FM colorant cyclisme au niveau de la Synapse : en comparant la dépolarisation élevés de Potassium, électrique et Stimulation de la Channelrhodopsin

L’objectif général de cette expérience est d’observer le cycle d’endocytose et d’exocytose des vésicules synaptiques sur la préparation vivante de la jonction neuromusculaire larvaire de la drosophile à l’aide de colorants FM fluorescents. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que quels gènes sont essentiels au fonctionnement du cycle des vésicules synaptiques ? Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez suivre optiquement le cycle des vésicules dans une préparation en direct à l’aide de trois types de stimuli différents, d’une dépolarisation élevée en potassium, d’une stimulation électrique ou en utilisant l’optogénétique.

Pour être cette procédure, ajoutez l’anticorps anti-HRP, conjugué à un lexoflor 647 à la solution saline de dissection. Ensuite, ajoutez une lamelle recouverte d’élastomère dans la chambre de dissection, puis ajoutez la solution de dissection avec l’anticorps HRP pour marquer la terminaison présynaptique NMJ pendant la dissection. À l’aide d’un pinceau fin, transférez un troisième stade errant du flacon alimentaire sur un verre de couverture recouvert d’élastomère.

Remplissez ensuite une pointe de micro-pipette en verre avec un petit volume de colle, en utilisant la pression d’air négative générée par la bouche. Par la suite, positionnez les larves, côté dorsal vers le haut, à l’aide d’une pince et collez la tête sur la lamelle recouverte d’élastomère avec une petite goutte de colle en utilisant une pression d’air positive par la bouche. Répétez cette procédure avec l’extrémité postérieure des larves, en vous assurant que l’animal est tendu entre les deux attaches de colle.

À l’aide de ciseaux, faites une coupe horizontale d’un millimètre à l’arrière et une coupe verticale le long de la ligne médiane dorsale. Ensuite, retirez doucement la trachée dorsale, l’intestin, le corps adipeux et d’autres organes internes, en recouvrant la musculature. Répétez la procédure de collage pour les quatre rabats de la paroi du corps, en veillant à étirer doucement le corps à l’horizontale et à la verticale.

Ensuite, soulevez le VNC et coupez soigneusement les nerfs moteurs avec les ciseaux et retirez complètement le VNC. Remplacez la solution saline de dissection par une solution saline sans calcium pour arrêter le cycle SV. Pour la stimulation électrique, préparez une pipette d’aspiration à l’aide de l’extracteur de microélectrodes pour obtenir le cône et la taille de pointe requis.

Ensuite, polissez au feu la pointe de la microélectrode avec une micro-forge pour créer un ajustement serré lors de l’aspiration d’un seul nerf moteur. Faites glisser la pipette d’aspiration sur le porte-électrode d’un micromanipulateur, qui est fixé à un long tube en plastique flexible et à une seringue. Ensuite, placez la préparation avec un colorant FM sur la platine du microscope et soulevez la platine jusqu’à ce que les larves et la pipette d’aspiration soient nettes.

Ensuite, aspirez une boucle de nerf moteur coupé, innervant le segment hémisphérique sélectionné avec une pression d’air négative, générée par la seringue dans l’électrode d’aspiration. Par la suite, stimulez le nerf moteur à l’aide des paramètres sélectionnés pour stimuler l’endocytose SV et l’absorption du colorant FM 143. L’étape la plus critique à ce stade de la procédure consiste à aspirer un seul axone moteur dans l’électrode d’aspiration avec un ajustement serré.

Cela peut prendre quelques essais et erreurs. Une fois qu’une électrode d’aspiration adéquate est trouvée, utilisez la même pour toutes les conditions comparées afin d’assurer une tension de stimulation constante. Pour le déchargement du colorant FM, aspirez le même nerf moteur dans la même électrode, puis stimulez le nerf moteur pour activer l’exocytose SV et la libération du colorant FM 143.

Pour la stimulation par channelrhodopsin, fixez une LED bleue à un stimulateur programmable à l’aide d’un câble coaxial et placez la LED dans le port de la caméra. Concentrez le faisceau lumineux LED bleu sur la préparation avec un colorant FM à l’aide de la fonction de zoom du microscope. L’étape la plus critique à ce stade de la procédure est de s’assurer que les paramètres de la LED sont maintenus constants et que vous éclairez la même partie de chaque animal pour toutes les conditions comparées afin d’assurer une tension de stimulation constante.

Démarrez la stimulation lumineuse et suivez avec la minuterie pendant la durée prédéterminée de la période de stimulation optogénétique. Lorsque la minuterie s’arrête, retirez rapidement la solution de colorant FM et remplacez-la par une solution saline sans calcium pour arrêter le cycle SV. Pour le déchargement du colorant FM, démarrez la stimulation lumineuse et suivez avec une minuterie pendant la durée prédéterminée de la période de stimulation optogénétique.

À la fin de la période de minuterie, retirez rapidement la solution de colorant FM et placez-la avec une solution saline sans calcium pour arrêter le cycle SV. Pour quantifier l’image fluorescente, chargez-la dans l’image J et créez une projection d’intensité maximale en cliquant sur Image, Piles, Zprojet, puis à l’aide du canal anti-HRP 647, accédez à Image, Ajuster, Seuil et faites glisser la barre d’outils supérieure jusqu’à ce que seul le NMJ soit mis en surbrillance. À l’aide de l’outil baguette, cliquez sur le NMJ.

Si le NMJ est discontinu, maintenez le bouton Maj enfoncé et sélectionnez toutes les pièces. Changez ensuite l’image pour le canal de colorant FM 143 et allez dans Analyser, Mesurer, pour obtenir la mesure de fluorescence. Répétez ces étapes pour l’image déchargée à partir du même NMJ.

Le FM 143 fluorescent peut être photoconverti en un précipité dense d’électrons DAB oxydés pour la visualisation via TEM. Voici un schéma de la méthode de photoconversion pour marquer la NMJ de la drosophile suite à une charge de colorant FM 143 dépendante de l’activité. Il s’agit d’une image TEM représentative d’un bouton synaptique de type sauvage au repos, qui montre une population dense de SV de taille uniforme.

Ces images montrent les boutons synaptiques qui ont été stimulés avec une dépolarisation saline de potassium élevée pendant cinq minutes sans photoconversion ou avec photoconversion FM 143. Les structures homo en vrac peuvent être observées ici. Et ces images montrent les boutons synaptiques qui ont été stimulés électriquement avec l’électrode d’aspiration nerveuse à 20 hertz pendant cinq minutes sans photoconversion ou avec photoconversion FM 143.

Notez que les vésicules chargées de colorant apparaissent beaucoup plus foncées que les vésicules adjacentes non chargées. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une dissection de colle larvaire ainsi que le chargement et le déchargement du colorant FM à l’aide d’une dépolarisation à haute teneur en potassium, d’une stimulation électrique et d’une stimulation optogénétique de la rhodopsine. Depuis que les colorants FM ont été synthétisés pour la première fois par Fei-Mao, ces colorants polyvalents ont été utilisés pour étudier la mobilisation dépendante de l’activité de pools de vésicules distincts afin d’étudier la différence entre l’endocytose médiée par la clathrine, ainsi que pour étudier les activités synaptiques évoquées, spontanées et miniatures.

Il y a de nombreux facteurs à prendre en compte tout au long de cette expérience. Pour n’en nommer que quelques-uns, la concentration externe de calcium, le type de méthode de stimulation que vous utilisez, ainsi que la durée de chargement et de déchargement du colorant FM pendant les étapes d’absorption et de libération. Veuillez prendre ces facteurs en compte lorsque vous planifiez votre propre expérience.

Bonne chance!