 110 microns légèrement plus grand que les nouvelles ouvertures. Ensuite, collez le treillis à l’ouverture en appuyant légèrement le tube dans le grillage sur une plaque chauffante réglée à feu moyen/doux jusqu’à ce qu’un bon verre soit fait.Une fois refroidi, coupez l’excédent de maille et assurez-vous qu’il n’y a pas d’espaces. Faites 24 de ces paniers pour correspondre à une assiette de 24 puits. Ensuite, découpez des trous dans le couvercle d’une plaque à 24 puits, de sorte que la lèvre du panier d’échantillon saisisse le trou et ne tombe pas à travers.Une fois terminés, les paniers d’échantillons assemblés doivent se trouver jusqu’au fond des puits. Maintenant, utilisez ce porte-panier ajusté pour transférer des paniers d’une plaque à une autre avec une relative facilité tout au long de l’hybridation in situ. Utilisez deux plaques de ce type pour que l’échantillon puisse être préparé pour le lavage suivant pendant que l’échantillon est en incubation dans l’une.Cette section couvre certaines étapes de l’hybridation in situ. Voir le protocole textuel pour une description complète. Pour commencer, transférez chaque échantillon de tissu fixé dans un panier d’échantillons étiqueté.Organisez la plaque par conditions expérimentales et colorez au moins cinq boyaux par condition. Tout d’abord, réhydratez doucement les échantillons. Évitez d’introduire des bulles d’air en augmentant progressivement le rapport PBS-T / éthanol à chaque lavage.Au cours de la première journée, après l’étape de pré-hybridation de deux heures, au lieu de jeter le tampon d’hybridation, stockez-le pour une utilisation future pendant l’essai. Plus tard, lors du traitement des échantillons avec une solution d’hybridation de sonde, couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium pour éviter l’évaporation de la solution. Le deuxième jour, chargez le tampon d’hybridation réservé dans la plaque à 24 puits et réchauffez la plaque jusqu’à 60 degrés Celsius.Plus tard dans la journée, pour éliminer toute trace de sonde et de tampon d’hybridation, laver les échantillons deux fois avec 2x SSC pendant trois minutes par lavage. Ensuite, lavez les échantillons trois fois avec 2x SSC pendant 20 minutes par lavage à 60 degrés Celsius. Préparez ensuite l’anticorps primaire dans le tampon de blocage.Chargez 500 microlitres de ce mélange dans chaque puits. Après l’étape de blocage, incubez à température ambiante pendant environ quatre heures ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le troisième jour, exécutez la réaction de couleur dans un substrat chromogène.Couvrez la plaque d’échantillon avec du papier d’aluminium. Et pendant la réaction, vérifiez périodiquement la présence d’une coloration excessive avec le microscope de dissection. Le quatrième jour, il est important d’incuber et de blanchir sur une boîte à lumière, car cela permet d’éliminer toute pigmentation dans les échantillons ou coloration de la solution de Bouin, et améliore le signal de la sonde pour une visualisation claire.Ensuite, après le lavage avec SSC, transférez soigneusement les échantillons d’intestin en inversant le panier dans une nouvelle plaque à 24 puits. Pendant que vous êtes dans les puits, rincez abondamment les paniers avec de l’éthanol à 70 %. Procédez ensuite à l’imagerie des échantillons.Il est essentiel d’estimer la qualité des sondes d’ARN avant de les utiliser. Les sondes peuvent être vérifiées sur un gel de formaldéhyde. S’ils apparaissent sous forme de bandes brillantes et discrètes, ils sont de bonne qualité.Lors de la coloration, une certaine variation de distribution est normale entre les réplicats biologiques ainsi qu’entre les sept paires de diverticules des intestins individuels. Par conséquent, il est préférable de teindre au moins cinq entrailles par condition pour avoir une idée du modèle de coloration moyen. La meilleure façon de mesurer le succès global est de comparer la coloration des échantillons sensoriels et antisens pour chaque condition.Les deux doivent être développés pendant la même durée. Les échantillons sensoriels doivent avoir une couleur violette minimale ou nulle, tandis que les échantillons antisens doivent présenter une coloration robuste avec un arrière-plan minimal. Il est essentiel que les tissus soient entièrement émers dans la tache pour une exposition uniforme.Il est important d’éviter un développement excessif de la réaction de couleur. Cela peut entraîner une grande quantité de taches de fond, et les échantillons sensoriels peuvent commencer à ressembler à des échantillons antisens. Un autre facteur qui affecte les résultats est la quantité de tiques nourries à l’avance.Les tiques qui ne sont pas nourries ou qui ne sont nourries que pendant 24 heures sont difficiles à travailler. Leurs intestins sont plus facilement endommagés et ne se tachent pas bien. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours et demi à trois jours si elle est bien exécutée.Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder toutes les fournitures énumérées dans le tableau des réactifs et des matériaux prêtes avant de commencer votre expérience. Merci d’avoir regardé, et bonne chance dans vos expériences.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Des études de Lyme recherche sur les maladies nécessitent souvent de génération de tiques infectées par l'agent pathogène Borrelia burgdorferi, un processus qui prend généralement plusieurs semaines. Ici nous démontrons une procédure basée sur la microinjection tic infection qui peut être accompli en quelques heures. Nous démontrons également une méthode d'immunofluorescence pour la localisation in situ de B. burgdorferi dans les tiques.

Méthodes de transfert rapide et la localisation des agents pathogènes dans l&#39;intestin de Lyme Tick

Source : Ng, K. M., Tropini, C. Visualisation des interactions microbiote-hôte intestinal via l’hybridation fluorescente in situ , coloration des lectines et imagerie. J. Vis. Exp. (2021).Cette vidéo illustre la procédure d’hybridation in situ par fluorescence (FISH) pour colorer le microbiote intestinal dans le tissu intestinal de la souris en hybridant des sondes fluorescentes en ARNr bactérien (acide ribonucléique ribonucléique) et en contre-colorant les structures de l’hôte pour une analyse...

Hybridation in situ par fluorescence des bactéries intestinales dans les sections intestinales de la souris

La maladie de Lyme est la maladie à vecteur la plus couramment rapportés en Amérique du Nord. L'agent causal, Borrelia burgdorferi est une bactérie spirochète transmise par les tiques Ixodid. Transmission et détection de l'infection dans des modèles animaux est optimisé par l'utilisation de nourrissage des tiques, que nous décrivons ici.

Alimentation des tiques sur les animaux pour la transmission et Xénodiagnostic dans la recherche la maladie de Lyme

PCR nichée est une technique sensible, spécifique et simple qui peut être appliquée aux tiques QU'ADN extraits pour sonder pour Borrelia burgdorferi, l’agent causal de la maladie de Lyme. La première expérience PCR utilise des amorces de gène-spécifique pour générer des amplicons longs, qui deviennent alors des modèles pour une réaction à l’aide d’amorces internes.

Détecter le Spirochete de la maladie de Lyme, Borrelia Burgdorferi, chez les tiques à l’aide de la PCR nichée

Nous présentons ici un protocole de séquençage de nouvelle génération pour le séquençage d’ARNr 16 s qui permet l’identification et la caractérisation des communautés microbiennes dans les vecteurs. Cette méthode implique l’extraction ADN, l’amplification et codes à barres d’échantillons par PCR, séquençage sur une cellule d’écoulement et la bioinformatique pour faire correspondre les données sur les séquences d’information phylogénétique.

Tique Microbiome caractérisation par génération 16 s rRNA Amplicon séquençage

Ce protocole simplifié détaille un flux de travail pour détecter et imager les bactéries dans des échantillons de tissus complexes, de la fixation du tissu à la coloration des microbes avec hybridation fluorescente in situ .

Visualisation des interactions entre le microbiote intestinal et l’hôte par hybridation in situ par fluorescence, coloration par lectine et imagerie

Le présent protocole décrit l’isolement des microARN des glandes salivaires des tiques et des vésicules extracellulaires purifiées. Il s’agit d’une procédure universelle qui combine des réactifs et des fournitures couramment utilisés. La méthode permet également l’utilisation d’un petit nombre de tiques, ce qui donne des microARN de qualité qui peuvent être facilement séquencés.

Isolement de microARN à partir de cultures de glandes salivaires ex vivo et de vésicules extracellulaires

Nous décrivons ici une procédure qui permet de détecter les bactéries pathogènes à l’échelle de l’organe pendant l’infection et de quantifier les activités des rapporteurs fluorescents.

Tomographie tridimensionnelle à haute résolution des infections microbiennes

Nous proposons un protocole optimisé de microscopie électronique à balayage pour visualiser des échantillons hautement hétérogènes et délicats contenant de la biomasse végétale et fongique, ainsi que du microbiote et du biofilm. Ce protocole permet de décrire les dimensions spatiales de l’organisation du microbiote.

Microbiote des jardins de fourmis attines : visualisation d’un paysage microbien par microscopie électronique à balayage

Ici, nous présentons un protocole pour collecter de la salive, de l’hémolymphe, des glandes salivaires et de l’intestin moyen, après la dissection d’une tique nourrie individuellement, afin d’étudier la localisation tissulaire spécifique des agents pathogènes transmis par les tiques afin de faire progresser la compréhension de la compétence des vecteurs et des interactions pathogène-microbiome.

Extraction de la salive, de l’hémolymphe, des glandes salivaires et de l’intestin moyen de tiques individuelles (Acari : Ixodidae)

Découvrez une méthode d'hybridation in situ whole-mount pour visualiser le microbiote viable dans les intestins de tiques. Cette technique accessible permet une analyse spatiale et temporelle sans équipement coûteux.

Visualisation du microbiote dans Guts Tick par hybridation entier-Montez In Situ

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