Méthode fondée sur un embout de la Pipette pour semis de cellules aux plateformes microfluidiques Droplet

L’intégration de cette méthodologie à la microfluidique à base de gouttelettes aide à répondre aux questions clés liées au domaine de l’immunologie des systèmes pour coder l’hétérogénéité cellulaire et la communication entre les cellules individuelles ou les agents pathogènes. Le principal avantage de cette technique que nous avons développée est que cette procédure de chargement des pointes permet l’encapsulation de cellules rares dans des gouttelettes correspondant étroitement à la distribution prévue pour cent. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour comprendre comment utiliser des pointes de pipette pour charger les cellules aux gouttelettes sexospécifiques et pour récupérer les cellules des gouttelettes.

Pour la charge de pointe pour la production de gouttelettes aqueuse, ajoutez d’abord trois millilitres de surfactant à deux millilitres d’huile farinée et dessinez le mélange de phase d’huile dans une seringue de 2,5 millilitres. Retirez les bulles d’air de la seringue et connectez la seringue à un morceau de tube de téflon d’une longueur appropriée. Chargez deux seringues d’échantillon avec une huile minérale bicompatible appropriée et connectez la seringue à un deuxième morceau de tube de téflon d’une longueur appropriée.

Ensuite, perforez un bouchon polydimethylsiloxane ou PDMS de cinq millimètres de diamètre à partir d’une dalle EDMS durcie, et perforez un trou d’un millimètre à travers le centre de la prise. Insérez fermement la fiche dans l’extrémité supérieure d’une pointe de pipette de 200 microlitres et insérez le tube attaché à la seringue à huile minérale bicompatible dans la fiche. Déprimez lentement le piston de seringue pour remplir la pointe de pipette avec de l’huile minérale poussant tout l’air résiduel.

Déposer délicatement les seringues d’échantillon et la seringue à huile farinée sur une pompe à seringues. Lorsque tout l’air a été enlevé, abaissez chaque pointe de pipette dans la solution de l’échantillon et aspirez environ 100 microlitres d’échantillon cellulaire dans les extrémités. Ensuite, insérez les deux pointes de pipette contenant de l’échantillon dans les deux entrées intérieures de la puce PDMS et insérez le tube contenant le mélange de phase d’huile dans l’entrée extérieure.

Réglez les débits de la pompe à seringues comme indiqué et entrez et définissez les dimensions de chaque seringue. Démarrez la pompe pour rincer la solution de l’échantillon à travers les canaux intérieurs de l’appareil, et la phase d’huile à travers le canal extérieur de l’appareil. Puis branchez un morceau de tube d’une longueur appropriée dans la prise pour commencer à recueillir les gouttelettes lorsque la formation de gouttelettes est stable, la collecte des gouttelettes dans un tube de verrouillage.

Lorsque toutes les gouttelettes ont été recueillies, ajouter 200 microlitres de milieu RPMI, sans sérum, sur les gouttelettes et incuber l’échantillon avec le trou sur le couvercle du tube de verrouillage pour la période expérimentale appropriée. Pour la rupture de l’émulsion, ajoutez d’abord deux millilitres de PFO à huit millilitres d’huile bafouée et utilisez une seringue pour enlever l’excès d’huile du fond du tube de collecte des gouttelettes. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution 20% PFO à l’émulsion pour libérer les cellules encapsulées dans la phase aqueuse, et appuyez brièvement sur le tube pour mélanger.

N’oubliez pas que le PFO peut être nocif pour les cellules. Par conséquent, gardez le contact avec PFO au minimum. Après une à deux minutes, faites tourner la solution à la force centrifuge relative la plus basse possible pendant 30 secondes et transférez immédiatement 550 microlitres de la fraction aqueuse dans un nouveau tube verrouillé contenant 500 microlitres de PBS froid, complété par 2% de sérum fœtal de veau, ou FCS.

Laissez couler toute huile résiduelle au fond du nouveau tube de verrouillage et transférez soigneusement 950 microlitres de la cellule contenant une phase aqueuse vers un nouveau tube de verrouillage. Assurez-vous que l’huile n’est pas transférée avec la phase aqueuse dans le nouveau tube de verrouillage. Puis recueillir les cellules par centrifugation et de suspendre à nouveau la pastille dans 300 microlitres de PBS froid frais complété par 2%FCS.

En utilisant l’approche de chargement des pointes comme nous venons de le démontrer, les taux d’encapsulation des cellules T de Jurkat coïncident avec les valeurs statistiquement prédites peuvent être obtenus. Remarquablement, même avec les cellules adhérentes comme les cellules tumorales, qui ont tendance à s’agglutiner, ou les cellules rares telles que les cellules dendritiques plasmacytoïdes, une efficacité améliorée d’encapsulation est observée. Au cours de cette encapsulation représentative, les gouttelettes se sont régénérées à l’aide d’une température de gelling ultra-basse agarose et gélifié après la production pour former des perles d’hydrogel agarose qui ont permis une analyse ultérieure en aval par microscopie et cytométrie de débit.

L’analyse microscopique a indiqué que l’appariement cellulaire a été réalisé à différentes combinaisons indicatifs d’appariement et d’analyse de cellules à haut débit de la même population de perles d’hydrogel par cytométrie de flux, a indiqué que les perles sans cellules pourraient être séparées des perles avec des cellules basées sur leurs modèles distincts de dispersion vers l’avant et vers le côté. En effet, le fait de s’insurgér sur la population de perles sans cellules a confirmé un manque d’encapsulation cellulaire par l’absence de signaux fluorescents alors que le gating sur la population de perles avec des cellules a révélé l’existence de multiples sous-populations indicatives de l’encapsulation de cellules T Jurkat différemment étiquetées. Tout en travaillant avec cette méthode, il est important de se rappeler que la concentration cellulaire est un facteur limitant, et doit être optimisé pour assurer l’encapsulation cellulaire efficace et l’appariement cellulaire.

Après cette procédure, non seulement une ou deux cellules peuvent être encapsulées dans des gouttelettes à haut rendement, mais plusieurs cellules, ou types de cellules, peuvent être encapsulées pour une réplication plus précise du micro-environnement cellulaire. Cette technique ouvrira la voie à des chercheurs dans les domaines de l’immunologie et des disciplines connexes pour une utilisation optimale des populations de cellules cicatriciels et leur encapsulation efficace dans les gouttelettes, afin d’étudier le comportement cellulaire dans un environnement sans bruit.