Caractérisation de la Rupture des membranes de Plasma induite par le MLKL en Necroptosis

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés sur le rôle de la pseudokinase à domaine kinase mixte ou MLKL dans la nécroptose, telle que la translocation membranaire et la perméabilisation dans la liaison aux lipides. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles impliquent directement MLKL en tant que bourreau de la rupture de la membrane plasmique dans la nécroptose. L’imagerie de cellules vivantes a révolutionné le domaine de la recherche sur la mort cellulaire, en particulier pour la nécroptose médiée par MLKL.

La résonance magnétique nucléaire est une technique puissante pour surveiller la liaison des lipides aux protéines, comme démontré ici pour MLKL. Commencez par plaquer cinq fois 10 à la quatrième MLKL des fibroblastes embryonnaires de souris ou MEF exprimant le domaine bourreau de MLKL fusionnés à une cassette d’oligomérisation et Vénus dans un millilitre de DMEM supplémenté dans des plaques de 24 puits pour leur incubation pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, traitez les cellules avec de la doxycycline pendant 12 heures pour induire l’expression du transgène, suivi de l’ajout de DMEM standard complété par un dimériseur de protéine de liaison FK506 et un colorant fluorescent vert imperméable à la membrane pour induire une nécroptose.

Pour surveiller la mort cellulaire, placez la plaque dans une unité d’imagerie appropriée logée dans un incubateur de culture de tissus de mammifères et ouvrez le logiciel du système d’imagerie. Sélectionnez l’onglet Planifier les analyses à venir, puis sélectionnez le plateau, le récipient, les types de numérisation et le modèle de numérisation dans l’onglet Mise en page physique. Sélectionnez la fluorescence rapide dans l’onglet Propriétés et cliquez sur la fenêtre Chronologie et le nombre total de points temporels et la fréquence d’acquisition pour ajouter le temps de balayage.

Cliquez ensuite sur Appliquer pour lancer l’acquisition de l’image. Pour quantifier la nécroptose, sélectionnez le volet Tâches et passez le curseur de la souris sur l’arrière-plan de plusieurs images pour définir le comptage d’objets nouvelle analyse avec un seuil de segmentation fixe au-dessus du niveau d’arrière-plan. Ensuite, sélectionnez Aperçu pour examiner les objets fluorescents dans l’image actuelle et affiner les niveaux de seuil si nécessaire.

Une sélection minutieuse du seuil a pu être effectuée en observant plusieurs puits sur la plaque et en utilisant la fonction de prévisualisation du logiciel. Sachez simplement utiliser le même réglage de seuil pour tous les puits de la plaque. Pour intégrer les comptages de fluorescence verte, sous l’onglet Lancer une nouvelle analyse, sélectionnez la plage horaire et les puits à analyser, puis entrez le nom de la tâche d’analyse.

Ensuite, cliquez sur OK et double-cliquez sur le nom de la tâche pour exporter les données pour une analyse supplémentaire dans un logiciel de représentation graphique approprié. Pour la liaison lipidique du MLKL par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire ou RMN, utilisez des seringues hermétiques pour aliquoter un milligramme par millilitre des phospholipides d’intérêt dans des flacons en verre propre pour des séries de titrage RMN individuelles et placez les flacons sous un flux gazeux d’argon ou d’azote pendant cinq à 30 minutes. La distribution de lipides à partir de solvants volatils tels que le chloroforme ou le méthanol doit être effectuée rapidement à partir de stocks conservés sur de la glace sèche afin de minimiser les incohérences dans les concentrations de lipides entre les échantillons dues à l’évaporation du solvant.

À la fin de la période d’évaporation, utilisez une grande pince à épiler pour disposer les flacons au fond d’une fiole Buchner. Fermez le flacon avec un bouchon en caoutchouc et fixez un tube en plastique relié à une conduite de vide pour évacuer le contenu du flacon sous vide doux pendant la nuit afin d’éliminer tous les composés organiques résiduels. Le lendemain matin, ajouter un tampon RMN complété par un détergent à la concentration expérimentale appropriée dans chaque flacon en verre avec un film lipidique et soniser le flacon dans un bain-marie pendant 30 minutes maximum, en arrêtant la sonication toutes les 10 minutes pour vérifier la solubilisation du film lipidique.

À la fin de la sonication, laisser refroidir les flacons pendant 15 minutes et effectuer une dilution en série des micelles lipides-détergents dans un tampon RMN détergent positif, en sonicant les mélanges 1:1 pour la série de concentration souhaitée. Préparer des échantillons de contrôle et de référence RMN de protéines et d’additifs dans des tampons RMN négatifs au détergent et positifs au détergent, respectivement, en ajoutant des protéines et des additifs à chaque dilution lipidique dans un tampon positif au détergent. Ensuite, transférez le volume approprié d’échantillons dans des tubes RMN de taille appropriée et chargez les échantillons sur l’instrument RMN.

Une nécroptose complète des MEF knock-out MLKL peut être observée dans l’heure qui suit l’oligomérisation médiée par les dimères des cellules pré-incubées de doxycycline exprimant le transgène fusionné. Cette nécroptose cinétique rapide soutient le rôle de MLKL en tant qu’exécuteur présumé de la rupture de la membrane plasmique, entraînant la production de Vénus puncta associée à la membrane plasmique dans les deux minutes suivant le traitement, le dimère et Vénus codant la périphérie cellulaire et l’arrondi cellulaire progressif en deux à trois minutes. Lors de la nécroptose rapide, les cellules changent de morphologie de leur forme allongée normale à arrondie et gonflée dans les cinq minutes suivant l’oligomérisation, partiellement rompue à 10 minutes et largement démantelée avec cytosol disparu à 20 minutes.

Des expériences in vitro de liaison lipidique surveillées par spectroscopie RMN révèlent des changements structurels majeurs dans la protéine du domaine du bourreau MLKL lors de la liaison lipidique pour déplacer la région de l’accolade inhibitrice de la conformation N-hélicoïdale fermée à la conformation ouverte et intrinsèquement désordonnée, ainsi que des informations par résidu sur les mélanges des deux conformateurs. Les pourcentages de conformants fermés et ouverts dans un échantillon donné peuvent également être surveillés, fournissant des preuves à l’appui de l’interaction du domaine du bourreau MLKL avec les phospholipides et suggérant un lien direct entre MLKL et la membrane plasmique. Ainsi, tout en essayant de quantifier la mort cellulaire à l’aide de cette procédure, il est important de savoir et de se rappeler que le colorant de liaison à l’ADN a un seuil de fluorescence plus élevé que la protéine de fluorescence normalement codante génétiquement.

Pour cette raison, ils peuvent être utilisés en parallèle. Notez également que les lipides micellaires sont sensibles à la température et qu’il peut donc être nécessaire d’optimiser la température de l’échantillon par RMN. Ainsi, après cette procédure, d’autres techniques pourraient être utilisées, comme la microscopie à réflexion interne totale et l’électromicroscopie, pour déterminer la vitesse à laquelle la rupture cellulaire se produit sur les cellules subissant une nécroptose et où la rupture est localisée sur la membrane plasmique.

De plus, une thermophorèse à l’échelle microscopique peut être réalisée pour valider orthogonalement la liaison de MLKL aux lipides micellaires. Les techniques décrites dans cette vidéo ont ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la nécroptose pour explorer le rôle de MLKL en tant que bourreau de la rupture de la membrane plasmique. N’oubliez pas que travailler avec du chloroforme peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de gants et le travail dans un endroit bien ventilé doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.