Détection de protéines localisation subcellulaire par Green Fluorescence marquage de protéines et 4', 6-Diamidino-2-phénylindole coloration chez Caenorhabditis elegans
30 juillet 2018
Ce protocole montre comment suivre une translocation nucléaire de protéines sous la contrainte thermique à l’aide d’une protéine de fusion de protéine (GFP) par fluorescence verte comme un marqueur et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration. Le DAPI souillant le protocole est rapide et préserve les signaux de localisation sous-cellulaire GFP et de protéines.
Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de C. elegans, comme la biologie cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’obtenir simultanément des signaux de coloration nucléaire, de GFP et de changements de localisation subcellulaire. Pour commencer, générez un alignement extrachromosomique avec une construction translationnelle de gènes cibles.
Vous pouvez également vous procurer de telles lignées auprès du Centre de génétique Caenorhabditis, qui est une ressource publique pour la recherche sur C. elegans. Ou, d’un laboratoire de recherche précédemment publié. Après avoir exposé les vers aux rayons gamma pour intégrer les lignées extrachromosomiques dans le génome, sélectionnez les lignées exprimées de manière stable afin que chaque animal exprime une protéine marqueur telle qu’une GFP ou un rouleau.
Pour éliminer les mutations générées pendant le rayonnement, croisez les lignes au moins deux fois. Utilisez la lignée transgénique résultante pour détecter les changements du profil d’expression des protéines en cas de stress. Ensuite, après avoir préparé des plaques de vers NGM selon le protocole de texte, striez un clone d’OP50 et cultivez la bactérie dans un bouillon LB liquide pendant la nuit.
Ensemencez les plaques NGM avec une culture liquide OP50 et incubez les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour faire pousser des bactéries comme source de nourriture pour les vers. Refroidissez les plaques à température ambiante pendant au moins 30 minutes avant utilisation. Cultivez la lignée transgénique à 20 degrés Celsius sans famine, pendant au moins deux générations avant le test de stress thermique.
Choisissez huit à dix jeunes adultes gravides pour une nouvelle plaque de vers. Ensuite, laissez-les pondre des œufs pendant environ trois à cinq heures et retirez tous les adultes des assiettes. Pour synchroniser les vers, laissez les œufs éclore et faire pousser les larves pendant environ 48 heures jusqu’au quatrième stade larvaire, ou stade L4.
Cela peut être identifié par la vulve, qui est une structure en demi-lune. Ensuite, stressez thermiquement les vers en incubant les plaques avec les larves L4 à 35 degrés Celsius pendant deux à cinq heures. Incluez un thermomètre dans un incubateur pour mesurer avec précision la température.
Pipette 10 microlitres de M9 au centre d’une lame de verre. Ensuite, choisissez des vers choqués par la chaleur et transférez-les dans la goutte de tampon. Vous pouvez également utiliser M9 pour laver les vers de la plaque.
Ensuite, centrifugez l’échantillon à 1000 fois la gravité à température ambiante pendant une minute. Jetez le surnageant, puis ajoutez les vers sur la lame de verre. Sous un microscope à dissection, utilisez un tissu mou pour drainer tout excès de liquide.
Ensuite, pendant que vous êtes encore sous le microscope, ajoutez 10 microlitres d’alcool à 95 % sur les vers et continuez à les observer. Immédiatement après le séchage de l’éthanol, répétez l’ajout d’éthanol deux fois de plus. Il est essentiel pour le processus d’évaporation de l’éthanol des animaux sous le microscope de dissection.
Une fois que l’éthanol se détache des animaux, passez immédiatement à l’étape suivante. Ajoutez 10 microlitres de DAPI aux vers. Appliquez immédiatement une lamelle et scellez la lame avec du gel de vernis à ongles transparent.
Après avoir laissé le vernis à ongles prendre pendant environ 10 minutes, observez les animaux au microscope à fluorescence. Pour fixer les animaux avec de l’acétone, utilisez M9 pour laver la plaque choquée thermiquement et centrifuger l’échantillon à 1000 fois la gravité à température ambiante pendant une minute. Jetez le surnageant et utilisez un millilitre d’eau distillée pour laver la pastille.
Après avoir retiré le surnageant, ajoutez 400 microlitres d’acétone à 30 % et incubez l’échantillon pendant 15 minutes. Ensuite, centrifugez le tube à 1000 fois la gravité à température ambiante pendant une minute. Après avoir jeté le surnageant, utilisez 500 microlitres d’eau distillée pour laver les animaux deux fois.
Ajoutez 200 microlitres de DAPI dans la pastille, soit quatre fois le volume total des vers dans le tube, et incubez l’échantillon pendant 15 minutes. Centrifugez l’échantillon et jetez le surnageant. Utilisez ensuite 500 microlitres d’eau distillée pour laver le granulé deux fois avant de le monter et de l’imager comme précédemment.
Pour effectuer l’imagerie, allumez la source de lumière UV et le microscope à fluorescence. Allumez ensuite l’ordinateur connecté au microscope. Chargez la lame sur le microscope à fluorescence.
Utilisez un objectif 10X pour localiser les vers. Augmentez ensuite la puissance de grossissement à 400X et faites la mise au point sur l’échantillon. Ensuite, ouvrez le logiciel fourni avec le microscope.
Cliquez sur Acquisition, puis sur Appareil photo, et sélectionnez l’appareil photo connecté au microscope. Sous la même acquisition, cliquez sur Acquisition multidimensionnelle. Une nouvelle fenêtre de navigation Acquisition multidimensionnelle s’ouvre.
Cliquez sur le bouton multicanal et toutes les chaînes disponibles apparaîtront. Choisissez le bleu, le vert et le DIC pour observer l’échantillon. Dans la fenêtre de navigation Acquisition multidimensionnelle, laissez les canaux DAPI bleu, GFP vert et DIC gris activés, puis cliquez avec le bouton droit sur d’autres canaux, tels que le Rhodamine rouge et le Brightfield blanc, pour les fermer.
Pour mesurer le temps d’exposition de chaque canal, cliquez avec le bouton gauche de la souris sur le canal DAPI bleu pour le sélectionner et cliquez sur mesurer pour prendre une image en direct avec un temps d’exposition automatisé. Sur le côté gauche de la fenêtre de l’image en direct, ajustez manuellement le temps d’exposition si vous le souhaitez, puis cliquez sur OK. Configurez les temps d’exposition pour les canaux GFP et DIC de la même manière. Dans la fenêtre de navigation de l’acquisition multidimensionnelle, cliquez sur Démarrer" pour collecter automatiquement trois images sous les trois canaux différents, dans l’ordre, avec les temps d’exposition définis.
Pour enregistrer le fichier, dans le menu principal, cliquez sur Fichier, Enregistrer sous.Entrez le nom du fichier et le dossier. Enregistrez le fichier dans le format de fichier par défaut afin de conserver les informations détaillées de l’image pour référence future. Pour exporter le fichier dans d’autres formats, sous Fichier, cliquez sur Exporter.
Définissez le nom du fichier et le dossier. Cochez la case Créer un dossier de projet pour mieux organiser les données. Après avoir choisi le type de fichier souhaité dans le menu déroulant, cliquez sur Démarrer" pour exporter.
Il existe deux homologues protéiques du canal intracellulaire du chlorure chez C. elegans, exl-1 et exc-4. Une étude récente a montré que exl-1 régule la gestion du stress chez l’animal. Ici, une construction translationnelle exl-1 GFP a été intégrée dans un génome animal, et des lignées transgéniques ont été créées, qui expriment de manière stable exl-1 fluorescente verte.
En cas de stress thermique, exl-1 GFP s’accumule dans le noyau de la région intestinale lorsqu’un signal GFP fort chevauche le noyau. Pour confirmer la localisation subcellulaire d’exl-1, une coloration DAPI a été réalisée chez des animaux fixés à l’éthanol et à l’acétone. Les deux méthodes montrent des noyaux clairs dans le corps de l’animal et le chevauchement des signaux GFP et DAPI confirme que la GFP exl-1 s’est effectivement accumulée dans les noyaux de la région intestinale.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une fixation rapide pour préserver le signal GFP et la translocation nucléaire des protéines sous stress chez C. elegans.
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Aperçu
Ce protocole décrit comment suivre la translocation nucléaire d'une protéine sous stress thermique en utilisant une protéine de fusion GFP comme marqueur et une coloration au DAPI. La méthode est rapide et efficace, permettant l'observation simultanée des modifications de la coloration nucléaire et de la localisation subcellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Neurosciences
- Génétique
Contexte
- La compréhension de la localisation des protéines est essentielle en biologie cellulaire.
- Le stress thermique peut affecter la translocation et la localisation des protéines.
- Les protéines de fusion GFP constituent des marqueurs précieux pour le suivi des protéines.
- La coloration par DAPI fournit une méthode permettant de visualiser les noyaux.
Objectif de l'étude
- Suivre la translocation nucléaire des protéines lors d'un stress thermique.
- Utiliser la GFP comme marqueur de la localisation protéique.
- Montrer un protocole rapide de coloration par DAPI.
Méthodes utilisées
- Génération de réseaux extrachromosomiques avec des constructions traductionnelles.
- Exposition des C. elegans à un rayonnement gamma pour intégration.
- Sélection de lignées exprimant de façon stable des protéines marqueuses.
- Observation simultanée de la localisation nucléaire et sous-cellulaire.
Résultats principaux
- Tracking réussi de la translocation nucléaire lors d'un stress thermique.
- Visualisation efficace de la coloration GFP et DAPI.
- Démonstration de l'efficacité du protocole chez C.elegans.
- Fourni des informations sur la dynamique de la localisation protéique.
Conclusions
- Le protocole constitue un outil précieux pour l'étude de la dynamique des protéines.
- Les méthodes rapides et efficaces améliorent la recherche en biologie cellulaire.
- Les applications futures pourraient s'étendre à d'autres conditions de stress.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet un suivi rapide, sans anticorps, des changements de localisation subcellulaire des protéines en réponse au stress, soutenant ainsi la validation précoce de cibles dans les flux de découverte. En combinant le marquage GFP avec une coloration nucléaire au DAPI, il fournit une confirmation quantitative et visuelle de la translocation, telle que l’accumulation nucléaire lors d’un stress thermique, ce qui peut éclairer la détection mécanistique des hypothèses thérapeutiques. La compatibilité de cette méthode avec les microscopes à fluorescence standards la rend accessible pour la préparation de criblages à haut débit et son utilisation par des équipes pluridisciplinaires dans des contextes de R&D en biopharmacie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'observation directe de la translocation des protéines induite par le stress, soutenant ainsi la validation fonctionnelle des cibles et l'analyse des voies biologiques.
- Valeur opérationnelle : Élimine le besoin d'anticorps ou d'étiquettes radioactives, réduisant ainsi le temps et le coût de développement des tests.
- Valeur prédictive : Confirme les changements de localisation subcellulaire pouvant indiquer un mécanisme d'action ou une modulation de la réponse au stress.
Développement de tests et de criblages
- Prêt-à-l'essai : Génère des lignées transgéniques stables exprimant des protéines marquées par la GFP pour des plates-formes de criblage cohérentes et reproductibles.
- Production quantitative : Permet la mesure simultanée du signal GFP et de la coloration nucléaire par le DAPI pour une analyse de co-localisation.
- Extensibilité : Compatible avec la microscopie à fluorescence standard, permettant une adaptation à des formats multi-puits pour le criblage de composés.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Suit la localisation d'EXL-1, une protéine de la famille CLIC possédant des homologues chez les mammifères (par exemple, CLIC4), soutenant ainsi l'évaluation préclinique du gène cible.
- Dérisquage mécanistique : Confirme la translocation nucléaire en cas de stress thermique, mais pas en cas de stress oxydatif, permettant ainsi de définir le comportement spécifique du gène cible selon les conditions.
- Continuité préclinique : Fournit un système réutilisable pour évaluer la dynamique protéique dans différentes conditions de stress avant la validation in vivo.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur une cible à l'identification d'un composé précurseur, en particulier pour les protéines sensibles au stress. Elle permet de prendre des décisions précoces de poursuite ou d'abandon en validant l'interaction avec la cible et les dynamiques subcellulaires avant les campagnes de criblage de composés.
- Biologie de la découverte : Teste des hypothèses thérapeutiques en visualisant les changements de localisation des protéines dans des conditions de stress définies.
- Criblage : Prépare des systèmes cellulaires validés pour le criblage de bibliothèques de composés, avec des lectures intégrées de la localisation.
- Analytique : Génère des données de co-localisation (recouvrement GFP/DAPI) comme sortie quantitative pour évaluer les effets des composés sur le trafic protéique.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes chez C. elegans à des systèmes mammaliens par l'intermédiaire de protéines CLIC conservées, soutenant ainsi une validation ciblée trans-espèces.
- Réutilisation en entreprise : Met en place un pipeline modulaire et réutilisable pour suivre la dynamique subcellulaire de toute protéine marquée par GFP sous stress ou exposition à des composés.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en fournissant une preuve visuelle directe de la translocation des protéines dans des cellules vivantes.
- Valeur opérationnelle : Standardise les protocoles de fixation et d'imagerie entre les équipes, améliorant la reproductibilité et réduisant la variabilité.
- Valeur stratégique : Accélère les délais de validation des cibles, permettant un tri plus rapide des portefeuilles et réduisant les investissements dans des cibles faussement positives.
- Impact sur le portefeuille : Favorise l'avancement ajusté au risque en confirmant le comportement des cibles dans des modèles de stress pertinents pour la maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation de C. elegans, la génération de lignées transgéniques et la microscopie à fluorescence.
- Suppose l'accès à un microscope à fluorescence équipé de filtres pour FITC et DAPI, ainsi qu'à des optiques Nomarski.
- Exige une standardisation du temps de fixation (éthanol/acétone) et de la coloration afin de préserver le signal GFP et garantir un marquage nucléaire par DAPI reproductible.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles peut nécessiter une optimisation de la force du promoteur, de l'efficacité du marquage et des protocoles de stress.
- Limite pratique : convient mieux aux protéines présentant une translocation détectable ; peut ne pas permettre de résoudre des événements de transport rapide ou transitoire sans imagerie en temps réel.
