Définition d’activité réglementée Redox chaperon de Hsp33 et de cartographie des changements conformationnels sur Hsp33 à l’aide de la spectrométrie de masse d’hydrogène deutérium Exchange

Le flux de travail présenté ici peut nous aider à approfondir notre compréhension du rôle cellulaire des chaperons dans des conditions de stress oxydatif. Plus précisément, cela peut aider à comprendre comment les chaperons empêchent l’agrégation des protéines dans des conditions de déploiement. Car ces deux dos de techniques différentes donnent un aperçu de l’activité des chaperons séparés par drapeau.

Il peut également être utilisé pour étudier d’autres protéines pour l’interaction, telles que les interactions sociales enzymatiques et la dynamique des protéines. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car elle implique l’utilisation de différents instruments, ce qui peut être difficile pour les nouveaux utilisateurs. Tout d’abord, faites tourner un échantillon de protéines préalablement décongelé pour en retirer les agrégats.

Ajoutez ensuite cinq millimolaires de DTT et 20 micromolaires de chlorure de zinc et incubez l’échantillon pendant au moins 1,5 heure à 37 degrés Celsius. Pour éliminer le DTT, équilibrez une colonne de dessalage avec un tampon de phosphate de potassium d’au moins 40 millimolaires en remplissant complètement la colonne avec le tampon et en la laissant s’égoutter. À l’aide d’une pince à épiler, appuyez doucement sur le filtre à disque blanc dans la colonne et retirez-le.

Remplissez la colonne avec un tampon de phosphate de potassium et centrifugez-la à 1000 fois G pendant trois minutes. Après la centrifugation, transférez la colonne dans un tube propre et ajoutez lentement l’échantillon de protéines au milieu de la colonne. Centrifugez la colonne à 1000 fois G pendant deux minutes afin que la protéine sans DTT soit dans le flux.

Vérifiez maintenant la concentration en protéines et mesurez son absorbance à 280 nanomètres. Répartissez la moitié des échantillons de protéines dans des aliquotes. Incuber les aliquotes dans des conditions anaérobies pendant 20 minutes pour une élimination complète de l’oxygène.

Ensuite, scellez les tubes avec un film plastique et stockez les échantillons dans des conditions froides. Ensuite, ajoutez du peroxyde d’hydrogène de cinq millimolaires fraîchement préparé à l’échantillon de protéines restant et incubez pendant trois heures à 40 degrés Celsius en secouant. Après la centrifugation, vérifiez la concentration en protéines, puis divisez les protéines oxydées en aliquotes et stockez-les dans des conditions froides.

Préparez le substrat dénaturé en incubant 12 micromolaires de citrate synthase pendant la nuit dans 40 millimolaires de HEPES et 4,5 molaires de chlorure de guanidinium. Le lendemain, ouvrez le logiciel du fluorospectromètre et passez à la mesure de la trajectoire temporelle. Réglez la bande passante d’excitation sur 2,5 nanomètres.

La longueur d’onde d’excitation à 360 nanomètres. La longueur d’onde d’émission à 360 nanomètres. La bande passante d’émission à cinq nanomètres.

Et l’intervalle de données à 0,5 seconde. Réglez la température à 25 degrés Celsius. Préparez l’échantillon en ajoutant 1600 microlitres de HEPES de 40 millimolaires dans une cuvette en quartz.

Insérez la cuvette dans le porte-échantillon d’un fluorospectromètre pour permettre à l’échantillon d’atteindre la température souhaitée. Après avoir réglé l’agitation à 600 tr/min, commencez la mesure jusqu’à ce que la ligne de base soit établie. Pour mesurer l’agrégation de la citrate synthase en l’absence d’un chaperon, ajoutez 10 microlitres de citrate synthase dénaturée, 120 secondes après le début de la mesure.

Continuez ensuite la mesure pendant 1200 secondes. Pour mesurer l’agrégation de la citrate synthase en présence de Hsp33, ajoutez Hsp33 60 secondes dans la mesure. Après 60 secondes supplémentaires, ajoutez 10 microlitres de citrate synthétase dénaturée et continuez la mesure pendant 1200 secondes.

Ensuite, téléchargez le fichier de données pour effectuer l’analyse des données et la suppression du bruit par Kfits. Pour supprimer tout bruit, choisissez les paramètres d’analyse, utilisez le meilleur modèle automatique et sélectionnez le bruit est toujours au-dessus du signal. Supprimez manuellement les valeurs aberrantes évidentes à l’aide des lignes réglables vertes et rouges qui filtreront les bruits au-dessus de la ligne verte et en dessous de la ligne rouge.

Ensuite, définissez la ligne de base et la courbe d’ajustement. Après avoir appliqué le seuil de bruit, téléchargez les données traitées. Préparez des échantillons complexes de substrat protéique en ajoutant de la citrate synthétase à Hsp33 dans un rapport de 1 à 1,5 à 43 degrés Celsius.

Utilisez au moins quatre étapes et incubez les échantillons pendant 15 minutes à 43 degrés Celsius après chaque ajout pour permettre la formation complexe. Centrifugez les échantillons à 16000 fois G à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes pour éliminer tous les agrégats. Placez ensuite les échantillons dans des inserts en verre de 150 microlitres et transférez-les dans des flacons.

Ensuite, placez-les dans les plateaux appropriés. Maintenez les tampons H et D à 25 degrés Celsius et maintenez les échantillons et le tampon de trempe entre zéro et deux degrés Celsius. Ensuite, allumez manuellement toutes les unités de refroidissement du spectromètre de masse.

Une fois que tous les systèmes de refroidissement ont atteint leur température cible, allumez manuellement la HPLC et les pompes de chargement. Ouvrez le logiciel qui contrôle les deux pompes ainsi que le logiciel qui contrôle le spectromètre de masse et assurez-vous que le MS est en veille. Ensuite, débranchez la vanne de sortie HPLC de la source MS.

Lavez d’abord le système avec une solution de nettoyage triple. Puis avec le tampon B et enfin avec le tampon A.Insérez ensuite la colonne de pepsine dans le système. Après avoir lavé le système avec un débit et une pression constants, insérez la vanne de sortie HPLC dans la source MS et allumez le MS.

Ouvrez maintenant le logiciel. Créez une séquence en cours et entrez tous les points temporels, les noms des échantillons et les emplacements dans les bacs, ainsi que les noms et les emplacements des tampons. Une fois l’analyse terminée, analysez la couverture peptidique de l’échantillon en analysant les échantillons de contrôle non deutérés dans le logiciel.

Transférez les données dans le logiciel HDX Workbench et analysez les résultats à l’aide du logiciel. Enregistrez les peptides sélectionnés et continuez pour l’analyse de l’absorption de deutérium. La dénaturation chimique conduit à une agrégation rapide de la citrate synthétase induite par le repliement d’une protéine entièrement dénaturée dans des conditions tampons défavorables.

D’autre part, l’agrégation induite thermiquement résulte d’un dépliage relativement lent du substrat plié nativement. Dans les deux formes de dénaturation, l’ajout de Hsp33 oxydé a complètement aboli l’agrégation, abaissant les lectures de 360 nanomètres à des valeurs négligeables. La présence d’une réduction de Hsp33 n’a pas eu d’effet sur la stabilité de la citrate synthétase et a donné une courbe d’agrégation similaire à celle détectée en l’absence de chaperon.

Le modèle de deutération entre le chaperon lié et non lié Hsp33 à son substrat citrate synthétase révèle un site d’interaction client dans le domaine du commutateur redox C-terminal du chaperon. Le Hsp33 réduit a une structure complètement ordonnée mais devient fonctionnel lorsqu’il détecte un stress oxydatif. Alors que le Hsp33 lié et non lié produit des courbes peptidiques similaires, le Hsp33 oxydé présente une différence de deuération de 30 % entre le chaperon lié et non lié, avec des zones spécifiques de la protéine liée indiquant un obstacle allostérique.

Une fois établi, le test de diffusion peut être terminé en quelques heures, tandis que la méthodologie DHEX peut être terminée en deux à quatre jours si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de planifier à l’avance. N’oubliez pas que les conditions décrites, telles que la température, les temps d’incubation et les solutions tampons, sont spécifiques aux protéines et doivent être optimisées pour chaque protéine.

Suite à cette procédure, d’autres méthodologies telles que la réticulation ou la précipitation peuvent être effectuées afin de compléter les études des interactions entre les substrats des chaperons. En conclusion, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie structurale pour explorer la plasticité des protéines chez les chaperons moléculaires.