Name: Caractérisation de la Rupture des membranes de Plasma induite par le MLKL en Necroptosis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Découvrez la caractérisation de la rupture membranaire plasmique induite par MLKL en nécroptose. Ces méthodes combinent microscopie en cellules vivantes et spectroscopie RMN pour étudier les mécanismes de mort cellulaire.

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<ol><li>Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+development%2C+inflammation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in development, inflammation and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).</li>
<li>Kaiser, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP3+mediates+the+embryonic+lethality+of+caspase-8-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice.</a> Nature. 471 (7338), 368-372 (2011).</li>
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<li>Dondelinger, Y., Hulpiau, P., Saeys, Y., Bertrand, M. J. M., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+perspective+on+the+necroptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An evolutionary perspective on the necroptotic pathway.</a> Trends in Cell Biology. 26 (10), 721-732 (2016).</li>
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<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+MLKL+causes+necrotic+membrane+disruption+upon+phosphorylation+by+RIP3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein MLKL causes necrotic membrane disruption upon phosphorylation by RIP3.</a> Molecular Cell. 54 (1), 133-146 (2014).</li>
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<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+to+plasma+membrane+leads+to+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death.</a> Cell Research. 24 (1), 105-121 (2014).</li>
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<li>Rickard, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+regulates+RIPK3-MLKL-driven+systemic+inflammation+and+emergency+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis.</a> Cell. 157 (5), 1175-1188 (2014).</li>
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<li>Malkani, N., Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+secrets+of+fluorescent+proteins%3A+distinct+bleaching+in+various+mounting+fluids+and+photoactivation+of+cyan+fluorescent+proteins+at+YFP-excitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation.</a> PLoS One. 6 (4), 18586(2011).</li>
<li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+workflow+for+the+automatic+segmentation+of+organelles+in+electron+microscopy+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).</li>
<li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+aspartate%2C+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).</li>
<li>Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((15N+and+13C-+SOFAST-HMQC+editing+enhances+3D-NOESY+sensitivity+in+highly+deuterated%2C+selectively+%5B1H%2C13C%5D-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).</li>
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<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+sequence+determinants+control+human+and+mouse+receptor+interacting+protein+3+%28RIP3%29+and+mixed+lineage+kinase+domain-like+%28MLKL%29+interaction+in+necroptotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).</li>
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</ol>

Nous fournissons des protocoles pour les techniques que nous avons combiné impliqué MLKL comme le bourreau présumé de rupture de la membrane plasmique24. En plus de déchiffrer le réseau de régulation qui régule induite par le MLKL necroptosis, ces techniques peuvent servir indépendamment pour caractériser d’autres systèmes biologiques adaptés. Concrètement, ces techniques sont des outils de découverte du milieu à faible débit.
Régulièrement, nous avons utilisé une image...

Identifier les composantes génétiques de necroptosis a facilité l’utilisation de modèles animaux pour tester l’implication des necroptosis dans la physiologie et les maladies1,2,3,4,5. Ko de RIPK3 ou MLKL chez les souris avait une implication minimale dans l’homéostasie développement et adulte, ce qui laisse supposer que necroptosis n’est pas essentiel pour la vie3,6. En outre, certaines espèces ne contiennent pas de gènes soit RIPK3 soit MLKL, appuyant le rôle de non essentiels des necroptosis animaux7,8. En revanche, contester les modèles animaux Knock-Out avec diverses pathologies induites dans le laboratoire a révélé un important rôle de necroptosis dans l’inflammation, l’immunité innée et infection virale9,10, 11 , 12.
Necroptosis peut être activé de plusieurs façons par la signalisation au moyen de capteurs de l’immunité innée différents, tous de qui se traduisent par l’activation de RIPK31,13,14. RIPK3 active à son tour phosphoryle et active MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Le plus étudié, et peut-être la manière plus complexe, conduisant à l’activation de RIPK3 implique mort récepteur ligature, qui bifurque basée sur la composition en aval des complexes de signalisation soit induire l’apoptose ou necroptosis1. Il s’ensuit des Necroptosis lorsque la signalisation par le biais de RIPK1 est favorisée et se traduit par l’engagement de RIPK319,20. Ce résultat est facilement favorisé lors de l’inhibition pharmacologique ou délétion génétique de la caspase 8, un inhibiteur endogène putatif de necroptosis qui garde necroptosis à la baie. RIPK1 lie et active RIPK3. Une autre façon d’activer necroptosis est par le biais de récepteurs Toll-like TLR3/TLR4 signalisation, qui s’engage et RIPK3 se déclenche grâce à TIR-domaine-contenant adaptateur induisant l’interféron β (FTBC)21. Encore une autre façon de mourir par necroptosis est par l’activation de la sonde ADN DAI, qui directement se livre et active RIPK322.
MLKL est une protéine cytosolique composée un domaine N-terminal de bundle (NB) hélice et un domaine de pseudokinase C-terminal (psKD) reliés par un renfort réglementaire région3. Dans les cellules normales, les MLKL se trouve dans le cytosol où il est censé être dans un complexe inactif avec RIPK314. L’activation de necroptosis déclenche la phosphorylation de RIPK3 de MLKL dans la boucle d’activation de la psKD et potentiellement d’autres sites dans le NB et orthèse3,15,23. La phosphorylation induit un changement conformationnel dans MLKL qui se traduit par une dissociation du RIPK314. Mal comprise des changements conformationnels libèrent l’accolade du psKD24. L’orthèse, qui contient 2 hélices, négocie l’oligomérisation de MLKL dans un trimère putatif à travers le d’hélice C-terminale25. L’hélice N-terminale de l’orthèse inhibe le domaine NB, qui est essentiel pour membrane perméabilisation24,26. Isolément, domaine NB est suffisante pour induire la perméabilisation de la membrane plasmique et necroptosis16,24,27. L’activité de pro-necroptotic de NB a été reconstituée dans les fibroblastes embryonnaires de souris déficientes en MLKL (mlkl- / - MEFs). NB est un domaine de liaison du lipide qui engage préférentiellement le diphosphate de phosphatidylinositol 4, 5 de phospholipides (PIP2). Nous avons proposé un mécanisme par étapes d’activation de MLKL, dans lequel oligomérisation orthèse facilite le recrutement de MLKL à la membrane plasmique via les interactions faibles du NB avec le PIP2 groupes polaires24. Au niveau de la membrane, le NB subit une exposition réglementée d’un site de liaison de haute affinité supplémentaires pour PIP2, qui est masqué par l’orthèse en MLKL inactif. Dans l’ensemble, les interactions multiples du NB avec PIP2 déstabilisent la membrane plasmique, conduisant à sa rupture, bien que le mécanisme moléculaire de ces événements n’ont pas été élucidés.
Ici, nous illustrons les méthodes spécifiques utilisées pour caractériser la fonction de MLKL comme bourreau de necroptosis24. En particulier, nous nous concentrons sur le domaine plus minime de MLKL, le NB et l’accolade (BNB), qui est réglementé par l’inhibition de l’orthèse et peut être activé par le biais de dimérisation forcée pour induire la necroptosis et la rupture de la membrane plasmique. Nous décrivons notre système d’expression inductible combiné avec forcée dimérisation FKBP-mediated médicamenteuse à l’imagerie de cellules vivantes et microscopie des cellules subissant necroptosis. En outre, nous illustrons notre analyse in vitro RMN des interactions de BNB avec phosphatidylinositols (PIPs).

<table><tbody><tr><td>Clonage et génération de lignées cellulaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188</td><td></td></tr><tr><td>Tet-On transactivateur plasmide</td><td></td><td></td><td>Llambi et al., 2016</td></tr><tr><td>Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) mlkl-/-</td><td></td><td></td><td>Dillon et al., 2014</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de blasticidine S</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Quantification de la mort cellulaire et microscopie sur cellules vivantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Clontech</td><td>631311 CAS# 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Homodimériseur B/B AP20187</td><td>Takara</td><td>635059 CAS# 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Vert</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 Chlorure d’ammonium N</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>DTT deutéré</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta ;-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 CAS# 69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha ;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (cerveau, porcin) (sel d’ammonium)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X CAS# 383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (sel d’ammonium) (18:0 PI)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850143 CAS# 849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (sel d’ammonium) (18:1)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850149 CAS# 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td>Specialized Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLR ou ZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>Imagerie par microscopie à cellules vivantes</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Microscope</td></tr> <tr><td>électroniqueSoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>Analyse d’imagerie</td></tr>, <tr><td>FEI MAPS</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td>, <td>https://www.fei.com/software/maps/</td> <td>EM analysis</td></tr><tr><td>, TopSpin v3.2</td>, <td>Bruker, BioSpin</td><td>http://www.bruker.com</td>, <td>collecte de données RMN,</td></tr><tr><td>CARA v1.9.1.7</td><td></td><td>http://cara.nmr.ch/&nbsp ;</td><td>Analyse des données RMN</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i (Innovations en imagerie intelligente)</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>Microscopie confocale</td></tr></tbody></table>

caractérisation de la rupture des membranes de plasma induite par le mlkl en necroptosis

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis est un chemin de mort cellulaire programmée déclenché par l’activation du récepteur interaction protéine kinase 3 (RIPK3), qui phosphoryle et active le pseudokinase domaine kinase similaire de lignée mixte, MLKL, à se rompre ou permeabilize de la membrane plasmique . Necroptosis est une voie inflammatoire associée à des pathologies multiples, y compris l’auto-immunité, maladies infectieuses et cardiovasculaires, accidents vasculaires cérébraux, neurodégénérescence et le cancer. Nous décrivons ici les protocoles pouvant servir à qualifier le bourreau de rupture de la membrane plasmique dans necroptosis MLKL. Nous visualisons le processus de necroptosis dans les cellules à l’aide d’imagerie de cellules vivantes par microscopie de fluorescence conventionnels et confocale et dans les cellules fixes à l’aide de la microscopie électronique, qui ensemble ont révélé la redistribution des MLKL du cytosol au plasma membrane avant induction de grands trous dans la membrane plasmique. Nous présentons en vitro analyse de résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’aide de lipides pour identifier des modulateurs putatifs de médiation MLKL necroptosis. Selon cette méthode, nous avons identifié quantitatives préférences de lipide-fixation et phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) comme liants critiques des MLKL qui sont requises pour le ciblage de la membrane plasmique et la perméabilisation dans necroptosis.

Visualisation necroptosis réglementé l’exécution dans des cellules vivantes a été possible grâce à une expression inductible d’une construction minimale de MLKL tronquée, BNB140-2xFV-Venus. Cette construction maintient la capacité d’induire la perméabilisation de la membrane plasmique et est activée par oligomérisation Dim-induite de la cassette FKBP (2xFV). Nous observons et quantifier necroptosis par microscopie des cellules vivantes d’imagerie, le suivi cinétique (toutes les...

Nous rapportons des méthodes de caractérisation de la rupture des membranes de plasma induite par le MLKL en necroptosis y compris l’imagerie conventionnelle et confocale microscopie de cellules vivantes, microscopie à balayage électronique et liaison lipidique axée sur les NMR.

Caractérisation de la Rupture des membranes de Plasma induite par le MLKL en Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés sur le rôle de la pseudokinase à domaine kinase mixte ou MLKL dans la nécroptose, telle que la translocation membranaire et la perméabilisation dans la liaison aux lipides. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles impliquent directement MLKL en tant que bourreau de la rupture de la membrane plasmique dans la nécroptose. L’imagerie de cellules vivantes a révolutionné le domaine de la recherche sur la mort cellulaire, en particulier pour la nécroptose médiée par MLKL.La résonance magnétique nucléaire est une technique puissante pour surveiller la liaison des lipides aux protéines, comme démontré ici pour MLKL. Commencez par plaquer cinq fois 10 à la quatrième MLKL des fibroblastes embryonnaires de souris ou MEF exprimant le domaine bourreau de MLKL fusionnés à une cassette d’oligomérisation et Vénus dans un millilitre de DMEM supplémenté dans des plaques de 24 puits pour leur incubation pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, traitez les cellules avec de la doxycycline pendant 12 heures pour induire l’expression du transgène, suivi de l’ajout de DMEM standard complété par un dimériseur de protéine de liaison FK506 et un colorant fluorescent vert imperméable à la membrane pour induire une nécroptose.Pour surveiller la mort cellulaire, placez la plaque dans une unité d’imagerie appropriée logée dans un incubateur de culture de tissus de mammifères et ouvrez le logiciel du système d’imagerie. Sélectionnez l’onglet Planifier les analyses à venir, puis sélectionnez le plateau, le récipient, les types de numérisation et le modèle de numérisation dans l’onglet Mise en page physique. Sélectionnez la fluorescence rapide dans l’onglet Propriétés et cliquez sur la fenêtre Chronologie et le nombre total de points temporels et la fréquence d’acquisition pour ajouter le temps de balayage.Cliquez ensuite sur Appliquer pour lancer l’acquisition de l’image. Pour quantifier la nécroptose, sélectionnez le volet Tâches et passez le curseur de la souris sur l’arrière-plan de plusieurs images pour définir le comptage d’objets nouvelle analyse avec un seuil de segmentation fixe au-dessus du niveau d’arrière-plan. Ensuite, sélectionnez Aperçu pour examiner les objets fluorescents dans l’image actuelle et affiner les niveaux de seuil si nécessaire.Une sélection minutieuse du seuil a pu être effectuée en observant plusieurs puits sur la plaque et en utilisant la fonction de prévisualisation du logiciel. Sachez simplement utiliser le même réglage de seuil pour tous les puits de la plaque. Pour intégrer les comptages de fluorescence verte, sous l’onglet Lancer une nouvelle analyse, sélectionnez la plage horaire et les puits à analyser, puis entrez le nom de la tâche d’analyse.Ensuite, cliquez sur OK et double-cliquez sur le nom de la tâche pour exporter les données pour une analyse supplémentaire dans un logiciel de représentation graphique approprié. Pour la liaison lipidique du MLKL par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire ou RMN, utilisez des seringues hermétiques pour aliquoter un milligramme par millilitre des phospholipides d’intérêt dans des flacons en verre propre pour des séries de titrage RMN individuelles et placez les flacons sous un flux gazeux d’argon ou d’azote pendant cinq à 30 minutes. La distribution de lipides à partir de solvants volatils tels que le chloroforme ou le méthanol doit être effectuée rapidement à partir de stocks conservés sur de la glace sèche afin de minimiser les incohérences dans les concentrations de lipides entre les échantillons dues à l’évaporation du solvant.À la fin de la période d’évaporation, utilisez une grande pince à épiler pour disposer les flacons au fond d’une fiole Buchner. Fermez le flacon avec un bouchon en caoutchouc et fixez un tube en plastique relié à une conduite de vide pour évacuer le contenu du flacon sous vide doux pendant la nuit afin d’éliminer tous les composés organiques résiduels. Le lendemain matin, ajouter un tampon RMN complété par un détergent à la concentration expérimentale appropriée dans chaque flacon en verre avec un film lipidique et soniser le flacon dans un bain-marie pendant 30 minutes maximum, en arrêtant la sonication toutes les 10 minutes pour vérifier la solubilisation du film lipidique.À la fin de la sonication, laisser refroidir les flacons pendant 15 minutes et effectuer une dilution en série des micelles lipides-détergents dans un tampon RMN détergent positif, en sonicant les mélanges 1:1 pour la série de concentration souhaitée. Préparer des échantillons de contrôle et de référence RMN de protéines et d’additifs dans des tampons RMN négatifs au détergent et positifs au détergent, respectivement, en ajoutant des protéines et des additifs à chaque dilution lipidique dans un tampon positif au détergent. Ensuite, transférez le volume approprié d’échantillons dans des tubes RMN de taille appropriée et chargez les échantillons sur l’instrument RMN.Une nécroptose complète des MEF knock-out MLKL peut être observée dans l’heure qui suit l’oligomérisation médiée par les dimères des cellules pré-incubées de doxycycline exprimant le transgène fusionné. Cette nécroptose cinétique rapide soutient le rôle de MLKL en tant qu’exécuteur présumé de la rupture de la membrane plasmique, entraînant la production de Vénus puncta associée à la membrane plasmique dans les deux minutes suivant le traitement, le dimère et Vénus codant la périphérie cellulaire et l’arrondi cellulaire progressif en deux à trois minutes. Lors de la nécroptose rapide, les cellules changent de morphologie de leur forme allongée normale à arrondie et gonflée dans les cinq minutes suivant l’oligomérisation, partiellement rompue à 10 minutes et largement démantelée avec cytosol disparu à 20 minutes.Des expériences in vitro de liaison lipidique surveillées par spectroscopie RMN révèlent des changements structurels majeurs dans la protéine du domaine du bourreau MLKL lors de la liaison lipidique pour déplacer la région de l’accolade inhibitrice de la conformation N-hélicoïdale fermée à la conformation ouverte et intrinsèquement désordonnée, ainsi que des informations par résidu sur les mélanges des deux conformateurs. Les pourcentages de conformants fermés et ouverts dans un échantillon donné peuvent également être surveillés, fournissant des preuves à l’appui de l’interaction du domaine du bourreau MLKL avec les phospholipides et suggérant un lien direct entre MLKL et la membrane plasmique. Ainsi, tout en essayant de quantifier la mort cellulaire à l’aide de cette procédure, il est important de savoir et de se rappeler que le colorant de liaison à l’ADN a un seuil de fluorescence plus élevé que la protéine de fluorescence normalement codante génétiquement.Pour cette raison, ils peuvent être utilisés en parallèle. Notez également que les lipides micellaires sont sensibles à la température et qu’il peut donc être nécessaire d’optimiser la température de l’échantillon par RMN. Ainsi, après cette procédure, d’autres techniques pourraient être utilisées, comme la microscopie à réflexion interne totale et l’électromicroscopie, pour déterminer la vitesse à laquelle la rupture cellulaire se produit sur les cellules subissant une nécroptose et où la rupture est localisée sur la membrane plasmique.De plus, une thermophorèse à l’échelle microscopique peut être réalisée pour valider orthogonalement la liaison de MLKL aux lipides micellaires. Les techniques décrites dans cette vidéo ont ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la nécroptose pour explorer le rôle de MLKL en tant que bourreau de la rupture de la membrane plasmique. N’oubliez pas que travailler avec du chloroforme peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et le travail dans un endroit bien ventilé doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Identification des événements intracellulaires de signalisation induite dans les cellules viables par interaction avec les cellules voisines Subissant la mort cellulaire apoptotique

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