Une plate-forme de Microphysiologic pour la graisse humaine : en sandwich le tissu adipeux blanc

Cette méthode révolutionnaire nous permet, pour la première fois, de maintenir la graisse vivante et saine ex vivo pendant plusieurs semaines consécutives pour l’étude de la biologie adipeuse. Le principal avantage de cette technique est que le tissu reste stable pendant huit semaines dans la culture tout en récapitulant le microenvironnement adipeux, y compris les cellules de soutien stromales adipeuses natives environnantes. Commencez par ensemencer l’ASC à une confluence d’environ 80 % dans les plaques de culture tissulaire.

Pour chaque puits de SWAT souhaité, ensemencer un puits de culture tissulaire conventionnel et un puits de taille correspondante sur une plaque de plastique de culture tissulaire revêtue de PNIPAAm. Maintenir l’ASC dans un milieu de culture complet à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant six à huit jours, en changeant le milieu tous les deux jours. Vingt-quatre heures avant l’ensemencement SWAT, enroulez le bord du disque du piston de chaque piston de l’appareil d’ensemencement SWAT au moins deux fois avec du ruban adhésif de laboratoire pour éviter les fuites de la solution de gélatine.

Dans une enceinte de biosécurité désinfectée à l’éthanol, vaporisez un support de tubes coniques de 15 millilitres contenant des tubes coniques de 15 millilitres vides et non bouchés, ainsi que chaque piston enveloppé de ruban adhésif avec de l’éthanol à 70 %, en plaçant chaque piston dans un tube vide au fur et à mesure qu’il est désinfecté. Vaporisez des rondelles métalliques d’environ 6,3 grammes et placez-les sur le support avec une paire de pinces à crochet. Fermez ensuite le châssis de l’armoire et allumez la lumière UV pour faciliter le séchage et la stérilisation pendant la nuit des matériaux de l’appareil d’ensemencement.

Lorsque les cellules atteignent 100 % de confluence et présentent un motif strié, ajoutez 0,75 gramme de poudre de gélatine à 10 millilitres de HBSS. Et équilibrez le pH de la solution avec 100 microlitres d’hydroxyde de sodium. Ajoutez la gélatine dans un bain-marie à 75 degrés Celsius et secouez vigoureusement le tube toutes les cinq minutes jusqu’à ce que la poudre se dissolve dans la solution.

Filtrez la solution de gélatine homogène à travers un filtre à seringue et appliquez la gélatine dans les pistons. Les bords collés des pistons serviront de moule pendant que la gélatine se solidifie. Lorsque la gélatine s’est solidifiée, déballez le ruban et utilisez la pince à crochet pour retirer la gélatine du bord extérieur du piston, en veillant à ce que la gélatine restante au centre du piston soit complètement de niveau, afin de maximiser le contact avec la feuille ASC.

Une fois que la gélatine a été retirée de tous les pistons, appliquez délicatement chaque piston sur une plaque ASC revêtue de PNIPAAm à l’aide des rondelles métalliques pour alourdir les pistons. Après une incubation de 1,5 heure à température ambiante, transférez les plaques dans un bain d’eau glacée pendant 1,5 heure supplémentaire pour compléter la dissociation de la feuille cellulaire de la surface de la plaque revêtue de PNIPAAm. Ensuite, nettoyez le fond des plaques revêtues de PNIPAAm pour éliminer toute eau non stérile.

À la réception du tissu adipeux humain, ajouter le milieu de culture de cellules froides dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre par culture à ensemencer. Et lavez trois fois de grands segments du tissu adipeux dans du PBS stérile, en enlevant autant de PBS que possible entre les lavages. Après le dernier lavage, utilisez une pince et un rasoir stérile pour hacher grossièrement le tissu, en enlevant autant de système vasculaire et de fascia que possible jusqu’à ce que la solution prenne une consistance liquide épaisse avec le moins de segments individuels visibles de tissu adipeux blanc que possible.

Une fois qu’une consistance tissulaire appropriée a été atteinte, utilisez une pointe de micro-pipette P1000 modifiée pour transférer le volume approprié de tissu haché dans chaque tube de 1,5 millilitre préalablement préparé et mélangez brièvement le tissu haché avec le milieu à l’intérieur des tubes. Ensuite, remplacez le milieu dans chaque culture ASC par un volume de solution de tissu adipeux blanc, et transférez doucement les pistons de gélatine dans le mélange de tissu adipeux blanc sur les plaques ASC de base. Examinez au microscope les monocouches des plaques revêtues de PNIPAAm pour confirmer le détachement cellulaire et déplacez les plaques à la surface d’un bloc de chaleur de 37 à 40 degrés Celsius dans l’enceinte de biosécurité.

Ajoutez ensuite deux à trois millilitres de milieu de culture chauffé pour incuber les cellules et faciliter la fusion de la gélatine. Après 30 minutes, retirez délicatement les pistons de la surface de la plaque, couvrez les cultures avec les couvercles de plaque appropriés et placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire. Lorsque la gélatine s’est complètement liquéfiée, aspirez et remplacez le milieu de culture cellulaire par le volume approprié de milieu M199 sans rouge de phénol complété par de l’insuline, de la dexaméthasone et des antibiotiques.

Après 7,5 semaines de culture, les grappes SWAT restent en place sur la monocouche, seuls de légers changements morphologiques étant observés dans les adipocytes individuels. La coloration rouge du Nil clair des amas d’adipocytes uniloculaires à deux semaines de culture démontre que les cellules sont effectivement des adipocytes avec des membranes intactes, plutôt que des artefacts, des kystes ou des adipocytes morts. La coloration à l’iodure de propidium sur des cultures SWAT de 53 jours et la coloration au rouge huile O sur des cultures SWAT de 51 jours confirment que les adipocytes maintiennent la viabilité même à des moments avancés.

L’immunocytochimie démontre l’expression protéique attendue appropriée et la localisation des marqueurs adipocytaires matures dans le SWAT et la PCR quantitative indique l’expression des gènes adipocytaires clés au niveau transcriptionnel. L’évaluation de la fonction endocrinienne du basilic indique une sécrétion de leptine de basilic à partir des cultures SWAT détectée par ELISA, et la libération de glycérol peut également être induite en réponse à une stimulation chimique. La xénotransplantation d’adipocytes cultivés par SWAT révèle des dépôts de graisse clairement visibles et facilement récupérés 10 jours après la transplantation qui colorent les marqueurs adipocytaires humains mais pas les marqueurs adipocytaires de souris.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en cinq heures environ si elle est exécutée correctement. Il est important de se rappeler de traiter rapidement le tissu primaire pour minimiser la mort cellulaire. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR quantitative en temps réel, l’immunomarquage ou les tests fonctionnels peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont les adipocytes réagissent à divers médicaments ou toxines.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser la culture SWAT en tant que plate-forme stable et fiable pour votre recherche adipeuse. N’oubliez pas que travailler avec des tissus humains primaires peut être dangereux et que des précautions telles que le port de l’EPI approprié et la manipulation des tissus sous des enceintes de biosécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.