Unicellulaire quantification des ARNm et Expression de protéines de Surface CD4 infectées par le Virus d’immunodéficience simien⁺ T les cellules isolées de macaques rhésus

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions hôte-pathogène telles que quelles sont les caractéristiques uniques des cellules infectées de façon productive, ce que les cofacteurs hôtes permettent aux virus d’établir une infection productive, et comment cibler ces cellules dans des interventions thérapeutiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des mesures quantitatives pour les protéines et l’ARNm dans les cellules individuelles, et la plupart des réaccents sont disponibles dans le commerce. Matthew Creegan, technicien principal du noyau de cytométrie d’écoulement du laboratoire du Docteur Michael Eller, démontrera la procédure de tri cellulaire.

Pour commencer, dans un poste de travail désigné de biologie moléculaire pré-PCR, préparez le mélange d’analyse en combinant 96 essais d’expression génétique dans un tube libre RNase, DNase, en vous assurant d’ajouter chaque essai à une concentration finale de 180 nanomolaires d’amorce avant et arrière. Ajoutez un tampon de suspension d’ADN pour obtenir la dilution appropriée du mélange d’analyse. Pour chaque tableau de copeaux prévu de 96 par 96, pipette six microlitres de chaque essai dans un puits désigné d’une plaque PCR de puits 96, puis sceller la plaque avec un adhésif.

Pour commencer à colorer la surface des cellules viables, dans une armoire de biosécurité de culture tissulaire, préparez d’abord les échantillons de compensation et un mélange principal de cocktail fluorescent d’anticorps tel que décrit dans le protocole de texte. Décongeler les cellules cryopréservées dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant deux minutes. Après cela, ajouter entre 5 et deux millilitres de la suspension cellulaire à un tube de 15 millilitres contenant 12 millilitres de PBS.

Centrifugeuse à 500 G pendant trois minutes à 25 degrés Celsius, puis aspirer le PBS et resuspendre la pastille en trois millilitres de PBS frais. Transférer ce mélange dans un tube de polystyrène de cinq millilitres. Centrifugeuse une fois de plus à 500 G pendant trois minutes à 25 degrés Celsius.

Aspirer le supernatant, laissant environ 10 microlitres résiduels PBS. Ensuite, resuspendez jusqu’à 20 millions de cellules lavées dans 80 microlitres de cocktail d’anticorps. Incuber pendant 20 minutes à 25 degrés Celsius tout en étant protégé de la lumière.

Après cela, ajouter trois millilitres de PBS. Centrifugeuse à 500 G pendant trois minutes et aspirer le surnatant. Resuspendez soigneusement les cellules en 300 à 500 microlitres de PBS.

Filtrez cette solution en la pipetant à travers un bouchon de 35 micromètres en nylon de la passoire cellulaire. puis garder les cellules sur la glace et à l’abri de la lumière jusqu’à ce que le genre. De retour au poste de travail pré-PCR, préparez d’abord le mélange de réaction préAMP RT dans un seul tube stérile gratuit RNase, DNase tel que décrit dans le protocole de texte.

À l’aide d’une pipette multicanal, distribuez 10 microlitres de ce mélange de réaction dans le nombre désiré de 96 plaques de collecte de tri PCR bien. Sceller la plaque avec du film adhésif, puis placer la plaque sur un bloc d’aluminium pré-refroidi 96 puits. Après cela, établir le schéma de gating de tri cellulaire et préparer le trieur de cellules cytométriques d’écoulement tel que décrit dans le protocole de texte.

Entrez les paramètres appropriés de l’instrument pour spécifier le nombre et le sous-ensemble de cellules à trier dans chaque puits. Retirez le joint adhésif, puis facs trier les cellules dans les 96 plaques de collecte pcr bien préparé. Reseal l’assiette avec un film adhésif frais.

Vortex immédiat de la plaque resealed, puis centrifugeuse à 2000 G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Thermocycle la plaque dans une machine PCR avec un couvercle préchauffé à 50 degrés Celsius pendant 15 minutes suivie de 95 degrés Celsius pendant deux minutes. Enfin, thermocycle pour 18 cycles de 95 degrés Celsius pendant 15 secondes et 60 degrés Celsius pendant quatre minutes, puis dans un poste de travail post-PCR, transférer cinq microlitres de cDNA en 20 microlitres de tampon de suspension d’ADN dans une nouvelle plaque PCR 96 puits.

Pour commencer, préparez la plaque d’analyse qPCR en pipetant quatre microlitres de réaccente de chargement par essai dans chaque puits. Ensuite, transférez quatre microlitres de chaque analyse de la plaque d’analyse 2X à la plaque qPCR. Maintenir la plaque d’analyse qPCR à quatre degrés Celsius.

Distribuez les fluides de la ligne de commande des seringues d’amorçage dans les deux vannes d’admission de la puce. Retirer le plastique protecteur sous la plaque. Placez la puce sur un contrôleur IFC avec le côté cranté à la position A1, puis sélectionnez et exécutez le script principal.

Pour chaque puce microfluidique, mélanger 50 microlitres du réaccent de chargement de l’échantillon avec 500 microlitres de mélange principal PCR pour préparer le mélange de réaction en temps réel. Pipette 4,4 microlitres de cette réaction se mélangent dans chaque puits d’une nouvelle plaque PCR de puits 96 maintenant désignée comme plaque d’échantillon. Ensuite, pipette 3,6 microlitres de l’ADNC précédemment dilué dans chaque puits de la plaque d’échantillon.

Après cela, transférer cinq microlitres de la plaque d’essai au puits correspondant sur le côté cranté de la puce. Transférer cinq microlitres de la plaque d’échantillon dans le puits correspondant de l’autre côté de la puce. Insérez la puce chargée dans le contrôleur IFC et exécutez le script de mélange de charge.

Ensuite, transférez la puce sur la plate-forme BioMark et configurez l’instrument tel qu’il est décrit dans le protocole de texte, puis enregistrez le fichier d’exécuter la puce dans un dossier désigné. Lorsque l’exécuter de la puce est terminé, ouvrez le logiciel d’analyse PCR en temps réel, puis sélectionnez le fichier, ouvrez, pour ouvrir le chiprun. fichier bml.

Dans le coin supérieur gauche de la fenêtre logicielle, localiser l’explorateur de puces et le résumé de l’exécution des puces. Dans le résumé de l’exécution des puces, cliquez sur la configuration du détecteur. Dans le cadre de la tâche, cliquez neuf et sélectionnez le type de conteneur SBS plaque et format conteneur SBS 96.

Cliquez sur le bouton avec l’ellipsis à côté de la cartographie, puis sélectionnez M96-Assay-SBS96.dsp. Cliquez sur les vues d’analyse. Dans l’onglet qPCR en cours de tâche, sélectionnez la correction de base pour la méthode linéaire dérivée et le seuil CT pour les détecteurs d’utilisateurs.

Dans l’onglet Seuils CT, cochez l’initialisation avec la case automatique, puis cliquez sur le bouton analyse. Dans le quadrant supérieur droit des vues d’analyse, cliquez sur le deuxième onglet, tableau des résultats. À partir du menu dropdown, sélectionnez la vue carte thermique et la carte thermique avec les données s’affiche.

Sous la carte thermique, cliquez sur le seuil et le graphique du journal. Ajustez manuellement les seuils de CT pour chaque détecteur en cliquant sur les analyses, représentées par des colonnes sur la carte thermique, et en faisant glisser le seuil au besoin pour croiser les courbes d’amplification dans la phase exponentielle. Une fois terminé, cliquez sur analyser.

Ensuite, exportez les données qPCR sous forme de fichier csv. Transférez les données qPCR de l’ordinateur BioMark à votre bureau. Importez les données dans une feuille de calcul ou un logiciel d’analyse statistique et cartographiez les résultats par exemple et par positions d’analyse sur la puce.

Créez une nouvelle colonne et utilisez une formule conditionnelle pour organiser les cellules en groupes basés sur l’expression de gènes viraux. Sous analyse, sélectionnez l’ajustement Y par X et tracez l’expression des gènes par rapport au groupe. Après cela, utilisez la version 9 de FlowJo pour ouvrir les fichiers FCS du tri FACS correspondant à une plaque de puits 96.

Avec le nom du fichier mis en surbrillance, sélectionnez la plate-forme, la porte de numéro d’événement et créez des portes de tri indexées. Les cellules individuelles apparaîtront affichées par rangée. Mettez en surbrillance les 96 cellules, puis sélectionnez l’espace de travail, exportez, sélectionnez tous les planchers rémunérés.

Sous données, sélectionnez le fichier FCS, cliquez sur l’exportation et sélectionnez un dossier désigné. Faites glisser les nouveaux fichiers FCS pour les cellules individuelles dans un nouvel espace de travail FlowJo. Mettez en surbrillance toutes les cellules et cliquez sur ajouter des statistiques, représentées par le bouton sigma, moyen, et tous les paramètres de fluorescence.

Ouvrez l’éditeur de table, puis mettez en évidence tous les étages de la première cellule et faites-les glisser dans la fenêtre de l’éditeur de table. Dans cette fenêtre, cliquez sur créer et afficher la table. Après cela, copiez et extrayez dans un logiciel statistique soit en copy-pasting ou en cliquant sur le bouton enregistrer et lancer l’application.

Fusionnez les données FACS d’une seule cellule avec les données qPCR dans JMP par le numéro de plaque et la position du puits. Enfin, effectuer des analyses graphiques et statistiques sur les données combinées. Dans cette étude, la quantitation de protéine de surface d’une cellule unique par cytométrie de flux multi-paramètres est intégrée à l’expression quantitative d’ARNm unicellieux par RTqPCR fortement multiplexé.

Il est indiqué ici l’expression quantitative des gènes viraux à cellules individuelles à partir des lymphocytes T positifs RHESUS macaque CD4 triés par FACS. Tat/rev positif N des cellules négatives expriment moins de copies d’ARN tat/rev que le N des cellules positives en vert foncé qui est compatible avec un stade précoce de l’infection avant la stabilisation et une exportation nucléaire de l’ARN viral partiellement épissé. Une abondance élevée de Gag-ARN non épissé dans tat/rev positif N des cellules positives est compatible avec l’infection productive de stade avancé au cours de laquelle l’ARN génomique abondant est exprimé et emballé dans les virions naissantes.

Cette parcelle trivariée affichant le gène viral unicellulaire, le gène hôte et l’expression des protéines de surface de l’hôte montre que l’expression des protéines CD4 et CD3 de surface est diminuée en cellules positives tat/rev montrées en vert même si les transcriptions de CD4 et de CD3 sont maintenues. Une fois maîtrisée, cette technique peut se faire en deux à trois jours. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’évaluation prototranscriptionnelle ciblée d’une seule cellule pour répondre aux questions relatives aux gènes et protéines exprimés différemment dans les cellules infectées viralement.