Name: Caractérisation de la Rupture des membranes de Plasma induite par le MLKL en Necroptosis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Découvrez la caractérisation de la rupture membranaire plasmique induite par MLKL en nécroptose. Ces méthodes combinent microscopie en cellules vivantes et spectroscopie RMN pour étudier les mécanismes de mort cellulaire.

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<ol><li>Weinlich, R., Oberst, A., Beere, H. M., Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+development%2C+inflammation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in development, inflammation and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (2), 127-136 (2017).</li>
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<li>Malkani, N., Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+secrets+of+fluorescent+proteins%3A+distinct+bleaching+in+various+mounting+fluids+and+photoactivation+of+cyan+fluorescent+proteins+at+YFP-excitation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Some secrets of fluorescent proteins: distinct bleaching in various mounting fluids and photoactivation of cyan fluorescent proteins at YFP-excitation.</a> PLoS One. 6 (4), 18586(2011).</li>
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</ol>

Nous fournissons des protocoles pour les techniques que nous avons combiné impliqué MLKL comme le bourreau présumé de rupture de la membrane plasmique24. En plus de déchiffrer le réseau de régulation qui régule induite par le MLKL necroptosis, ces techniques peuvent servir indépendamment pour caractériser d’autres systèmes biologiques adaptés. Concrètement, ces techniques sont des outils de découverte du milieu à faible débit.
Régulièrement, nous avons utilisé une image...

Identifier les composantes génétiques de necroptosis a facilité l’utilisation de modèles animaux pour tester l’implication des necroptosis dans la physiologie et les maladies1,2,3,4,5. Ko de RIPK3 ou MLKL chez les souris avait une implication minimale dans l’homéostasie développement et adulte, ce qui laisse supposer que necroptosis n’est pas essentiel pour la vie3,6. En outre, certaines espèces ne contiennent pas de gènes soit RIPK3 soit MLKL, appuyant le rôle de non essentiels des necroptosis animaux7,8. En revanche, contester les modèles animaux Knock-Out avec diverses pathologies induites dans le laboratoire a révélé un important rôle de necroptosis dans l’inflammation, l’immunité innée et infection virale9,10, 11 , 12.
Necroptosis peut être activé de plusieurs façons par la signalisation au moyen de capteurs de l’immunité innée différents, tous de qui se traduisent par l’activation de RIPK31,13,14. RIPK3 active à son tour phosphoryle et active MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Le plus étudié, et peut-être la manière plus complexe, conduisant à l’activation de RIPK3 implique mort récepteur ligature, qui bifurque basée sur la composition en aval des complexes de signalisation soit induire l’apoptose ou necroptosis1. Il s’ensuit des Necroptosis lorsque la signalisation par le biais de RIPK1 est favorisée et se traduit par l’engagement de RIPK319,20. Ce résultat est facilement favorisé lors de l’inhibition pharmacologique ou délétion génétique de la caspase 8, un inhibiteur endogène putatif de necroptosis qui garde necroptosis à la baie. RIPK1 lie et active RIPK3. Une autre façon d’activer necroptosis est par le biais de récepteurs Toll-like TLR3/TLR4 signalisation, qui s’engage et RIPK3 se déclenche grâce à TIR-domaine-contenant adaptateur induisant l’interféron β (FTBC)21. Encore une autre façon de mourir par necroptosis est par l’activation de la sonde ADN DAI, qui directement se livre et active RIPK322.
MLKL est une protéine cytosolique composée un domaine N-terminal de bundle (NB) hélice et un domaine de pseudokinase C-terminal (psKD) reliés par un renfort réglementaire région3. Dans les cellules normales, les MLKL se trouve dans le cytosol où il est censé être dans un complexe inactif avec RIPK314. L’activation de necroptosis déclenche la phosphorylation de RIPK3 de MLKL dans la boucle d’activation de la psKD et potentiellement d’autres sites dans le NB et orthèse3,15,23. La phosphorylation induit un changement conformationnel dans MLKL qui se traduit par une dissociation du RIPK314. Mal comprise des changements conformationnels libèrent l’accolade du psKD24. L’orthèse, qui contient 2 hélices, négocie l’oligomérisation de MLKL dans un trimère putatif à travers le d’hélice C-terminale25. L’hélice N-terminale de l’orthèse inhibe le domaine NB, qui est essentiel pour membrane perméabilisation24,26. Isolément, domaine NB est suffisante pour induire la perméabilisation de la membrane plasmique et necroptosis16,24,27. L’activité de pro-necroptotic de NB a été reconstituée dans les fibroblastes embryonnaires de souris déficientes en MLKL (mlkl- / - MEFs). NB est un domaine de liaison du lipide qui engage préférentiellement le diphosphate de phosphatidylinositol 4, 5 de phospholipides (PIP2). Nous avons proposé un mécanisme par étapes d’activation de MLKL, dans lequel oligomérisation orthèse facilite le recrutement de MLKL à la membrane plasmique via les interactions faibles du NB avec le PIP2 groupes polaires24. Au niveau de la membrane, le NB subit une exposition réglementée d’un site de liaison de haute affinité supplémentaires pour PIP2, qui est masqué par l’orthèse en MLKL inactif. Dans l’ensemble, les interactions multiples du NB avec PIP2 déstabilisent la membrane plasmique, conduisant à sa rupture, bien que le mécanisme moléculaire de ces événements n’ont pas été élucidés.
Ici, nous illustrons les méthodes spécifiques utilisées pour caractériser la fonction de MLKL comme bourreau de necroptosis24. En particulier, nous nous concentrons sur le domaine plus minime de MLKL, le NB et l’accolade (BNB), qui est réglementé par l’inhibition de l’orthèse et peut être activé par le biais de dimérisation forcée pour induire la necroptosis et la rupture de la membrane plasmique. Nous décrivons notre système d’expression inductible combiné avec forcée dimérisation FKBP-mediated médicamenteuse à l’imagerie de cellules vivantes et microscopie des cellules subissant necroptosis. En outre, nous illustrons notre analyse in vitro RMN des interactions de BNB avec phosphatidylinositols (PIPs).

<table><tbody><tr><td>Clonage et génération de lignées cellulaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188</td><td></td></tr><tr><td>Tet-On transactivateur plasmide</td><td></td><td></td><td>Llambi et al., 2016</td></tr><tr><td>Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) mlkl-/-</td><td></td><td></td><td>Dillon et al., 2014</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de blasticidine S</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Quantification de la mort cellulaire et microscopie sur cellules vivantes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Clontech</td><td>631311 CAS# 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Homodimériseur B/B AP20187</td><td>Takara</td><td>635059 CAS# 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Vert</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 Chlorure d’ammonium N</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>DTT deutéré</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta ;-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310 CAS# 69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha ;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (cerveau, porcin) (sel d’ammonium)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046X CAS# 383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (sel d’ammonium) (18:0 PI)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850143 CAS# 849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (sel d’ammonium) (18:1)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850149 CAS# 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td>Specialized Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLR ou ZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>Imagerie par microscopie à cellules vivantes</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Microscope</td></tr> <tr><td>électroniqueSoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>Analyse d’imagerie</td></tr>, <tr><td>FEI MAPS</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td>, <td>https://www.fei.com/software/maps/</td> <td>EM analysis</td></tr><tr><td>, TopSpin v3.2</td>, <td>Bruker, BioSpin</td><td>http://www.bruker.com</td>, <td>collecte de données RMN,</td></tr><tr><td>CARA v1.9.1.7</td><td></td><td>http://cara.nmr.ch/&nbsp ;</td><td>Analyse des données RMN</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i (Innovations en imagerie intelligente)</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>Microscopie confocale</td></tr></tbody></table>

caractérisation de la rupture des membranes de plasma induite par le mlkl en necroptosis

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis est un chemin de mort cellulaire programmée déclenché par l’activation du récepteur interaction protéine kinase 3 (RIPK3), qui phosphoryle et active le pseudokinase domaine kinase similaire de lignée mixte, MLKL, à se rompre ou permeabilize de la membrane plasmique . Necroptosis est une voie inflammatoire associée à des pathologies multiples, y compris l’auto-immunité, maladies infectieuses et cardiovasculaires, accidents vasculaires cérébraux, neurodégénérescence et le cancer. Nous décrivons ici les protocoles pouvant servir à qualifier le bourreau de rupture de la membrane plasmique dans necroptosis MLKL. Nous visualisons le processus de necroptosis dans les cellules à l’aide d’imagerie de cellules vivantes par microscopie de fluorescence conventionnels et confocale et dans les cellules fixes à l’aide de la microscopie électronique, qui ensemble ont révélé la redistribution des MLKL du cytosol au plasma membrane avant induction de grands trous dans la membrane plasmique. Nous présentons en vitro analyse de résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’aide de lipides pour identifier des modulateurs putatifs de médiation MLKL necroptosis. Selon cette méthode, nous avons identifié quantitatives préférences de lipide-fixation et phosphatidyl-inositol phosphates (PIPs) comme liants critiques des MLKL qui sont requises pour le ciblage de la membrane plasmique et la perméabilisation dans necroptosis.

Visualisation necroptosis réglementé l’exécution dans des cellules vivantes a été possible grâce à une expression inductible d’une construction minimale de MLKL tronquée, BNB140-2xFV-Venus. Cette construction maintient la capacité d’induire la perméabilisation de la membrane plasmique et est activée par oligomérisation Dim-induite de la cassette FKBP (2xFV). Nous observons et quantifier necroptosis par microscopie des cellules vivantes d’imagerie, le suivi cinétique (toutes les...

Nous rapportons des méthodes de caractérisation de la rupture des membranes de plasma induite par le MLKL en necroptosis y compris l’imagerie conventionnelle et confocale microscopie de cellules vivantes, microscopie à balayage électronique et liaison lipidique axée sur les NMR.

Caractérisation de la Rupture des membranes de Plasma induite par le MLKL en Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés sur le rôle de la pseudokinase à domaine kinase mixte ou MLKL dans la nécroptose, telle que la translocation membranaire et la perméabilisation dans la liaison aux lipides. Le principal avantage de ces techniques est qu’elles impliquent directement MLKL en tant que bourreau de la rupture de la membrane plasmique dans la nécroptose. L’imagerie de cellules vivantes a révolutionné le domaine de la recherche sur la mort cellulaire, en particulier pour la nécroptose médiée par MLKL.La résonance magnétique nucléaire est une technique puissante pour surveiller la liaison des lipides aux protéines, comme démontré ici pour MLKL. Commencez par plaquer cinq fois 10 à la quatrième MLKL des fibroblastes embryonnaires de souris ou MEF exprimant le domaine bourreau de MLKL fusionnés à une cassette d’oligomérisation et Vénus dans un millilitre de DMEM supplémenté dans des plaques de 24 puits pour leur incubation pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, traitez les cellules avec de la doxycycline pendant 12 heures pour induire l’expression du transgène, suivi de l’ajout de DMEM standard complété par un d

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Ici, nous présentons un protocole pour la détermination des événements de signalisation intracellulaire induits dans les cellules viables par l’interaction physique avec des cellules mortes ou mourantes adjacentes. Le protocole se concentre sur les événements de signalisation induits par la reconnaissance des cellules mortes par le biais du récepteur, par opposition à leur absorption phagocytaire ou à la libération de médiateurs solubles.

Identification des événements intracellulaires de signalisation induite dans les cellules viables par interaction avec les cellules voisines Subissant la mort cellulaire apoptotique

Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler et cultiver les neurones de granule cérébral de souris primaire (SCT) de petits 6-7 jours vieux, transduction efficace du SCT pour la perte et gain d’études de fonction et modélisation excitotoxicité neuronale induite par le NMDA, la mort cellulaire induite par la basse-potassium, lésions de l’ADN et le stress oxydatif en utilisant le même modèle de culture.

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Nous décrivons la détection d’activation inflammasome NLRP3 sur base cellulaire à l’aide de la microscopie en fluorescence et coloration pour active caspase-1 et l’adaptateur, ASC. Un test de libération de lactate déshydrogénase est présenté afin de détecter la lyse pyroptotic sur une base de population. Ces techniques peuvent être adaptés afin d’étudier plusieurs aspects de la biologie inflammasome.

Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine

Ici, nous utilisons bidimensionnelle semi dénaturation gel d’agarose pour confirmer la présence de fibres amyloïdes semblables de taille hétérogène et exclure la possibilité que l’hétérogénéité de taille est due à la dissociation des fibres amyloïdes durant le gel processus en cours d’exécution.

Utilisation de deux dimensions semi dénaturation détergent Gel d’agarose pour confirmer l’hétérogénéité de la taille des fibres amyloïdes ou type amyloïde

Nous décrivons ici un test haut débit fluorescence qui mesure la membrane plasmique rescellage d’efficacité grâce à des analyses fluorimétrique et imageries de cellules vivantes. Ce test peut être utilisé pour le dépistage des drogues ou des gènes de cible qui régulent la membrane plasmique réapposition de sceau sur des cellules mammaliennes.

Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

L’amplification du signal tyramide lors de la coloration par immunofluorescence permet la détection sensible de RIPK3 et MLKL phosphorylés lors de la nécroptose induite par ZBP1 après une infection à HSV-1.

Amplification du signal tyramide pour la coloration immunofluorescente de la phosphorylation dépendante de ZBP1 de RIPK3 et MLKL après infection à HSV-1 dans des cellules humaines

Ce protocole est basé sur la mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA. Nous utilisons la cytométrie en flux pour analyser l’annexine V et la double coloration 7-AAD pour détecter la mort cellulaire, en utilisant la cellule entière et en utilisant la microscopie électronique à balayage pour observer la morphologie de la membrane cellulaire.

Mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA et sa validation

Ce protocole décrit une méthode d’imagerie de cellules vivantes pour surveiller la perméabilisation de la membrane lysosomale pendant la nécroptose, à l’aide de sondes fluorescentes qui détectent les changements dans l’intégrité de la membrane lysosomale et l’acidification.

Imagerie de cellules vivantes de la perméabilisation de la membrane lysosomale pendant la nécroptose

Nous décrivons comment mesurer près de la membrane et la dynamique globale du calcium intracellulaire dans les astrocytes cultivés en utilisant la réflexion interne totale et de la microscopie à épifluorescence.

Mesure Proche membrane plasmique et mondiale dynamique du calcium intracellulaire dans les astrocytes

Endocytose régulée régit les niveaux de surface des cellules d'expression de la majorité des protéines membranaires. Ici, nous utilisons réductible, réactifs à membrane biotinylation imperméants pour mesurer le taux d'endocytose du transporteur de la dopamine (DAT), une protéine membranaire polytopique. La méthode facilite une approche simple pour mesurer le taux d'endocytose de la plupart des protéines de la membrane plasmique.

Mesure du taux plasmatique des protéines membranaires par endocytique Biotinylation réversible

Découvrez la caractérisation de la rupture membranaire plasmique induite par MLKL en nécroptose. Ces méthodes combinent microscopie en cellules vivantes et spectroscopie RMN pour étudier les mécanismes de mort cellulaire.

Caractérisation de la Rupture des membranes de Plasma induite par le MLKL en Necroptosis

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