À Situ Microscopie pour la détermination en temps réel de la morphologie monocellulaire dans les bioprocessus

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de l’hétérogénéité de la population par l’évaluation morphologique des cellules. La microscopie in situ permet d’étudier les conditions de culture, les rendements des procédés et la qualité du produit. Le principal avantage de cette technique est une mesure in situ, qui fournit des données en temps réel sans échantillonnage ni risque de contamination.

La microscopie in situ couplée à la reconnaissance automatisée de l’image peut fournir des informations supplémentaires sur les structures cellulaires, la forme et l’agglomération cellulaire au-delà de la taille. Il est également possible de mesurer les concentrations cellulaires. La méthode s’est avérée être un outil fiable.

Aucune autre méthode ne fournit la même information en si peu de temps et un faible effort pour la préparation de l’échantillon. La méthode a été adaptée à divers bioprocédés et micro-organismes, champignons filamenteux SEG, micro-allergies et levures. La sonde est utilisée conjointement avec un ordinateur.

Le matériel se compose d’une sonde à tige unique avec une caméra CCD haute résolution. Les cellules qui passent à travers un espace de mesure réglable sont photographiées par la caméra. La lumière entre dans l’espace en face de la caméra, ce qui signifie que l’éclairage se fait par transmission.

Définissez les paramètres matériels à l’aide de concentrations cellulaires qui couvrent la plage prévue. Commencez à préparer des mesures hors ligne. Utilisez une jauge d’épaisseur pour ajuster l’écart de mesure.

Tournez ensuite l’écrou de vis de sonde pour régler l’écart de mesure à cinq ou dix fois le diamètre maximum prévu de cellules. À l’ordinateur, ouvrez le logiciel du contrôleur de sonde. Dans le logiciel, sélectionnez la sonde désirée et passez aux actions de section.

Appuyez ensuite sur Connect. Ensuite, allez à l’onglet Contrôle de sonde et ouvrez-le. Démarrez la diffusion vidéo en appuyant sur le bouton lecture.

Fixez la sonde sur un trépied et effectuez les étapes suivantes pour chaque mesure. Travaillez avec la sonde et pulvérisez de l’éthanol dans l’écart de mesure. Essuyez soigneusement toute poussière ou saleté avec du papier optique.

À l’ordinateur, utilisez la vue en direct pour vérifier que le verre du capteur est exempt de particules. Ensuite, placez un papier optique sec dans l’espace de mesure pour se concentrer. Tournez la vis de liaison pour déplacer la mise au point manuellement.

Arrêtez de vous concentrer lorsque des fibres simples du papier dans l’écart de mesure sont clairement visibles. Maintenant, prends un tube rempli de bouillon de culture. Tremper le microscope dans le bouillon, de sorte que l’espace est entièrement recouvert de suspension cellulaire.

Utilisez les vis de liaison pour affiner l’accent mis sur les cellules. Une fois cette mise au point terminée, ne la modifiez plus pendant l’expérience. Retour au logiciel pour l’expérience.

Allez au menu Déclenchant. Sous le menu Déclenchement, réglez la fréquence d’image. Un hertz est recommandé pour les mesures hors ligne.

De là, allez sur le champ Frames Per Trigger et définissez-le comme nécessaire pour de bonnes statistiques. Ici, environ 200. Aussi, allez au menu général.

Là, sélectionnez l’annuaire dans lequel les images seront enregistrées. Commencez l’acquisition d’images avec le bouton Start Image Trigger Acquisition. Déplacez doucement le tube pour induire le flux dans l’écart de mesure.

Utilisez les images de la première série de l’expérience comme un ensemble de formation. Préparez le logiciel open source Fidji et laissez tomber les images de l’expérience dans sa fenêtre. Une fois terminé, sélectionnez Analyser, suivi d’outils, puis roi manager.

Ensuite, choisissez un outil de sélection. Dans l’image, décider d’une particule à annoter qui est au point. Dessinez un cercle autour d’elle avec l’outil de sélection.

Appuyez sur Ajouter pour ajouter l’annotation au gestionnaire de retour sur investissement. Ensuite, sélectionnez un outil de pinceau et choisissez une taille de pixel appropriée. Utilisez l’outil brosse pour affiner la sélection.

Continuez à marquer tous les objets d’intérêt de la même manière sur environ 15 images. Enregistrez les fichiers annotés et utilisez-les comme un ensemble de formation. Lorsque l’algorithme de reconnaissance est formé et prêt, utilisez-le pour visualiser les résultats.

Dans l’analyseur de résultats, passez au fichier, suivi du fichier d’importation. Sélectionnez le fichier de résultats souhaité. Continuez en appuyant sur le bouton Créer un graphique.

Sélectionnez Graphique de distribution. Cela montrera la distribution morphologique de la culture. Retournez à créer un graphique pour sélectionner l’intrigue de sensibilité.

Les informations affichées peuvent aider à déterminer combien de cellules doivent être analysées pour obtenir l’exactitude désirée. Effectuez des mesures en ligne après avoir effectué des mesures hors ligne. Pour les mesures en ligne, connectez la sonde directement à un bioréacteur.

Une fois connecté, stériliser correctement l’assemblage. Sélectionnez Surveillance dans le tableau de bord. Il y a un bouton de lecture pour démarrer l’acquisition d’image et un bouton d’arrêt pour y mettre fin.

Appuyez sur le bouton de jeu. Chez le bioréacteur, commencer l’inoculation de la culture. La caméra capturera la vidéo des cellules et les identifiera automatiquement pour analyse.

La surveillance fournit des données en ligne sur la taille des cellules et les formes des différentes morphologies cellulaires pendant toute la fermentation. Les résultats en temps réel peuvent être formatés de différentes manières et également exportés pour une analyse plus approfondie. Cette parcelle de distributions cumulatives du diamètre des cellules S.Cerevisiae est créée à partir de données analysées à l’aide de cette technique.

Il démontre que la reconnaissance cellulaire automatique est capable de distinguer les cellules en herbe et non bourgeonnantes. La courbe solide est la distribution pendant une culture à trois heures. La courbe pointillée est la distribution de la même culture à sept heures.

La courbe pointillée représente les données recueillies à 13 heures. La procédure d’annotation prend beaucoup de temps, mais elle est la clé pour atteindre l’exactitude souhaitée pour l’identification cellulaire. Avec cette procédure, si les temps de mesure sont plus courts que la dynamique du processus, la mesure en temps réel peut être utilisée pour le contrôle des processus.

Cette technique ouvre la voie à l’utilisation de la mesure de l’hétérogénéité de la population comme paramètre de processus pour les cultures microbiennes, des premières étapes de développement des procédés à l’échelle de production.