In Situ Mesure et la corrélation entre la densité cellulaire et la luminescence de bactéries bioluminescentes
28 juin 2018
Bactéries bioluminescentes réglementent la production légère au moyen de divers mécanismes, tels que quorum sensing. Cette nouvelle méthode permet l’enquête in situ de la bioluminescence et la corrélation de l’émission de lumière densité cellulaire. Un artificiel bioluminescentes Escherichia coli système permet la caractérisation des opérons lux , Lux protéines et leur interaction.
Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la bioluminescence. Par exemple, trouver des conditions de croissance optimales pour une intensité lumineuse maximale des bactéries bioluminescentes et déterminer le mécanisme de régulation. Le principal avantage de cette technique est la facilité d’installation, qui peut être utilisée pour diverses souches et organismes, ainsi que les possibilités de réglage simples et rapides.
Suivre cette méthode peut donner un aperçu des caractéristiques de l’opéron lux. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes, tels que les systèmes bactériens, environnementaux, de rapport ou les capteurs. Pour commencer, préparez une culture de nuit en inoculant 100 millilitres de milieu LB avec de la kanamycine, avec des cellules E.coli BL21 transformées en opéron lux à partir d’un stock de glycérol, ou directement à partir d’une plaque de transformation.
Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 120 tr/min pendant la nuit. Le lendemain, inoculez 800 millilitres de milieu LB kanamycine avec 8 millilitres de culture de nuit. Incuber la culture à 37 degrés Celsius et 120 tr/min dans un agitateur d’incubateur, jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne une OD600 de 0,6 à 0,8.
Réduire la température d’incubation à 28 degrés Celsius et induire l’expression des protéines en ajoutant 0,1 millimolaire d’IPTG. Observez ensuite les cellules jusqu’à ce qu’elles commencent à briller. Après avoir préparé le milieu selon le protocole de texte, striez les souches bioluminescentes bactériennes sur des plaques de gélose artificielle à l’eau de mer et incuberez-les à 24 à 30 degrés Celsius pendant la nuit.
Préparez une culture de nuit en inoculant 100 millilitres de milieu d’eau de mer artificielle avec une seule colonie de la plaque. Ensuite, incubez la culture à 24 à 30 degrés Celsius et 120 tr/min pendant la nuit. Le lendemain, inoculez 800 millilitres de milieu d’eau de mer artificielle avec 8 millilitres de culture de nuit.
Incuber les cellules bactériennes à 24 à 30 degrés Celsius et 120 tr/min et observez les cellules jusqu’à ce qu’elles commencent à briller. Striez la souche bactérienne bioluminescente souhaitée, ou la souche modifiée d’E. coli sur une plaque de gélose, et incubez la culture à 28 degrés Celsius pendant la nuit. Inoculez 3 millilitres de milieu avec une seule colonie de la plaque de nuit et incubez les cellules à 28 degrés Celsius et 180 tr/min pendant environ une à deux heures.
Mesurer la densité cellulaire d’une dilution de un à dix de la culture liquide à 650 nanomètres. Calculez ensuite le rapport et le volume pour un millilitre de culture avec une OD650 de 0,05. Pipetez le volume calculé de culture et de milieu dans une plaque à paroi noire à 24 puits avec un fond en verre.
Pour s’assurer que le vecteur pET28a contenant l’opéron lux entier ne se perd pas, et qui est exprimé dans la souche modifiée d’E. coli, ajoutez un microlitre de kanamycine et un microlitre d’IPTG aux échantillons. Placez ensuite un couvercle sur la plaque, pour éviter l’évaporation lors des mesures. Enfin, utilisez un lecteur de plaques réglé sur 28 degrés Celsius et un script trouvé dans le protocole texte, pour prendre des mesures d’absorbance et de bioluminescence toutes les 10 minutes, avec des secousses entre les points de données.
Cette figure compare les mesures OD650 des cellules E.coli BL21, des cellules BL21 contenant un vecteur pET28a vide et des cellules BL21 contenant un vecteur pET28a avec l’insert de l’opéron lux-rib, mais sans induction. Les trois mesures de référence pour l’émission de lumière montrent une courbe de croissance sigmoïdale avec des phases de croissance décalée, exponentielle et stationnaire, mais pas d’émission de lumière, à l’exception de ce dernier échantillon, qui montre une émission de lumière après 300 minutes, en raison de la fuite du promoteur T7. Ici, les courbes de croissance et les intensités lumineuses de l’opéron lux exprimé chez E. coli et la souche bactérienne bioluminescente, photobacterium mandapamensis 27561, ont été comparées à 28 degrés Celsius dans LB, ou milieu d’eau de mer artificielle.
La souche modifiée d’E. coli et P. mandapamensis se développent dans un milieu d’eau de mer artificiel, ainsi que dans un milieu LB, et les deux présentent une émission lumineuse. Mais dans le milieu LB, P.Mandapamensis n’émet pas de lumière du tout. Remarquablement, la souche modifiée d’E. coli présente une intensité lumineuse maximale plus élevée que les bactéries bioluminescentes.
Dans cette expérience, l’expression génique de l’opéron lux-rib basé sur E. coli a été mesurée sur 24 heures pour analyser sa longévité. L’émission de lumière a duré 19 heures et demie, beaucoup plus longtemps que les souches bactériennes, où une diminution progressive a été observée, entraînant une émission de lumière très faible après 10 heures. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la bioluminescence pour explorer les opérons de lux dans des organismes modèles, tels que E.Coli.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de travailler avec des bactéries bioluminescentes.
Aperçu
Cet article traite d'une méthode permettant d'étudier les bactéries bioluminescentes, en mettant l'accent sur la régulation de la production de lumière par détection de quorum et la caractérisation des opérons lux dans un système artificiel d’E. coli.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Bioluminescence
- Génétique microbienne
- Signalisation cellulaire
Contexte
- Les bactéries bioluminescentes peuvent émettre de la lumière, ce qui est régulé par divers mécanismes.
- La détection de quorum joue un rôle crucial dans la production de lumière.
- La compréhension des opérons lux est essentielle pour manipuler la bioluminescence.
- Cette recherche peut être appliquée à diverses souches et organismes.
Objectif de l'étude
- Trouver les conditions de croissance optimales pour les bactéries bioluminescentes.
- Déterminer les mécanismes régulateurs de la production de lumière.
- Fournir des informations sur les caractéristiques de l'opéron lux.
Méthodes utilisées
- Préparation de cultures nocturnes d'E. coli contenant des opérons lux.
- Induction de l'expression protéique à l'aide d'IPTG.
- Mesure de l'émission de lumière et de la densité cellulaire à l'aide d'un lecteur de plaques.
- Comparaison des courbes de croissance et des intensités lumineuses entre les souches d'E. coli modifiées et les souches bioluminescentes.
Résultats principaux
- La souche d'E. coli modifiée a présenté une intensité lumineuse plus élevée que celle des bactéries bioluminescentes naturelles.
- L'émission lumineuse provenant de l'opéron lux a duré significativement plus longtemps que celle provenant des souches bactériennes.
- Les courbes de croissance ont montré des phases distinctes avec des émissions lumineuses variables.
- La méthode permet une mise en place et un ajustement faciles pour différents organismes.
Conclusions
- Cette technique améliore la compréhension de la bioluminescence chez les organismes modèles.
- Elle fournit une plateforme pour l'exploration approfondie des opérons lux.
- De futures recherches pourront exploiter cette méthode pour diverses applications dans les études microbiennes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une évaluation normalisée et quantitative de la fonction de l'opéron lux dans des systèmes microbiens conçus, soutenant la validation de cibles en biologie synthétique et dans le développement de biocapteurs. En dissociant la mesure de la bioluminescence de la régulation native par quorum sensing, elle fournit une plateforme contrôlée pour l'analyse mécanistique et la réduction des risques associés aux constructions génétiques. L'approche offre une confiance prédictive quant aux dynamiques d'expression génique et à la fonctionnalité des complexes protéiques, éclairant ainsi les décisions préliminaires de type aller/ne pas aller dans les flux de travail de découverte.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des composants de l'opéron lux et de leurs interactions par suppression ou substitution systématique de gènes.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de constructions génétiques en corrélant l'émission de lumière avec la densité cellulaire sous induction contrôlée.
- Valeur prédictive : Facilite l'évaluation de la formation de complexes protéiques (par exemple, LuxCDE) grâce à une émission lumineuse soutenue comme indicateur fonctionnel.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi pour tests : Génère des données reproductibles de luminiscence résolues dans le temps et d’OD650, adaptées à une utilisation en criblage à haut débit.
- Résultats quantitatifs : Fournit des mesures ratiométriques (lumière par cellule), permettant une normalisation entre souches et conditions expérimentales.
- Réutilisation de la plateforme : Met en place un système modulaire pour tester des variants de l’opéron lux ou l’expression de protéines hétérologues chez E. coli.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Fournit un système pertinent pour l'étude des voies de signalisation bactériennes lorsque le gène lux est utilisé comme marqueur dans des modèles d'infection.
- Réduction des risques mécanistiques : Permet d'isoler la fonction du gène lux des réseaux régulateurs natifs, réduisant ainsi l'ambiguïté dans l'association génotype-phénotype.
- Fiabilité prédictive : Permet d'évaluer la stabilité longitudinale de l'expression génique, essentielle pour apprécier la durabilité des biocapteurs.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation du construit génétique au développement de tests, permettant des cycles itératifs de conception, construction et évaluation pour l'optimisation de biocapteurs.
- Découverte en biologie : Permet la vérification d'hypothèses concernant la fonction du gène lux et l'impact d'éléments régulateurs grâce à une expression inductible et un suivi en temps réel.
- Tri : Fournit des mesures de luminiscence standardisées et reproductibles, compatibles avec des formats de plaques multi-puits, pour l'évaluation comparative de souches ou de variants.
- Analyse : Offre une sortie à deux paramètres (OD650 et luminiscence) permettant de calculer des taux d'émission lumineuse spécifiques pour des comparaisons quantitatives.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans des applications précliniques lorsque le système lux est utilisé comme marqueur dans l'imagerie de cellules vivantes ou dans des modèles d'infection nécessitant une émission de signal stable.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme scalable basée sur E. coli, à expression inductible, applicable à plusieurs projets impliquant la caractérisation de circuits génétiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en permettant une corrélation directe entre la modification génétique et la production quantitative de lumière.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation des tests grâce à des protocoles d'induction définis, un contrôle de la température et une normalisation ratiométrique.
- Valeur stratégique : Renforce la confiance dans les décisions de poursuite ou d'abandon en fournissant dès les premières étapes une évaluation quantitative des performances du construit génétique.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque des variants génétiques en se basant sur leurs profils fonctionnels d'émission lumineuse.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en clonage moléculaire, en culture bactérienne et en utilisation d'un lecteur de plaques pour la détection simultanée de l'absorbance et de la luminescence.
- Dépend d'un équipement capable d'assurer un agitation synchronisée et un cycle de détection de l'absorbance et de la bioluminescence contrôlé en température.
- Exige une standardisation des niveaux d'induction par IPTG et des protocoles de dilution à OD650 entre les utilisateurs et les laboratoires.
- Implique des ajustements à prendre en compte lors de l'extension à des souches hôtes autres qu’E. coli ou à d'autres systèmes rapporteurs.
- Limité par les exigences de stabilité du plasmide, nécessitant une sélection par antibiotique pendant les mesures afin d'éviter la perte du construit.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Expression of Modified E. coli Strains
1:41
Expression of Bacterial Bioluminescent Strain
2:27
In Vivo Activity Assay for Bacterial Bioluminescent Strains and Modified E. coli Strains
3:49
Results: Cell Density and Light Emission of lux Operon in E. coli
5:27
Conclusion
