Mesure sensible des Mitophagy par Flow Cytometry à l’aide de la fonction du pH Fluorescent journaliste mt-Keima

L’objectif global de cette procédure est de fournir une technique sensible pour mesurer l’activité de la mitophagie cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux. Nous démontrons ici que cette méthode a été utilisée avec succès pour évaluer l’augmentation spectaculaire de la mitophagie des cellules HeLa, après traitement par CCCP, un découplage mitochondrial. Cette technique permet de mesurer très rapidement et facilement l’activité des mitophages.

Le principal avantage de cette technique est que vous pouvez mesurer de manière sensible l’activité des mitophages dans les cellules vivantes sans aucune coloration supplémentaire. Par conséquent, cette technique pourra finalement aider à comprendre le mécanisme et le rôle physiologique du mitophage. Jee-Hyun Um et Young Yeon Kim de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure.

Commencez cette procédure en préparant le mt-Keima, un lentivirus de Keima ciblant les mitochondries. Semez d’abord HEK293T cellules dans une boîte de culture enrobée de poly-L-lysine et cultivez-les à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire pendant une journée. Le lendemain, transfectez HEK293T cellules avec de l’ADN lentiviral mt-Keima et empaquetez la DNase à l’aide d’un réactif de transfection selon les instructions du fabricant.

Après huit heures de transfection, retirez le milieu de transfection et ajoutez huit millilitres de milieu frais. Prélever le milieu contenant des particules virales 48 heures plus tard et éliminer les débris cellulaires par centrifugation. Filtrez ensuite le média contenant le virus à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micromètre.

Placez des cellules HeLa-Parkin dans une boîte de culture de 60 millimètres un jour avant de récolter le lentivirus mt-Keima et cultivez les cellules avec quatre millilitres de milieu de croissance pendant une journée à 37 degrés Celsius dans un incubateur. Le lendemain, retirez le milieu de croissance, ajoutez un millimètre de milieu de virus mt-Keima, ajoutez deux millilitres supplémentaires de milieu de croissance contenant 3 microlitres de solution mère de polybrène et incubez les cellules pendant une journée dans un incubateur de CO2. 24 heures après l’infection, retirez le milieu viral, lavez les cellules deux fois avec du PBS et ajoutez quatre millilitres de milieu de croissance.

Pour éliminer les cellules non infectées, traitez les cellules pendant deux jours avec deux microgrammes par microlitre de puromycine. Préparez un milieu frais contenant 10 CCCP micromolaires. Retirer le milieu de culture et ajouter quatre millilitres de milieu de croissance frais contenant du CCCP.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à CO2 pendant six heures. Retirez le milieu de croissance et lavez les cellules une fois avec du PBS. Détacher les cellules par traitement avec une solution de trypsine EDTA.

Récupérez les cellules par centrifugation et mettez-les en suspension dans un millilitre de PBS. Transférez les cellules dans un tube FACS et placez-les sur de la glace. Pour la cytométrie en flux, allumez le cytomètre en flux et démarrez le logiciel d’analyse.

Générez une nouvelle expérience et sélectionnez BV605 pour le laser violet et PE-CF594 pour le laser jaune-vert dans la fenêtre des paramètres. Analysez d’abord un échantillon de contrôle de cellules non infectées par le lentivirus mt-Keima. Dans le graphique de la diffusion vers l’avant par rapport à la diffusion latérale, dessinez une porte, à l’aide de l’icône du polygone, autour des cellules vivantes et éliminez les cellules mortes et les débris cellulaires.

Ensuite, analysez des cellules HeLa-Parkin infectées par le lentivirus mt-Keima. Dans le diagramme à points du BV605 en fonction de la diffusion latérale, ajustez la tension de sorte que les cellules HeLa-Parkin exprimant mt-Keima soient clairement distinguées des cellules de contrôle qui n’expriment pas mt-Keima. Ensuite, dans le graphique à points du PE-CF594 par rapport à la diffusion latérale, ajustez la tension de sorte que les cellules HeLa-Parkin exprimant mt-Keima soient clairement distinguées des cellules de contrôle.

Ensuite, dans le graphique à points de BV605 par rapport à PE-CF594, sélectionnez la population de cellules mt-Keima positives en dessinant une porte à l’aide de l’icône de polygone. Ensuite, créez un autre graphique à points de BV605 par rapport à PE-CF594 montrant uniquement les cellules mt-Keima fermées. Dans ce graphique à points, dessinez une porte autour des cellules mt-Keima positives non traitées.

Cette porte est appelée la porte basse. Dessinez ensuite une autre porte contenant la région au-dessus de la porte basse. Cette porte est appelée porte haute car elle contient des cellules à forte activité mitohagique.

Sélectionnez ensuite le menu Afficher la hiérarchie de la population. La valeur Pourcentage du parent représente le pourcentage de cellules dans la porte haute parmi la population mt-Keima positive. Exécutez maintenant chaque échantillon et enregistrez au moins 10 000 événements dans la porte d’arrêt mt-Keima.

L’analyse par cytométrie en flux de cellules HeLa non traitées exprimant mt-Keima a montré un faible taux de mitophagie. Le traitement CCCP a induit une augmentation spectaculaire des cellules mitophagiques dans la porte haute. Le pourcentage de cellules mitophagiques a été multiplié par plus de 10 six heures après le traitement par CCCP.

Cette augmentation de la mitophage par le traitement CCCP a été complètement abolie par le co-traitement avec la bafilomycine A.Une fois que les cellules exprimant mito-Keima sont prêtes, la mesure du mitophage par cytométrie en flux peut être effectuée en moins d’une heure si elle est correctement préparée. Pour une analyse précise des mitophages par cytométrie en flux, il est important de configurer les bonnes portes haute et basse. Lors de l’analyse de nouveaux types de cellules, il est nécessaire d’utiliser des cellules bien connues telles que les cellules HeLa comme contrôle.

De plus, il est important de se rappeler que le mitophage doit être entièrement confirmé par des caractéristiques supplémentaires telles qu’une diminution de la protéine mitochondriale et une réduction de l’ADN mitochondrial. Cette technique peut être appliquée à une grande variété de types de cellules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser le mitophage par cytométrie en flux.