Name: Détection de protéines localisation subcellulaire par Green Fluorescence marquage de protéines et 4, 6-Diamidino-2-phénylindole coloration chez Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Découvrez une méthode rapide de marquage GFP et coloration DAPI pour visualiser la translocation nucléaire des protéines sous stress thermique chez Caenorhabditis elegans. Cette technique permet d'observer simultanément le noyau et la localisation subcellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les souches de c. elegans utilisées dans cette étude ont été obtenues depuis le centre de génétique de Caenorhabditis, qui est soutenu par le National Institutes of Health - programmes d’Infrastructure du Bureau de la recherche (P40 OD010440). Ce travail a été soutenu par les NIH : 1R03AG048578-01 Jun Liang, CUNY-groupe 1501 à Jun Liang et CFP-CUNY 66184-00 44 et 45/67248-00 Jun Liang. Cathy Savage-Dunn nous remercions de bien vouloir partager son espace de laboratoire. Toutes les images de fluorescence ont été perçus au Queens College Core Facility. Nous remercions William J. Rice pour ses commentaires sur le manuscrit.

1. les solutions
<ol><li>
Plaques NGM
	<ol>
<li>Dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L, ajouter 3 g de NaCl, 17 g de gélose, 2,5 g de Peptone et 975 mL de dH2O. la couverture de l’embouchure de la fiole avec du papier aluminium. Autoclave le flacon pour 50 min. refroidir pendant 20 à 30 min.</li>
		<li>Ajouter ensuite des solutions stérilisées : 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de cholestérol 5 mg/mL dans de l’éthanol, 1 mL de 1 M MgSO4et 25 mL de tampon de4 (pH 6.0) KPO 1 M. Agiter les solutions pour bien les mélanger.</li>
		<li>En utilisant un distributeur de liquide, ajouter la solution NGM pour plats de Pétri de 60 mm. Remplissage des plaques de 2/3 plein d’agar. Entreposez-les dans un contenant hermétique à 4 ° C pour une utilisation future.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tampon de4 M 1 KPO (pH 6.0)
	<ol>
<li>Dissoudre 10,83 KH2PO4 et 3,56 g K2HPO4 dH2O, puis ajustez le volume total à 100 mL. Autoclave la solution pendant 15 minutes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
M9
	<ol>
<li>Dissoudre 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl dans dH2O, ajouter 1 mL de 1 M MgSO4et ajuster le volume total de 1 L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
10 µg/mL DAPI
	<ol>
<li>Ajouter 1 µL de 10 mg/mL DAPI dans 999 µL de dH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
alcool à 95 % (v/v)
	<ol>
<li>Mesurer 95 mL d’alcool à 100 % et ajouter de l’eau distillée pour régler le volume à 100 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
acétone 30 % (v/v)
	<ol>
<li>Ajouter 30 mL d’acétone à dH2O et ajuster le volume à 100 mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Stress thermique
<ol><li>Générer une ligne de tableau extrachromosomique dont une construction translationnelle des gènes de cible9,10. Également obtenir ces lignes de la centre de génétique de Caenorhabditis (CCG), qui est une ressource publique pour la recherche de c. elegans , ou d’un laboratoire de recherche déjà publiés.</li>
	<li>Intégrer les lignes extrachromosomiques dans le génome en exposant les vers à 3 800 rayonnement γ Rad9. Ensuite, sélectionnez les lignes stablement expresses afin que chaque animal exprime une protéine marqueur tel qu’un GFP ou rouleau.</li>
	<li>Pour supprimer les mutations générées pendant le rayonnement, croiser les lignes au moins 2 x. Cette lignée transgénique permet de détecter les changements de modèle expression protéiques sous contrainte.</li>
	<li>Préparer les plaques ver NGM comme indiqué au point 1.1. Ensemencer un clone OP50 et culture de la bactérie dans un bouillon LB liquide du jour au lendemain. Graines les plaques NGM avec liquide OP50 culture et incuber les boîtes dans un incubateur à 37 ° C durant la nuit à cultiver une pelouse de bactéries comme source de nourriture pour les vers. Refroidir les plaques à température ambiante pendant au moins 30 min avant utilisation.</li>
	<li>Cultiver la lignée transgénique à 20 ° C sans faim au moins 2 générations avant le test de stress de chaleur.</li>
	<li>Choisissez 8 à 10 jeunes adultes gravides (utérus rempli d’oeufs) pour une nouvelle plaque de ver, puis laissez les pondent des œufs pendant environ 3 à 5 h et retirer les plaques de tous les adultes.</li>
	<li>Pour synchroniser les vers, laissez les œufs éclosent et poussent les larves pendant environ 48 h au quatrième stade larvaire (L4). Examiner leur structure de la vulve (une structure de demi-lune) afin d’identifier le L4 stade (Figure 1, flèche)11.</li>
	<li>Placer les plaques de ver avec la larve L4 dans une étuve à 35 ° C pendant 2 à 5 h atteindre le stress thermique. Placez un thermomètre dans la couveuse pour mesurer avec précision la température.</li>
</ol>3. la coloration DAPI
<ol><li>
Fixation de l’éthanol
	<ol>
<li>Ajouter 10 µL de tampon M9 dans le centre d’une lame de verre.</li>
		<li>Choisir les vers un choc thermique de l’étape 2.8 et placez-les dans le tampon de M9 sur la lame de verre.<ol>
<li>Vous pouvez également laver la plaque avec le M9, il centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Ajouter les vers à la lame de verre.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utiliser un linge doux pour vider tout le liquide en excès. Regarder cette étape sous un microscope à dissection.</li>
		<li>Ajouter 10 µL d’alcool à 95 % sur les vers et les laisser sécher à l’air. Regarder le processus sous un microscope à dissection et ne laissez pas les animaux deviennent trop secs. Immédiatement après que l’éthanol est évaporé des animaux, passez à l’étape suivante. Remarque : L’éthanol s’évapore très rapidement.</li>
		<li>Répétez l’étape 3.1.4 deux fois afin que les vers sont fixes. Remarque : Il est normal que les animaux semblent plus sombres et déformée.</li>
		<li>Ajouter 10 µL de DAPI (10 µg/mL) à la worms. Immédiatement, recouvrir d’un lamelle couvre-objet et sceller la diapositive avec gel vernis à ongles transparent.</li>
		<li>Découvre les animaux après environ 10 min sur un microscope à fluorescence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fixation de l’acétone (une autre approche)
	<ol>
<li>Laver la plaque de choc thermique de l’étape 2.8 avec M9, il centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Laver le culot avec 1 mL de dH2O, percevoir le culot et éliminer le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 400 µL d’acétone 30 % pendant 15 min. Centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min à température ambiante et éliminer le surnageant. Permet de laver les animaux 2 500 µL de dH2O x. Jeter le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 200 µL de DAPI (10 µg/mL), ou 4 fois le montant du volume du ver total, dans le tube pendant 15 min.</li>
		<li>Centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min et éliminer le surnageant. Laver le culot 2 x avec 500 µL de dH2O. Placer les vers sur lames de verre, couvrez-les avec lamelles couvre-objet, sceller la diapositive avec le vernis à ongles transparent gel et observer les animaux sous un microscope à fluorescence.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. microscopique imagerie
<ol><li>Allumez la source de lumière UV et un microscope à fluorescence. Allumez l’ordinateur connecté au microscope.</li>
	<li>Chargez la lame sur le microscope à fluorescence. Un objectif de faible puissance (10 X) permet de localiser les vers, augmenter la puissance de grossissement 400 X et se concentrer sur le spécimen.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel fourni avec le microscope. Cliquez sur « Acquisition » dans le menu ; Cliquez sur « Appareil photo » et sélectionnez la caméra connectée au microscope ; Cela permet à la caméra sélectionnée communiquer avec le logiciel. Remarque : Les différents microscopes peuvent varier dans l’opération.</li>
	<li>Sous la même « Acquisition », cliquez sur « Acquisition multidimensionnelle ». Cela ouvre une nouvelle fenêtre de navigation « Acquisition multidimensionnelle ». Cliquez sur le bouton « Multicanal », et tous les canaux disponibles apparaîtra.</li>
	<li>Choisissez le bleu, le vert et DIC (contraste interférentiel différentiel) pour observer l’échantillon. Dans la fenêtre de navigation « Acquisition multidimensionnelle », laissez le « Blue-DAPI », « Vert-GFP » et « Gris-DIC », « Nomarski » canaux Faites un clic droit sur d’autres chaînes, telles que « Red-rhodamine » et « champ blanc brillant », pour les fermer.</li>
	<li>
Tout d’abord, mesurer le temps d’exposition pour chaque canal :
	<ol>
<li>Cliquez sur le canal « Bleu-DAPI » pour le sélectionner puis cliquez sur « Mesure » afin de prendre une image en direct sous la manche DAPI avec la durée d’exposition automatique. Une nouvelle fenêtre avec une image en direct apparaîtra.</li>
		<li>Sur le côté gauche de la fenêtre de l’image en direct, ajuster manuellement la durée d’exposition si nécessaire pour rendre l’image comme vous le souhaitez.</li>
		<li>Enfin, cliquez sur " "OK » dans la fenêtre de l’image en direct. Ceci définit le temps d’exposition sous le canal DAPI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répétez l’étape 4.6 pour les autres chaînes, « Green-GFP » et « Gris-DIC », « Nomarski », de mettre en place les temps d’exposition pour ces chaînes.</li>
	<li>Dans la fenêtre de navigation « Acquisition multidimensionnelle », cliquez sur « Démarrer » pour recueillir automatiquement des 3 images sous les 3 différents canaux dans l’ordre (voir ci-dessus) avec des durées d’exposition spécifiques énoncés.</li>
	<li>Pour enregistrer le fichier, allez dans le menu principal, cliquez sur « Fichier » puis sur « Enregistrer sous ». Nom du fichier d’entrée et le nom du dossier. Enregistrez le fichier sous le format de fichier par défaut pour conserver les informations détaillées d’imagerie pour référence ultérieure.</li>
	<li>
Pour exporter le fichier dans d’autres formats :
	<ol>
<li>Allez dans « Fichier » et cliquez sur « Export ». Cela va ouvrir une fenêtre de réglage d’exportation.</li>
		<li>Définissez le nom de fichier et de dossier. Cochez « Créer un dossier de projet » afin de mieux organise les données. Le logiciel permet également l’utilisateur de spécifier 4 autres options : « Generate fusionnée images », « Utiliser la couleur pour les images de canal », « Utiliser des noms de canal » et « L’image fusionnée seulement ».</li>
		<li>Choisissez un type de fichier souhaité dans le menu déroulant, comme « TIF », « BMP », « PSD », ou « JPG » et d’autres types. Cliquez ensuite sur « Start » pour l’exportation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+transcription+factor+activation+by+oxidative+stress+mediated+by+the+small+GTPase+Ral+and+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK.</a> The EMBO Journal. 23 (24), 4802-4812 (2004).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK+regulates+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans+by+modulating+nuclear+translocation+of+forkhead+transcription+factor%2FDAF-16%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">JNK regulates lifespan in Caenorhabditis elegans by modulating nuclear translocation of forkhead transcription factor/DAF-16.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (12), 4494-4499 (2005).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+cleaved+BID+targets+mitochondria+and+is+required+for+cytochrome+c+release%2C+while+BCL-XL+prevents+this+release+but+not+tumor+necrosis+factor-R1%2FFas+death%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R1/Fas death.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (2), 1156-1163 (1999).</li>
<li>Doerflinger, M., Glab, J. A., Puthalakath, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+proteins%3A+a+20-year+stock-take%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">BH3-only proteins: a 20-year stock-take.</a> The FEBS Journal. 282 (6), 1006-1016 (2015).</li>
<li>Mayorova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+containing+aragonite+crystals+mediate+responses+to+gravity+in+Trichoplax+adhaerens+%28Placozoa%29%2C+an+animal+lacking+neurons+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cells containing aragonite crystals mediate responses to gravity in Trichoplax adhaerens (Placozoa), an animal lacking neurons and synapses.</a> PLoS One. 13 (1), e0190905(2018).</li>
<li>Terron-Camero, L. C., Molina-Moya, E., Sanz-Fernandez, M., Sandalio, L. M., Romero-Puertas, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+%28ROS%2FRNS%29+during+hypersensitive+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS) during hypersensitive cell death.</a> Methods in Molecular Biology. , 97-105 (2018).</li>
<li>Pedrazzini, E., Vitale, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29043678">Protein biosynthesis and maturation in the ER.</a> Methods in Molecular Biology. , 179-189 (2018).</li>
<li>Liang, J., Shaulov, Y., Savage-Dunn, C., Boissinot, S., Hoque, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+intracellular+channel+proteins+respond+to+heat+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chloride intracellular channel proteins respond to heat stress in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (9), e0184308(2017).</li>
<li>Evans, T. C. Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Yochem, J. Nomarski images for learning the anatomy, with tips for mosaic analysis. <a target="_blank" href="http://www.wormbook.org">Wormbook</a>. , edited by The C. elegans Research Community (2006).</li>
<li>Dulhunty, A., Gage, P., Curtis, S., Chelvanayagam, G., Board, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutathione+transferase+structural+family+includes+a+nuclear+chloride+channel+and+a+ryanodine+receptor+calcium+release+channel+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The glutathione transferase structural family includes a nuclear chloride channel and a ryanodine receptor calcium release channel modulator.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (5), 3319-3323 (2001).</li>
<li>Suh, K. S., Malik, M., Shukla, A., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4%2C+skin+homeostasis+and+cutaneous+cancer%3A+surprising+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">CLIC4, skin homeostasis and cutaneous cancer: surprising connections.</a> Molecular Carcinogenesis. 46 (8), 599-604 (2007).</li>
<li>Yao, Q., Qu, X., Yang, Q., Wei, M., Kong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIC4+mediates+TGF-beta1-induced+fibroblast-to-myofibroblast+transdifferentiation+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">CLIC4 mediates TGF-beta1-induced fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in ovarian cancer.</a> Oncology Reports. 22 (3), 541-548 (2009).</li>
<li>Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Edwards, J. C., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+a+chloride+intracellular+channel+gene%2C+CLIC4%2C+in+transforming+growth+factor-beta1-mediated+conversion+of+fibroblasts+to+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differential expression of a chloride intracellular channel gene, CLIC4, in transforming growth factor-beta1-mediated conversion of fibroblasts to myofibroblasts.</a> The American Journal of Pathology. 161 (2), 471-480 (2002).</li>
<li>He, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CLIC4+in+the+host+innate+responses+to+bacterial+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of CLIC4 in the host innate responses to bacterial lipopolysaccharide.</a> European Journal of Immunology. 41 (5), 1221-1230 (2011).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+CLIC4+enhances+autophagy+and+triggers+mitochondrial+and+ER+stress-induced+apoptosis+in+human+glioma+U251+cells+under+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of CLIC4 enhances autophagy and triggers mitochondrial and ER stress-induced apoptosis in human glioma U251 cells under starvation.</a> PLoS One. 7 (6), e39378(2012).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130 (26), 6453-6464 (2003).</li>
<li>Leopold, L. E., Heestand, B. N., Seong, S., Shtessel, L., Ahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+pairing+during+meiosis+triggers+multigenerational+transgene+silencing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lack of pairing during meiosis triggers multigenerational transgene silencing in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), E2667-E2676 (2015).</li>
<li>Schultz, R. D., Bennett, E. E., Ellis, E. A., Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+extracellular+matrix+organization+by+BMP+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of extracellular matrix organization by BMP signaling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 9 (7), e101929(2014).</li>
<li>Matus, D. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+cell+fate+requires+G1+cell-cycle+arrest+and+histone+deacetylase-mediated+changes+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Invasive cell fate requires G1 cell-cycle arrest and histone deacetylase-mediated changes in gene expression.</a> Developmental Cell. 35 (2), 162-174 (2015).</li>
<li>Reddy, K. C., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+HIM-17+links+chromatin+modification+and+competence+for+initiation+of+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans HIM-17 links chromatin modification and competence for initiation of meiotic recombination.</a> Cell. 118 (4), 439-452 (2004).</li>
<li>Ames, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-cell-autonomous+role+of+BEC-1%2FBECN1%2FBeclin1+in+coordinating+cell-cycle+progression+and+stem+cell+proliferation+during+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A non-cell-autonomous role of BEC-1/BECN1/Beclin1 in coordinating cell-cycle progression and stem cell proliferation during germline development.</a> Current Biology. 27 (6), 905-913 (2017).</li>
<li>Pekar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+environment%2C+DAF-7%2FTGFbeta+signaling+and+LAG-2%2FDSL+ligand+expression+in+the+germline+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Linking the environment, DAF-7/TGFbeta signaling and LAG-2/DSL ligand expression in the germline stem cell niche.</a> Development. 144 (16), 2896-2906 (2017).</li>
<li>Schvarzstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+helicase+HIM-6%2FBLM+both+promotes+MutSgamma-dependent+crossovers+and+antagonizes+MutSgamma-independent+interhomolog+associations+during+caenorhabditis+elegans+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA helicase HIM-6/BLM both promotes MutSgamma-dependent crossovers and antagonizes MutSgamma-independent interhomolog associations during caenorhabditis elegans meiosis.</a> Genetics. 198 (1), 193-207 (2014).</li>
<li>Flemming, A. J., Shen, Z. Z., Cunha, A., Emmons, S. W., Leroi, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+polyploidization+and+cellular+proliferation+drive+body+size+evolution+in+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Somatic polyploidization and cellular proliferation drive body size evolution in nematodes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5285-5290 (2000).</li>
<li>Nagamatsu, Y., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+the+control+of+body+size+by+a+G-kinase+and+a+downstream+TGFbeta+signal+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for the control of body size by a G-kinase and a downstream TGFbeta signal pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Genes to Cells. 9 (1), 39-47 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à déclarer.

Cet article présente une méthode rapide et efficace pour vérifier les modifications subcellulaire protéique du cytoplasme au noyau. L’expression de la protéine a été montrée par une fusion de GFP, tandis que la structure du noyau a été vérifiée par DAPI coloration (Figure 3). Immunomarquage c. elegans protéines étant difficile, la plupart localisations subcellulaires de la protéine c. elegans sont caractérisées par leur marquage avec des protéines de marqueurs tels que GFP,...

Un changement de localisation subcellulaire des protéines est un mécanisme commun en réponse aux signaux internes ou externes, tels que le stress thermique, famine, stress oxydatif, l’apoptose, la phosphorylation des protéines et d’autres. Par exemple, un stress thermique induit un membre FOXO DAF-16 translocation nucléaire1,2et la protéine BCL-2 pro-apoptotiques que BID translocation vers les mitochondries à mort récepteur signalisation3,4. Il existe plusieurs techniques détecter ces changements. Une combinaison de western blot et biochimiquement isoler des structures subcellulaires (p. ex., les mitochondries ou les noyaux) pourrait bien atteindre l’objectif3. Cependant, elle nécessite un anticorps spécifique contre la protéine d’intérêt. Ainsi, un anticorps bien établi devient la clé de la réussite. Une autre approche consiste à étiqueter les différentes structures subcellulaires ou organites avec des marqueurs différents tels que la protéine de fluorescence verte (GFP), protéine de fluorescence rouge (DP), protéine de fluorescence jaune (YFP) et mCherry et l’étiquette dans le même temps la protéine de intérêt avec les autres marqueurs. Ensuite, les observer sous un microscope confocal de localiser les cibles5,6. Isotopes radioactifs sont une alternative de choix pour l’étiquetage des protéines cibles et détection puis leur localisation subcellulaire7. Toutefois, cette méthode requiert une formation adéquate et la gestion des déchets radioactifs. Dans des circonstances telles que l’absence d’un anticorps spécifique, l’absence d’un bon marqueur, ou le manque d’équipement, comme un microscope confocal, une autre approche doit être examinée. Pour identifier une translocation nucléaire de protéine, il est attirant pour marquer uniquement les protéines cibles avec un marqueur et pour colorer les noyaux avec le réactif chimique 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) puisqu’il suffit d’un microscope à fluorescence ordinaire.
Immunomarquage c. elegans avec des anticorps est un défi en raison de la faible perméabilité de la cuticule de collagène qui entourent l’animal ou la coquille de l’oeuf. Pendant ce temps, étant donné que les protéines de c. elegans sont significativement différentes des leurs orthologues vertébrés, quelques sociétés commerciales fournissent c. elegans avec des produits spécifiques. Il est difficile pour un petit laboratoire à produire des anticorps de c. elegans pour eux-mêmes. Chercheurs dans la communauté utilisent souvent les protéines étiquetées comme marqueurs pour démontrer une expression de localisation ou de gène de protéine. Cet article utilise EXL-1::GFP par exemple pour suivre une translocation nucléaire de protéines sous stress de chaleur8. Une translation intégré exl-1::gfp dans le génome de l’animal sert à stablement expriment le gène de fusion de gfp . Recherche a montré que exl-1 est exprimé dans l’intestin, muscle de la paroi corporelle et autres structures subcellulaires8. Ce protocole montre comment synchroniser vers le quatrième stade larvaire (L4), effectuer une chaleur stress experiment et conduite coloration DAPI, éthanol de fixation, fixation de l’acétone et l’imagerie sous un microscope à fluorescence ordinaire.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Biotium</td><td>40043</td><td>Hoechst 33258 et Hoechst 33342 fonctionnent également bien</td></tr><tr><td>OP50</td><td>CGC</td><td>OP50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Kim Wipe</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td></td><td>tissus mous</td></tr><tr><td>Zeiss&nbsp ; Microscope à fluorescence AX10</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Rel 4.8</td><td>Logiciel de microscope</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MR Rev3</td><td>Caméra numérique</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel</td><td></td><td></td><td></td>de vernis à ongles transparent</tr><tr><td>60 mm Boîtes</td><td></td><td></td><td></td>de Pétri</tr><tr><td>Lames en verre Lamelles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>en</td><td></td><td></td><td></td>verre</tr><tr><td>1-20 & micro ; Pipette</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>20-200 & micro ; Pipette</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>200-1000 & micro ; Pipette</td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>1-200 & micro ; L pointes</td><td></td><td></td><td></td>de pipette</tr><tr><td>200-1000 & micro ; Pointes</td><td></td><td></td><td></td>de pipette L</tr><tr><td>Tubes</td><td></td><td></td><td></td>de microcentrifugation 1,5 mL</tr><tr>Pic <td></td><td></td><td></td>à<td>vis sans fin en platine</td></tr></tbody></table>

détection de protéines localisation subcellulaire par green fluorescence marquage de protéines et 4', 6-diamidino-2-phénylindole coloration chez caenorhabditis elegans

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

Dans ce protocole, une protéine de fusion de protéine (GFP) fluorescence verte et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration sont utilisés pour suivre les changements de localisation subcellulaire de protéine ; en particulier, une translocation nucléaire sous une chaleur stress condition. Les protéines réagissent signaux proportionnellement aux internes et externes. Un mécanisme commun est de changer sa localisation subcellulaire. Cet article décrit un protocole afin de suivre la localisation des protéines qui ne nécessite pas un anticorps, marquage radioactif ou un microscope confocal. Dans cet article, GFP est utilisé pour marquer la protéine cible EXL-1 chez c. elegans, un membre de la famille de protéines (CLICs) intracellulaire canal chlorure, y compris les mammifères CLIC4. Une lignée transgénique intégré translationnelle exl-1::gfp (avec un promoteur et une séquence de gène complet) a été créée par la transformation et le rayonnement γ et stablement exprime le gène et la gfp. Des recherches récentes ont montré que, lors de stress thermique, stress oxydatif pas, EXL-1::GFP s’accumule dans le noyau. Chevauchement avec la structure des noyaux et le DAPI, le signal de GFP signaux confirme les changements de localisation sous-cellulaire EXL-1 sous contrainte. Ce protocole présente deux méthodes différentes de fixation pour la coloration DAPI : fixation de l’éthanol et la fixation de l’acétone. Le protocole de coloration DAPI présenté dans cet article est rapide et efficace et préserve aussi bien le signal de la GFP et les changements de localisation sous-cellulaire des protéines. Cette méthode nécessite seulement un microscope à fluorescence avec Nomarski, un filtre FITC et un filtre DAPI. Il est adapté pour le petit laboratoire, étudiant en Master recherche, recherche étudiant de lycée et classes de biotechnologie.

Les protéines intracellulaires canal chlorure (CLIC) sont des protéines multifonctionnelles qui sont hautement conservées entre espèces12. Beaucoup de recherches montre que les CLICs régulent le stress cellulaire, autophagie, apoptose, carcinogenèse, l’angiogenèse et la réponse immunitaire innée de macrophages dans le système des mammifères13,14,15,<sup class="x...

Ce protocole montre comment suivre une translocation nucléaire de protéines sous la contrainte thermique à l’aide d’une protéine de fusion de protéine (GFP) par fluorescence verte comme un marqueur et 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration. Le DAPI souillant le protocole est rapide et préserve les signaux de localisation sous-cellulaire GFP et de protéines.

Détection de protéines localisation subcellulaire par Green Fluorescence marquage de protéines et 4', 6-Diamidino-2-phénylindole coloration chez Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de C. elegans, comme la biologie cellulaire. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’obtenir simultanément des signaux de coloration nucléaire, de GFP et de changements de localisation subcellulaire. Pour commencer, générez un alignement extrachromosomique avec une construction translationnelle de gènes cibles.Vous pouvez également vous procurer de telles lignées auprès du Centre de génétique Caenorhabditis, qui est une ressource publique pour la recherche sur C. elegans. Ou, d’un laboratoire de recherche précédemment publié. Après avoir exposé les vers aux rayons gamma pour intégrer les lignées extrachromosomiques dans le génome, sélectionnez les lignées exprimées de manière stable afin que chaque animal exprime une protéine marqueur telle qu’une GFP ou un rouleau.Pour éliminer les mutations générées pendant le rayonnement, croisez les lignes au moins deux fois. Utilisez la lignée transgénique résultante pour détecter les changements du profil d’expression des protéines en cas de stress. Ensuite, après avoir préparé des plaques de vers NGM selon le protocole de texte, striez un clone d’O

detecting-protein-subcellular-localization-green-fluorescence-protein

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Une procédure de liquides à base de culture et de la distribution...

Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches

"Freeze-fissuration," une méthode pour exposer les tissus internes du nématode C. elegans aux anticorps pour la localisation des protéines, est démontrée.

Anticorps coloration dans<em&gt; C. Elegans</em&gt; Utilisation de «gel-Cracking&quot;

Pour étudier la relation entre l’homéostasie des protéines, le stress et le vieillissement, nous avons surveillé les changements dans le repliement des protéines en suivant le dysfonctionnement des protéines, la localisation des protéines dans la cellule et la stabilité des protéines aux niveaux de l’organisme, des cellules et des protéines, en utilisant le métazoaire génétiquement traitable Caenorhabditis elegans comme système modèle.

Utilisation de Caenorhabditis elegans comme système modèle pour étudier l’homéostasie des protéines dans un organisme multicellulaire

Le muscle squelettique est essentiel pour la locomotion et est le principal magasin de protéine de corps. mesures de santé musculaire dans C. elegans sont décrits. Changements éventuels à la structure et la fonction musculaire sont évalués à l'aide GFP localisée et colorants cationiques.

Méthodes d'évaluation de Subcellular compartiments de muscle en C. elegans

Le transparent c. elegans intestin peut servir comme une «en vivo tissu chambre » pour l’étude des apicobasal la biogenèse membranaire et lumen au niveau unicellulaire et subcellulaire pendant tubulogenèse multicellulaires. Ce protocole décrit comment combiner un étiquetage standard, perte de fonction génétique/ARNi et approches microscopiques de disséquer ces processus au niveau moléculaire.

Le c. elegans intestin comme un modèle intercellulaires Lumen morphogenèse et In Vivo polarisé la biogenèse membranaire au niveau unicellulaire : marquage par des anticorps, RNAi perte de fonction analyse et imagerie

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un bon modèle pour étudier le transport axonal et intracellulaire. Ici, je décris un protocole in vivo d’enregistrement et d’analyse du transport axonal et de chez c. elegans.

Immobilisation Caenorhabditis elegans , à analyser le Transport intracellulaire dans les neurones

Un protocole d’imagerie des microtubules dynamiques in vivo à l’aide d’une protéine de liaison à l’extrémité sous marquage fluorescent a été présenté. Nous avons décrit les méthodes pour étiqueter, imager et analyser les microtubules dynamiques dans le neurone du microtubule latéral postérieur (PLM) de C. elegans.

In vivo Évaluation de la dynamique et de l’orientation des microtubules dans les neurones de Caenorhabditis elegans

Les microbes intestinaux, y compris les bactéries extracellulaires et les agents pathogènes intracellulaires comme le virus d’Orsay et les microsporidies (champignons), sont souvent associés aux nématodes sauvages Caenorhabditis . Cet article présente un protocole pour détecter et quantifier les microbes qui colonisent et/ou infectent les nématodes C. elegans , et pour mesurer la charge pathogène après des infections contrôlées en laboratoire.

Hybridation in situ par fluorescence d’ARN (FISH) pour visualiser la colonisation microbienne et l’infection dans les intestins de Caenorhabditis elegans

L’article décrit l’optimisation des paramètres d’acquisition de la microscopie à fluorescence pour visualiser le transport axonal de cargaisons endogènes marquées à une résolution de neurone unique chez un nématode vivant.

Optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez Caenorhabditis elegans vivant

Nous fournissons ici des instructions sur l’utilisation efficace de SegElegans, un système d’apprentissage profond que nous avons développé pour la segmentation automatisée de vers individuels dans des images de microscopie à grand champ, pour une utilisation ultérieure dans des logiciels d’analyse d’images tels qu’ImageJ. Nous fournissons des moyens d’utiliser le système à la fois en ligne et hors ligne.

Analyse automatisée d’images de fluorescence de C. elegans à l’aide de SegElegans

Un flux de travail de microinjection CRISPR/Cas9 pour le marquage fluorescent endogène dans la lignée germinale de Caenorhabditis elegans afin d’obtenir des lignées de knock-in homozygotes pour une analyse in vivo de la localisation des protéines.

Marquage endogène fluorescent médié par CRISPR/Cas9 des gènes spécifiques à la lignée germinale chez Caenorhabditis elegans

Découvrez une méthode rapide de marquage GFP et coloration DAPI pour visualiser la translocation nucléaire des protéines sous stress thermique chez Caenorhabditis elegans. Cette technique permet d'observer simultanément le noyau et la localisation subcellulaire.

Détection de protéines localisation subcellulaire par Green Fluorescence marquage de protéines et 4, 6-Diamidino-2-phénylindole coloration chez Caenorhabditis elegans (Vidéo) | JoVE Journal

Détection de protéines localisation subcellulaire par Green Fluorescence marquage de protéines et 4', 6-Diamidino-2-phénylindole coloration chez Caenorhabditis elegans

Explorer plus de vidéos