Name: Imagerie cellulaire de la TGF-β/Smad3 signalisation Pathway In Vitro et In Vivo à l’aide d’un adénovirus journaliste système en direct (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Découvrez l'imagerie cellulaire en direct de la voie de signalisation TGF-β/Smad3 à l'aide d'un système rapporteur adénoviral. Cette méthode permet le suivi non invasif de la signalisation cellulaire en temps réel dans des modèles in vitro et in vivo.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Health and Medical Research Council (NHMRC) à H-JZ. TMBW est récipiendaire de la bourse postdoctorale Australie le gouvernement australien et la bourse de recharge Ann Henderson de Australian Health Rotary en partenaire avec le Rotary de Templestowe et Dine d’un remède.

Toutes les expériences animales ont été approuvés par l’Université de Melbourne Animal Ethics Committee.
Remarque : Le protocole de séquence, de construction et de production pour l’adénovirus vecteurs pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP et pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom ont été décrites précédemment11,12, 13. Tous les vecteurs sont disponibles dans le commerce.
1. virus titre détermination à l’aide de 50 % la Dose infectieuse culture tissulaire (TCID50)
<ol><li>Préparer 1 x 106 cellules HEK293A dans 10 mL de DMEM + 10 % FBS media.</li>
	<li>Les semences 100 µL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture de cellules de 96 puits à fond plat.</li>
	<li>Préparer 1 mL d’une dilution au 1/100 des stocks de virus au milieu complet. Ajouter 11 µL de virus dilué dans chaque puits de la colonne 1.</li>
	<li>Effectuer des dilutions successives 10 fois directement dans la plaque 96 puits en mélangeant 11 µL du virus dilué à 100 µL de suspension cellulaire jusqu'à une dilution finale de 1 x1012 est atteinte. Bien que les cellules sont non adhérents à ce stade, le nombre de cellules transférés entre puits reste constant.</li>
	<li>Distribuer 11 µL de chaque dilution dans chaque colonne commençant par la plus forte dilution de 104. Remplacer les pointes de pipette avec chaque dilution pour limiter reglable de particules virales.</li>
	<li>Ajouter 11 µL des médias sans virus complet dans la colonne 12 comme témoin négatif.</li>
	<li>Incuber les plaques pendant 7 à 10 jours à 37 ° C, avec 10 % de CO2.</li>
	<li>À l’aide d’un microscope, marquer le nombre de puits dans chaque colonne présentant des signes d’effets cytopathogènes ou cytotoxiques. Considérer un bien positif si aucun signe d’infection est présente.</li>
	<li>Calculer la fraction de puits positifs pour chaque dilution à l’aide de la méthode statistique (1938) de Reed et Muench14.</li>
	<li>Calculer la distance proportionnelle (DP) à l’aide : (A-50)/(A-B), où A est la réponse de pourcentage supérieur ou égale à 50 % et B est la réponse de pourcentage inférieure à 50 %.</li>
	<li>Calculate TCID50 using: 10X-PD, where X is the dilution giving a response greater than 50%.</li>
	<li>Calculer le titre viral en faisant ce qui suit : 0,69 / (0,011 x TCID50) UFP/mL</li>
</ol>2. adénovirus MOI détermination
<ol><li>Semences 1,0-1,5 x 10 cellules MDA-MB-231 du5 avec 500 μl de milieux de culture DMEM contenant 5 % FBS dans chaque puits d’un 12 plaque bien (confluence de la cellule de 35 %, 6 puits au total).</li>
	<li>Calculer les volumes de stock Ad-CMV-Td-Tom requis pour 0, 250, 500, 2500 et 5000 MOI en utilisant la suite formule : MOI = (volume [μL] x PFU/μL) / nombre de cellules. Pour Ad-CMV-Td-Tom avec un titre de 1 x 1010 (UFP/mL), les volumes de viroses MOIs requis sont respectivement de 0, 3.75, 7.5, 37,5 et 75 μL.</li>
	<li>Infectent les cellules avec les volumes calculés de Ad-CMV-Td-Tom à la Section 2.2 de pipetage directement stock virale dans les puits avec mélange intime.</li>
	<li>Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Retirez le support des puits et fixer immédiatement les cellules avec 500 μL de formol 10 % pendant 5 min.</li>
	<li>Aspirer le formol des puits et laver une fois les puits avec 500 μl de PBS.</li>
	<li>Détachant le noyau de la cellule avec 500 μl de solution de Hoechst pendant 5 min.</li>
	<li>Enlever la solution de Hoechst et laver les puits avec 500 μl de PBS 3 fois.</li>
	<li>Image la protéine Td-tomate et noyau cellulaire signal en utilisant un grossissement de 200 X sur un microscope à fluorescence. Exciter la protéine Td-tomate à 554 nm et la teinture de Hoechst à 352 nm.</li>
	<li>Analyser les images à l’aide de ImageJ pour déterminer le travail que moi requis pour 100 % d’infection de Td-tomate15.</li>
</ol>3. double-adénovirus Transduction dans des cellules vivantes unique
<ol><li>Semences 1,0-1,5 x 10 cellules MDA-MB-231 du5 avec 500 μl de milieux de culture DMEM contenant 5 % FBS dans chaque puits d’un 12 plaque bien (confluence de la cellule de 35 %, 2 puits au total).</li>
	<li>Infecter les cellules avec 75 μl de Ad-CMV-GFP (titre = 5 x 109 UFP/mL) et 7,5 μL de Ad-CAGA12-Td-Tom (titre = 5 x 1010 UFP/mL) afin d’obtenir un MOI 2 500, qui peut atteindre 100 % positivité de l’infection.</li>
	<li>Traiter les cellules avec ou sans 0,25 μL de TGF-β par puits (10 mg/mL en stock, 5 ng/μL comme la concentration finale) immédiatement après l’infection à adénovirus.</li>
	<li>Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Image des cellules vivantes présentant microscope à fluorescence contraste de phase. Exciter la GFP à 470 nm et protéine de Td-tomate à 554 nm.</li>
	<li>Difficulté des cellules et tacher le noyau de la cellule comme décrit dans les étapes 1,6 - 1,9.</li>
	<li>Image la protéine Td-tomate et Hoechst tachent à l’aide d’un microscope à fluorescence. Exciter le colorant Hoechst à 352 nm.</li>
	<li>À l’aide de ImageJ, calculer que le pourcentage de GFP et Td-tomate positif cellules15.</li>
</ol>4. vivre seule cellule signalisation en cicatrisation Assay
<ol><li>Semences de 4-5 x 10 cellules MDA-MB-231 du5 avec 1 mL de milieux de culture DMEM contenant 5 % FBS dans chaque puits d’un 6 bien sur plaque (confluence cellulaire de 50 %, 2 puits au total).</li>
	<li>Infectent les cellules avec 22,5 μL de Ad-CAGA12-Td-Tom (titre = 5 x 1010 UFP/mL, MOI = 2 500).</li>
	<li>Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Scratch deux lignes croisées sur la couche de cellules de chaque puits à l’aide d’une pointe de pipette P200.</li>
	<li>Supprimer les anciens médias de puits et remplacez par 2 mL de frais 5 % médias FBS avec ou sans 0,5 μL de TGF-β par puits (10 mg/mL en stock, 5 ng/μL comme concentration finale).</li>
	<li>Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 5 min et prendre des photos des zones sélectionnées plaie grossissement 100 X sur un microscope à contraste de phase.</li>
	<li>Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Prendre des photos de la fermeture de la plaie dans les mêmes secteurs qu’avant.</li>
	<li>Fixer les cellules, tacher le noyau de la cellule comme décrit dans les étapes 1,6 - 1,9 et visualiser les signaux Td-tomate dans la région de la plaie et la zone non enroulés en utilisant un grossissement de 200 X sur un microscope à fluorescence.</li>
	<li>Quantifier le pourcentage de cellules positives Td-tomate dans la plaie et la zone non-plaie à l’aide de logiciels ImageJ15.</li>
</ol>5. in Vitro de luciferase
<ol><li>Préparer une suspension de cellules de 3-5 x 10 cellules MDA-MB-231 du4 dans 1 mL de milieu DMEM contenant du 5 % FBS.</li>
	<li>Infecter de suspension cellulaire avec 2,5 μl de Ad-CAGA12- Luc (titre = 5 x 1010 UFP/mL, MOI = 2 500).</li>
	<li>Graines les cellules infectées dans un 96 plaque bien à 3 000 cellules/100 µL/puits.</li>
	<li>Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Supprimez les anciens médias provenant de puits et remplacez-les par 100 µL de supports FBS 5 % neufs avec ou sans 0,1 μL de TGF-β par puits (1 mg/mL en stock, 1 ng/μL comme la concentration finale) et en présence ou en absence de 0,17 μL d’inhibiteur de TGF-β par puits (7 mg/mL en stock 12 ng/μL comme concentration finale) (une protéine nouvelle de piège ligand de TGF-β, Chen et al., œuvre inédite).</li>
	<li>Placer la plaque dans l’incubateur à 37 ° C, avec 10 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Dégeler le substrat de système de dosage de luciférase et préparer le 1 x cell culture lyse réactif à l’eau bidistillée (DDW).</li>
	<li>Retirez le support des 96 puits et lyse puits avec 50 μL 1 x cell culture de tampon de lyse sur glace à l’aide d’un agitateur orbital avec une agitation modérée pendant 30 min.</li>
	<li>Transférer 30 μL de lysat de chaque puits dans une plaque opaque luciférase et laissez la plaque à température ambiante.</li>
	<li>Sur le logiciel luminomètre, créez un nouveau protocole. Sélectionnez pour 1 injecteur avec les mesures avant et après l’injection. Fixer des mesures avant l’injection à 1 s pour retard dans la mesure et Temps d’intégration. Pour après la mesure de l’injection, réglez le Volume d’Injection à 40 µL avec un retard dans la mesure de 1 s après injection et 5 s Temps d’intégration. Confirmez les paramètres en sélectionnant OK.</li>
	<li>Placer le tube d’injecteur dans DDW, puis cliquez sur le bouton 1 injecteur sous les paramètres du premier pour nettoyer le tube injecteur avant utilisation. Ensuite, retirez le tube injecteur de la DDW et le déposer dans l’air, suivi par deux autres nombres premiers d’injecteur 1 afin d’éliminer toute la solution du tube. Placer le tube d’injecteur dans le substrat de Firefly et de nouveau premier deux fois pour préparer le substrat.</li>
	<li>Placer la plaque de la luciférase opaque avec les échantillons dans le luminomètre et sélectionnez Options du logiciel. Sélectionnez les puits d’intérêt, puis cliquez sur appliquer. Appuyez sur Start pour mesurer le signal de la luciférase.</li>
	<li>Une fois que les mesures sont terminées, retirer et rincer la plaque avec de l’eau. Récupérer n’importe quel substrat restant dans le tube injecteur en plaçant le tube dans l’air et premier injecteur 1 dans tube de substrat de firefly. Placer le tube d’injecteur dans DDW et effectuer deux autres nombres premiers pour nettoyer le tube injecteur de n’importe quel substrat restant.</li>
</ol>6. cellule préparation pour Live signalisation imagerie In Vivo
<ol><li>48 h avant l’implantation de la tumeur, graines 2-3 x 106 MDA-MB-231 cellules dans des fioles de2 175 cm (10 flacons au total). La culture de cellules dans 20 mL de milieu DMEM contenant du 5 % FBS à 37 ° C, 10 % CO2.</li>
	<li>24 h plus tard, ajouter 300 μL de Ad-CAGA12- Luc (titre = 5 x 1010 UFP/mL, MOI = 2 500) dans chaque fiole. Maintenir les cellules en culture pendant un autre 24 h.</li>
	<li>Le jour suivant l’implantation, supprimer les anciens médias et laver les cellules adénovirus infecté une fois avec 20 mL de PBS, pH 7,4. Ajouter 2 mL de 0.05 % trypsine-EDTA dans la fiole et agiter le flacon légèrement pour permettre à la trypsine couvrir toute la surface du ballon. Placer la fiole dans l’incubateur à 37 ° C, 10 % CO2 pendant 3 min.</li>
	<li>Étancher la trypsine en ajoutant 8 mL de médias DMEM contenant du FBS dans les fioles. Transférer toutes les cellules en suspension dans un flacon de verre doseur.</li>
	<li>Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre et transfert de 4,8 x 107 cellules dans deux tubes à centrifuger 50 ml.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 400 x g pendant 5 min à RT pour enlever la trypsine et remettre en suspension les cellules en 720 mL de supports FBS-DMEM neufs.</li>
	<li>Transférer les suspensions de cellules dans un tube stérile 5 mL et ajouter 160 μL Matrigel (suspension à 10 % total matrigel).</li>
	<li>Conservez les cellules sur la glace jusqu'à l’implantation.</li>
</ol>7. l’Implantation orthotopique
<ol><li>Pèse 12 souris SCID et allouer au hasard des souris en groupes de contrôle et de traitement (6 souris/groupe).</li>
	<li>Effectuer l’implantation dans une bio-armoire stérile pour maintenir un environnement stérile. Anesthésier la souris l’isoflurane de 2,5 à 4,5 % avec un débit d’oxygène de 1 L/min. Placer la souris sur une bouillote et déposer une goutte de lubrification onguent sur les deux yeux pour éviter des lésions cornéennes. Difficulté la souris à la bouillote en position couchée, tandis que le maintien d’anesthésie en plaçant le museau dans un cône de nez connecté à l’isoflurane.</li>
	<li>Confirmer le succès de l’anesthésie par l’absence de réaction à l’orteil pincée. Réduire l’isoflurane à une dose d’entretien de 1,5 à 2,5 % avec 1 L/min d’oxygène pour le rappel de l’implantation.</li>
	<li>Nettoyez la peau de la quatrième d’échappement des deux côtés de la ligne médiane avec le tampon de coton trempé dans de l’éthanol à 80 %.</li>
	<li>Trouver les 4 coussinets adipeux mammaireth par palpation et presser la grosse garniture pour exposer davantage les tissus.</li>
	<li>La composition de la suspension cellulaire bien de pipetage de haut en bas. Doucement aspirer 50 µL du mélange de cellule dans une seringue à insuline 27G et injecter dans les coussinets adipeux mammaire sur les deux côtés de la souris.</li>
	<li>Confirmer une injection réussie par la sensation de gonflement de la garniture. Débloquez les coussinets adipeux doucement et mettez la souris revenir dans la cage.</li>
	<li>Laissez les cages sur le coussin chauffant pendant au moins 30 minutes permettre aux souris prendre conscience et puis replacez les cages dans la salle de détention pendant 3 jours.</li>
</ol>8. IVIS imagerie
<ol><li>Ouvrez le logiciel Living Image .</li>
	<li>Initialiser le système IVIS en cliquant sur le bouton Initialiser IVIS système du panneau de commande. Attendez que le signe de température s’allume en vert.</li>
	<li>Sélectionnez le Mode d’imagerie Luminescent sur le panneau de configuration.</li>
	<li>Allumez anesthésie isoflurane à la chambre et le système IVIS.</li>
	<li>Anesthésier les souris à l’aide de 2,5 à 4,5 % isoflurane avec 1 L/min d’oxygène. Une fois anesthésié, fixé isoflurane à 1,5 à 2,5 % pour l’entretien. Injecter 150 mg/kg de poids corporel de D-luciférine souris par injection intrapéritonéale (i.p.).</li>
	<li>Transférer immédiatement la souris dans le système IVIS, placez-les sur la plate-forme d’imagerie à température contrôlée et mettre leur nez dans le cône de nez.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton de la Séquence d’installation sur le panneau de configuration, puis sélectionnez Moyen Binning.</li>
	<li>Mettre en place le temps d’exposition d’imagerie comme suit : 10 s, 20 s, 30 s, 60 s et 120 s. début d’imagerie environ 3 min après l’injection de la luciférine et continuent de l’image jusqu'à ce que le signal commence à baisser (normalement, cela prendra environ 20 min).</li>
	<li>Retirer les souris de IVIS tout en conservant l’anesthésie isoflurane grâce à un cône de nez et de traiter les souris avec 50 µL PBS ou 50µl inhibiteur signalisation de TGF-β (50 μg/tumeur) par injection intra-tumeur.</li>
	<li>Remettre les souris dans la cage et les laisser sur la bouillote pendant au moins 30 min. Puis placez la cage dans la salle de détention.</li>
	<li>Répétez IVIS imagerie procédure comme décrit plus haut le jour qui suit le traitement.</li>
</ol>9. analyse des données
<ol><li>Ouvrir les fichiers enregistré dans le logiciel Living Image .</li>
	<li>Retrouvez les informations de l’image à l’aide de vue | Informations d’image.</li>
	<li>Sélectionnez les photos prises à un moment similaire avec le même temps d’exposition. Charger des photos en tant que groupe.</li>
	<li>Décochez la case individuelle dans l' Ajustement d’Image pour normaliser l’intensité.</li>
	<li>Sélectionnez le mode Photon pour analyser l’intensité. Quantifier l’intensité du signal en sélectionnant le bouton de la Région d’intérêt (ROI) dans les Outils de ROI.</li>
	<li>Faites glisser le cercle ROI pour la région contenant le signal de bioluminescent et cliquez sur le bouton de mesure pour acquérir l’intensité du signal.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs ne rapportent aucun conflit d’intérêt.

Nous avons développé une technique permettant l’imagerie en temps réel de la signalisation TGF-β/Smad3 dans des cellules vivantes unique. En utilisant cette nouvelle méthode, nous avons déjà identifié une sous-population de cellules avec la dynamique activité transcriptionnelle de TGF-β/Smad3 associée à l’invasion améliorée et migration8. Cette méthode améliore sur les dosages traditionnels pour la signalisation TGF-β, tels que les transferts de western de la phosphorylation Smad3 et TGF-β a ciblé...

Facteur de croissance transformant β (TGF-β) est une cytokine essentiel impliqué dans le développement humain qui signale par un hétérodimère complexe composé de type II et récepteurs1de type I. Liaison au récepteur II de type résultats dans le recrutement et la phosphorylation de type I du récepteur, qui phosphoryle à son tour en aval Smad2/3 protéines2,3. Ces activé Smad2/3 protéines lié à Smad4, formant un complexe translocation dans le noyau, qui régule la transcription de gène4. Dans des conditions homéostatiques TGF-β/Smad signalisation est étroitement contrôlée ; Toutefois, dans de nombreuses maladies, la voie de signalisation est déréglementée et souvent surexprimé conduisant à la progression de la maladie5,6,7. Des études récentes ont démontré que la réponse cellulaire au TGF-β est hétérogène et sous-populations de cellules actives de TGF-β/Smad sont responsables de la fonction biologique dans une fonction du temps8,9. Commune analyse cellulaire de la signalisation TGF-β/Smad implique l’utilisation de tests de point de terminaison fixe qui fournissent seulement un instantané de l’activité cellulaire et souvent de doser la moyenne TGF-β/Smad effet10. Cependant, ces méthodes, ne représentent pas exactement les comportements moléculaires du TGF-β/Smad signalisation dans l’état physiologique au cours de la progression de la maladie. Analyse de cellules vivantes sur image capture la dynamique des processus biologiques et cellulaires, avec une compréhension à la fois spatiale et temporelle.
Notre objectif était de développer une méthode sensible de haut débit pour l’imagerie de cellules vivantes du TGF-β/Smad de signalisation à l’aide de réactifs à base d’adénovirus. Ici, nous avons infecté la lignée de cellules cancéreuses du sein humain MDA-MB-231 avec un adénovirus qui exprime l’ordre de liaison Smad3 CAGA motif et une luciférase (Luc) ou le gène rapporteur Td-tomate (Td-Tom). Systèmes de journaliste adénoviraux fournissent une méthode rapide et bon marchée pour l’introduction de plasmide qui peut entraîner un taux de 100 % d’infection en lignées de cellules cancéreuses. Systèmes viraux journaliste ont également été appliquées avec succès aux lignées de cellules qui sont difficiles à transfecter avec plasmide classique11. Dans ce protocole, nous allons décrire un processus reproductible et non invasif pour parvenir à l’imagerie de cellules vivantes de la voie de signalisation de TGFβ/Smad fois in vivo et in vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>1881024</td><td>Warm en 37 &deg ; C Bain d’eau avant utilisation</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Scientifix Life</td><td>FBS500-S</td><td>Chaleur inactivée avant utilisation</td></tr><tr><td>Recombinant Humain TGF-&beta ; 1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21</td><td>Aliquote dans DDW pour obtenir une concentration finale à 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5117</td><td>Diluer dans du PBS pour obtenir une concentration finale à 1 &mu ; L/mL</td></tr><tr><td>Luciferase Reporter Kit de dosage</td><td>Promega</td><td>197897</td><td>Diluer 5x dans du PBS avant utilisation</td></tr><tr><td>Luminomètre</td><td>Promega</td><td>9100-002</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie à fluorescence à contraste de phase</td><td>OLYMPUS</td><td>IX50</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>VivoGl Luciferin</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III In Vivo Système d’imagerie</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % Trypsine-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Diltue à 0,05 % (1x) dans PBS</td></tr><tr><td>Culture cellulaire Lyse 5x Réactif</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Dilué à 1x dans DDW</td></tr><tr><td>10 % Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293A</td><td>ThermoFisher</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>PRKDC-SCID</td><td>Centre de ressources animales</td><td>SCIDF6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Zoetis</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Chem-supply</td><td>EA043-10L-P</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Night Time</td><td>Allergan</td><td>1750D</td><td>Pommade oculaire lubrifiante</td></tr><tr><td><fort>Solution</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Composition</forte></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4.2H2O (4 mM) ; NaHPO4 (16 mM) ; NaCl (0,12 M)</td></tr><tr><td>FBS-DMEM&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>5 % de chaleur inactivée FBS ; 10 &mu ; g/mL de pénicilline ; 100 &mu ; g/mL de streptomycine</td></tr></tbody></table>

imagerie cellulaire de la tgf-β/smad3 signalisation pathway in vitro et in vivo à l’aide d’un adénovirus journaliste système en direct

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Transforming Growth Factor β (TGF-β) signalisation réglemente plusieurs fonctions importantes requises pour l’homéostasie cellulaire et se trouve souvent surexprimé dans de nombreuses maladies, y compris le cancer. TGF-β est fortement impliqué dans les métastases au cours de la progression tardive stade du cancer, activant un sous-ensemble de cellules tumorales migrateurs et envahissantes. Les méthodes actuelles d’analyse de la voie de signalisation se concentrent sur des modèles de point de terminaison, qui souvent tentent de mesurer la signalisation post-hoc de l’événement biologique et ne reflètent pas la nature progressive de la maladie. Ici, nous démontrons un adénovirus roman journaliste système spécifique pour la voie de signalisation TGF-β/Smad3 pouvant détecter l’activation de la transcription dans des cellules vivantes. Utilisant un journaliste Ad-CAGA12-Td-Tom , nous pouvons atteindre un taux de 100 % d’infection des cellules MDA-MB-231 dans 24h in vitro. L’utilisation d’un reporter fluorescent permet pour l’imagerie de cellules vivantes d’unique en temps réel avec une identification directe des cellules transcriptionnellement actives. La stimulation des cellules infectées avec le TGF-β affiche uniquement un sous-ensemble de cellules qui sont transcriptionnellement actif et impliqué dans des fonctions biologiques spécifiques. Cette approche permet de grande spécificité et sensibilité à un niveau de cellule unique pour favoriser la compréhension des fonctions biologiques associés à TGF-β signalisation in vitro. Smad3 activité transcriptionnelle peut également être signalés en vivo en temps réel par le biais de l’application d’une Ad-CAGA12- Luc journaliste. Ad-CAGA12- Luc peut être mesurée de la même manière que les lignées traditionnelles luciférase stablement transfectées. Smad3 activité transcriptionnelle de cellules implantées dans vivo peut être analysée par le biais de l’imagerie conventionnelle IVIS et suivie direct au cours de la progression tumorale, donnant un aperçu unique sur la dynamique de la voie de signalisation TGF-β. Notre protocole décrit un système de livraison de journaliste avantageuse permettant l’imagerie haut débit rapide des voies de signalisation de cellules vivantes in vitro et in vivo. Cette méthode peut être étendue à un éventail de tests image basée et présente une approche sensible et reproductible pour biologie fondamentale et développement thérapeutique.

Vivre seule cellule imagerie in vitro
Pour évaluer avec précision l’activation de la signalisation TGF-β/Smad dans des cellules individuelles à l’aide de réactifs d’adénovirus basé, il est important de déterminer d’abord la multiplicité d’Infection (MOI) optimale pour chaque lignée cellulaire. Ministère de l’intérieur optimale est déterminée lorsque 100 % des cellules sont positifs pour l’infection adénovirale sans effets ...

Nous présentons ici un protocole pour l’imagerie de cellules vivantes d’activité signalisation TGF-β/Smad3 utilisant un système de reporter des adénovirus. Ce système suit l’activité transcriptionnelle en temps réel et peut être appliqué à ces deux cellules isolées in vitro et dans l’animal vivantmodèles.

Imagerie cellulaire de la TGF-β/Smad3 signalisation Pathway In Vitro et In Vivo à l’aide d’un adénovirus journaliste système en direct

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la signalisation cellulaire en suivant de manière non invasive la signalisation cellulaire en temps réel. Le principal avantage de cette technique est que les systèmes d’adénovirus offrent une méthode rapide et facile de détection de la signalisation cellulaire qui peut atteindre un taux d’infection de 100 % dans les lignées cellulaires cancéreuses. Les implications de cette technique s’étendent au développement thérapeutique des cancers et peuvent être étendues à d’autres voies de signalisation.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des modèles de cancer du sein, elle peut également être appliquée à d’autres types de cancer, tels que le cerveau, les os et le poumon. Le jour de l’infection à adénovirus, ensemencez les puits d’une plaque de 12 puits avec environ 1,25 fois 10 à la cinquième cellule MDA-MB-231 dans 500 microlitres de milieu pour une confluence de 35 %Infectez les cellules dans tous les puits avec 75 microlitres d’adénovirus-CMV-GFP et 7,5 microlitres d’adénovirus CAGA12-Td-Tomato pour obtenir un MOI de 2 500 qui peut atteindre une positivité d’infection de 100 %. Ensuite, ajoutez du TGF-bêta au traitement bien après l’infection à adénovirus.Incuber à 37 degrés Celsius avec 10 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Le lendemain, imagez des cellules vivantes à l’aide d’un microscope à fluorescence à contraste de phase. Ensuite, après avoir fixé les cellules et coloré les noyaux avec un colorant Hoechst, imagez la protéine TD-Tomato et la coloration Hoechst à l’aide d’un microscope à fluorescence.Après avoir imagé tous les puits, calculez le pourcentage de cellules GFP et Td-Tomato positives à l’aide d’ImageJ. Pour le test de cicatrisation des plaies, commencez par ensemencer les puits d’une plaque à six puits avec environ 4,5 fois 10 à la cinquième cellule MDA-MB-231 dans un millilitre de milieu pour une confluence de 50 % le jour de l’infection. Infectez les cellules avec 22,5 microlitres d’adénovirus CAGA12-Td-Tomato, puis placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 10 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.Après 24 heures, utilisez une pointe de pipette P200 pour gratter deux lignes croisées sur la couche cellulaire de chaque puits. Retirez le milieu des puits et traitez-le avec du TGF-bêta comme indiqué précédemment, puis placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec 10 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes. Après cinq minutes d’incubation, prenez des images des zones de plaie sélectionnées à l’aide d’un grossissement de 100X sur un microscope à contraste de phase avant de remettre la plaque dans l’incubateur.24 heures plus tard, prenez des images en contraste de phase des mêmes zones pour évaluer la fermeture de la plaie. Après avoir fixé les cellules et coloré les noyaux, visualisez le signal Td-Tomato dans la zone de la plaie et la zone non plaie à l’aide d’un grossissement de 200X sur un microscope à fluorescence. 48 heures avant l’implantation de la tumeur, ensemencez environ 2,5 fois 10 à la sixième cellule MDA-MB-231 dans 10 flacons de 175 centimètres carrés.Après 24 heures de culture, ajoutez 300 microlitres d’adénovirus CAGA12-luciférase dans chaque flacon avant de remettre les cellules dans l’incubateur pendant 24 heures supplémentaires. Le jour de l’implantation, retirez l’ancien milieu et lavez une fois les cellules infectées par l’adénovirus avec 20 millilitres de PBS. Ajoutez deux millilitres de trypsine-EDTA à 0,05 % dans le ballon et agitez légèrement le ballon pour permettre à la trypsine de couvrir toute la surface du ballon.Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois minutes, puis tremper la trypsine en ajoutant huit millilitres de milieu DMEM contenant du FBS dans les flacons. Transférez toutes les suspensions cellulaires dans une bouteille de réactif en verre. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.Après cela, transférez 4,8 fois 10 dans les sept cellules dans des tubes à centrifuger de 250 millilitres et centrifugez les cellules à 400 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, remettre les cellules en suspension dans 720 microlitres de milieu frais et transférer la suspension dans un tube de cinq millilitres. Ajoutez ensuite un milieu contenant 10 % de Matrigel pour diluer la suspension cellulaire à trois fois 10 à la sixième cellules par 50 microlitres.Transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile de cinq millilitres et maintenez-la sur de la glace jusqu’à l’implantation. Pesez 12 souris SCID et répartissez-les au hasard de manière égale entre les groupes témoins et les groupes de traitement. Après avoir anesthésié la souris, versez une goutte de pommade oculaire lubrifiante sur les deux yeux pour éviter d’endommager la cornée, puis fixez la souris à un coussin chauffant dans une bio-armoire stérile et maintenez l’anesthésie en plaçant le museau dans un cône de nez relié à l’isoflurane.Confirmer le succès de l’anesthésie par l’absence de réaction à un pincement de l’orteil. Réduire l’isoflurane à une dose d’entretien pour le reste de l’implantation. Ensuite, utilisez un coton-tige trempé dans de l’éthanol à 80 % pour nettoyer la peau de chaque mamelon sur quatre jusqu’à la ligne médiane.Trouvez le quatrième coussinet adipeux mammaire par palpation et pressez le coussinet adipeux pour exposer davantage le tissu, puis mélangez la suspension cellulaire en pipetant de haut en bas. Aspirez doucement 50 microlitres de mélange cellulaire dans une seringue à insuline de calibre 27 et injectez-le dans le coussinet adipeux mammaire. Confirmez que l’injection a réussi et relâchez doucement le coussinet adipeux.Remettez la souris dans la cage de la maison. Une fois que les souris ont repris conscience, retournez la cage dans la salle de détention pendant trois jours avant de procéder à l’imagerie IVIS. Les cellules MDA-MB-231 vivantes présentaient des niveaux variables d’expression de Td-Tomato malgré une infection à 100 %, comme le montre l’expression de la GFP, ce qui indique une activation hétérogène de la transcription de Smad3 dépendante du TGF-bêta entre les cellules.L’analyse des cellules fixes a de nouveau montré une expression de 100 % de la GFP, tandis que seulement environ 26 % des cellules présentaient une activité transcriptionnelle détectable du TGF-bêta/Smad3 24 heures après la stimulation du TGF-bêta sans TGF-bêta par rapport au traitement à 0 % de positivité. Dans le test de cicatrisation, les cellules MDA-MB-231 infectées par l’adénovirus CAGA12-Td-Tomato ont présenté un comportement de migration normal et les cellules traitées avec le TGF-bêta ont montré une meilleure fermeture de la plaie. Notamment, environ 62 % des cellules de la zone de la plaie présentaient une activité transcriptionnelle Smad3 dépendante du TGF-bêta, ce qui est significativement plus élevé que celui observé dans la zone non blessée après un traitement au TGF-bêta.Le réactif adénovirus CAGA12-luciférase a été testé dans un modèle animal d’implantation orthotopique de tumeur mammaire. Les groupes témoins et traités par inhibiteur du bêta-TGF ont présenté une activité rapporteure similaire de la caga12-luciférase avant le traitement. Cependant, pour le groupe témoin, le signal de la luciférase n’a pas changé après le traitement par PBS, tandis que les souris traitées avec l’inhibiteur du TGF-bêta ont montré une réduction du signal d’environ trois fois.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d’une heure si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que des volumes excessivement élevés d’adénovirus peuvent avoir des effets cytotoxiques et cytopathiques qui peuvent affecter la précision de vos résultats. À la suite de cette procédure, ce système peut être étendu pour analyser simultanément plusieurs voies de signalisation afin de répondre à des questions supplémentaires liées à la diaphonie de la signalisation cellulaire.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la signalisation des cellules cancéreuses pour explorer le comportement de progression tumorale dans des modèles de cancer du sein.

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Imagerie cellulaire de la TGF-β/Smad3 signalisation Pathway In Vitro et In Vivo à l’aide d’un adénovirus journaliste système en direct (Vidéo) | JoVE Journal

Imagerie cellulaire de la TGF-β/Smad3 signalisation Pathway In Vitro et In Vivo à l’aide d’un adénovirus journaliste système en direct

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