Name: Électrophysiologie germes entiers de cellules entérochromaffines murins cultivés primaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Découvrez l'électrophysiologie sur cellules entières pour étudier l'excitabilité des cellules entérochromaffines murines en culture primaire. Cette méthode permet d'analyser la réponse aux stimuli lumineux et la libération d'hormones gastro-intestinales.

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Les auteurs remercient Mme Lyndsay Busby pour l’assistance administrative et M. Robert Highet de Mayo Clinic Division d’ingénierie pour la conception et l’impression 3D de l’insert de plat de la culture. Ce travail a été soutenu par NIH K08 AB (DK106456), pilote et subvention de faisabilité à la DGA de Mayo Clinic Center pour la signalisation de cellules en gastroentérologie (NIH P30DK084567) et 2015 American Gastroenterological Association Research Scholar Award (AGA RSA) à AB et NIH R01 à GF (DK52766).

<ol><li>Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22normal%22+endocrine+cell+of+the+gut%3A+changing+concepts+and+new+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).</li>
<li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).</li>
<li>Strege, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+NaV1.3+is+important+for+enterochromaffin+cell+excitability+and+serotonin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release.</a> Scientific Reports. 7 (15650), (2017).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198 (2017).</li>
<li>Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channel+Piezo2+is+inhibited+by+D-GsMTx4%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4.</a> Channels. 11 (3), 245-253 (2017).</li>
<li>Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+activates+Galphaq+signaling+pathways+and+5-hydroxytryptamine+release+from+human+carcinoid+BON+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).</li>
<li>Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+characterization+of+normal+and+neoplastic+human+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channel+Piezo2+is+important+for+enterochromaffin+cell+response+to+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces.</a> The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).</li>
<li>Li, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cellular+origins+for+serotonin-expressing+and+enterochromaffin-like+cells+in+the+gastric+corpus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus.</a> Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).</li>
<li>Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+primary+cultures+of+murine+small+intestine+intended+for+the+study+of+gut+hormone+secretion+and+live+cell+imaging+of+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), 55687(2017).</li>
<li>Raghupathi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unique+release+kinetics+of+serotonin+from+guinea-pig+and+human+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells.</a> The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).</li>
<li>Nozawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+regulates+gastrointestinal+motility+through+serotonin+release+from+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).</li>
<li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+role+of+voltage+gated+cation+conductances+in+the+glucagon-like+peptide-1+secreting+GLUTag+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line.</a> The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).</li>
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Bien comprendre la fonction des cellules EC requiert une méthode de culture primaire de haute qualité pour générer des cellules pour l’électrophysiologie de cellules entières. Les cultures primaires de l’épithélium de la GI ont toujours été difficiles en raison du faible taux de survie. Alléger ce facteur de confusion, la présente méthode rendements des cultures de cellules EC du singulier de l’intestin soit petite ou grande qui sont capables de survivre pendant plusieurs jours.
Nous avons tro...

L’épithélium gastro-intestinal de (GI) est une communauté diversifiée composée de plusieurs types de cellules. Cellules entéroendocrines représentent environ 1 % de toutes les cellules épithéliales et les cellules entérochromaffines (EC) sont la population des cellules entéroendocrines plus grand1. Des études récentes montrent qu’entéroendocrines2 et3,4 cellules EC sont électriquement excitables. Nous sommes intéressés par la compréhension primaire électrophysiologie cellulaire EC. Ainsi, le but de cette étude était d’établir les cultures primaires de cellules EC optimisés pour l’électrophysiologie de cellules entières.
Existant cellules EC lignes qui produisent et sécrètent la 5-HT (p. ex., QGP-15, BON6, KRJ-1,7) et ont été utilisés pour examiner l’électrophysiologie5,8 proviennent généralement des immortalisé néoplasiques tissus. Alors que l’information acquise de ces lignées cellulaires est précieux5,8, études d’électrophysiologie cellulaire primaire sont nécessaires pour bien comprendre la physiologie des cellules EC. L’électrophysiologie de cellules primaires de EC nécessite l’isolement et la culture de cellules épithéliales isolées, qui a été limitée par la faible viabilité des cultures épithéliales.
La méthode de culture présentée dans cette étude s’appuie sur des souris transgéniques avec des cellules EC fluorescent étiquetés, comme Tph1-CFP9, utilisée dans cette étude. La méthode optimise primaires mixtes épithéliales cultures développées antérieurement2,10 pour unicellulaire électrophysiologie3. Méthodes précédentes combinaisons de trypsine/EDTA plus de collagénase A ou de EDTA et de TNT servant de digestion enzymatique et des gradients de densité permettant d’isoler spécifiquement et culture cobaye11 et rat EC cellules12. Plus récemment, organoïdes intestinales ont été générés et mécaniquement perturbés pour les enregistrements électrophysiologiques4. Cultures à l’aide de ces méthodes sont bien adaptés pour libérer des expériences, analyse de la RT-qPCR sérotonine et, alors qu’ils pourraient être utilisés pour l’électrophysiologie, dépendent de la réussite de votre temps organoïde génération, gradients de densité pour identifier les cellules EC et la cellulaires effets perturbateurs de la trypsine et d’EDTA. En revanche, le protocole décrit ici améliore les traitements enzymatiques et mécaniques, optimise les conditions de culture et rationalise les procédures afin de produire des cellules EC simples et sains pour les hauts standards cellulaires nécessaires pour l’électrophysiologie.
Cette méthode sera utile pour les chercheurs qui veulent travailler sur des cellules primaires de EC dans des cultures mixtes au lieu des cultures immortalisées et souhaiter examiner l’électrophysiologie de cellules individuelles. Toutefois, il peut s’avérer moins approprié pour l’étude des populations de cellules qui ont besoin de tri ou à long terme des cultures nécessitant une survie dernière 72 h.

<table><tbody><tr><td>Boîte de culture 100 mm x 15 mm</td><td>Corning (Falcon)</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique 10 mL</td><td>Corning (Falcon)&nbsp ;</td><td></td><td></td>357551</tr><tr><td>50 mL Conique</td><td>Corning (Falcon)&nbsp ;</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>15 mL Conique</td><td>Corning (Falcon)&nbsp ;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>1 000 mL Pointes de pipette barrière</td><td>Thermo Scientific (Art)</td><td>2079E</td><td>Maintenir stériles</td></tr><tr><td>Plats à fond en verre</td><td>MatTek Corporation P35G-1.5-14-C</td><td></td><td>Garder stériles</td></tr><tr><td>Pince de micro-dissection - Pointes très fines et extra-longues</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>SB12630M</td><td></td></tr><tr><td>ciseaux chirurgicaux-Sharp</td><td>Nasco</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de micro-dissection</td><td>Nasco</td><td>SB46568M</td><td></td></tr><tr><td>Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX</td><td>Covidien</td><td>8881250172</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice</td><td>Jackson</td><td>Stock # 028366</td><td>Utiliser des souris mâles ou femelles âgées de 4 à 7 semaines</td></tr><tr><td>Aiguilles de seringue non métalliques Microfil (calibre 34, 67 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm « M » Film de laboratoire</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R6101</td><td>Seringue Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mL avec embout Luer régulier</td><td>Seringue Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL avec embout Luer régulier</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Équipement d’électrophysiologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Amplifier Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Système d’acquisition de données (daq)</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Conditionneur</td> <td>de signalDispositifs moléculaires CyberAmp</td><td>320</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Logiciel Dispositifs moléculaires</td><td>pClamp 10.6</td><td></td></tr></tbody></table>

Électrophysiologie germes entiers de cellules entérochromaffines murins cultivés primaires

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Cellules entérochromaffines (EC) dans l’épithélium de la gastro-intestinal (GI) constituent la plus grande population de cellules entéroendocrines. Comme les cellules sensorielles spécialisées, cellules EC sentiment stimuli luminales et convertissent en événements de libération de la sérotonine (5-hyroxytryptamine, 5-HT). Toutefois, l’électrophysiologie de ces cellules est mal comprise parce qu’ils sont difficiles à culture et à identifier. La méthode présentée dans ce document contours primaire EC des cultures cellulaires optimisés pour l’électrophysiologie cellulaire unique. Ce protocole utilise un reporter de la protéine fluorescente cyan transgéniques (CFP) pour identifier les cellules EC souris dans des cultures primaires mixtes, faire progresser la démarche pour obtenir des enregistrements de haute qualité d’électrophysiologie de germes entiers dans les modes de bride de tension et de courant.

Cultures : Des cellules épithéliales primaires murines fabriqués à partir d’un modèle transgénique de Tph1-CFP attachent à plats après 4 heures et sont prêts pour des expériences physiologiques entre 24 à 72 h. Lorsque les conditions de culture n’avaient pas été optimisées, la culture de cellules épithéliales se composait de grosses touffes, flottant des débris cellulaires et les membranes endommagées signal faible de PCP dans les cellules EC (Figu...

Cellules entérochromaffines (EC) composent un petit sous-ensemble de cellules épithéliales gastro-intestinale. Cellules EC sont électriquement excitables et libérer la sérotonine, mais des difficultés dans la mise en culture et en identifiant les cellules EC ont limité des études physiologiques. La méthode présentée ici établit un modèle de culture primaire se prêtent à l’examen des cellules individuelles de EC en électrophysiologie.

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés en neurosciences entériques et la physiologie gastro-intestinale, tels que, quels sont les mécanismes de l’excitabilité cellulaire enterochromaffine et la réponse aux stimuli luminaux, et quels sont les mécanismes de libération d’hormones gastro-intestinales? Le principal avantage de cette technique est qu’elle nous permet d’étudier en détail les cellules entérochromaffine à l’aide de techniques unicell cellules, comme l’électrophysiologie. Kaitlyn Knutson et Peter Strege, les technologues exceptionnels qui ont mis au point ces techniques, feront la démonstration de la procédure.Pour commencer cette procédure, placez une aiguille de seringue de six millilitres remplie de PBS glacé dans le lumen du segment intestinal extrait. Utilisez les forceps de microdissection, pincez et scellez les intestins autour de l’aiguille de seringue, et rincez doucement six millilitres de PBS par le lumen pour rincer n’importe quelle matière fécale. Ensuite, inverser le tissu intestinal en tissant doucement les forceps de microdissection à travers le lumen, pincer une paroi intestinale, et de rétracter le tissu proximal à la pointe des forceps.Répé

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Dysfonctionnement des canaux Kv est associée à des arythmies cardiaques. Afin d'étudier les mécanismes moléculaires qui conduisent à des arythmies telles que nous utilisons un protocole systématique pour l'isolement des cardiomyocytes auriculaires et ventriculaires chez des souris knock-out canaux Kv auxiliaires sous-unités. Cardiomyocytes isolés peuvent alors être immédiatement utilisé pour les études électrophysiologiques cellulaires, biochimiques ou immunofluorescence (IF) essais.

Isolement et enregistrements Chaîne Kv en cardiomyocytes murins auriculaire et ventriculaire

Arginine-vasopressine (AVP) contrôle fine-tuning de l'homéostasie de l'eau du corps en facilitant la réabsorption de l'eau par les cellules rénales principales. Ici, nous présentons un protocole pour la culture de la médullaire interne de rat primaire recueillir les cellules des canaux appropriés pour l'élucidation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la réabsorption de l'eau AVP-médiation.

Culture primaire Rat collecteur médullaire interne les cellules des canaux

Nous démontrons un protocole de culture cellulaire pour l’étude directe des composants neuronaux et gliaux du système nerveux entérique. Une culture mixte neurone/glie sur lamelles de recouvrement est préparée à partir du plexus myentérique de souris adulte, ce qui permet d’examiner la fonction individuelle des neurones et de la glie par électrophysiologie, immunohistochimie, etc.

Une<em&gt; In-vitro</em&gt; Préparation des neurones entériques isolés et cellules gliales du Plexus myentérique de la souris adulte

Cette vidéo présente un protocole pour la réalisation d’enregistrements électrophysiologiques à fibre unique sur une préparation in vitro du nerf colorectum de souris.

In vitro caractérisation fonctionnelle de la souris colorectal afférente Endings

Une fois sorti du corps, le tissu neuronal est fortement influencée par les conditions environnementales, ce qui conduit à une dégradation éventuelle du tissu après 6 à 8 heures. En utilisant une méthode d'incubation unique, qui surveille de près et régule l'environnement extracellulaire du tissu, la viabilité des tissus peut être considérablement prolongée pour&gt; 24 h.

L&#39;incubation prolongée de aiguë Neuronal tissus pour électrophysiologie et Calcium-imagerie

Ce protocole décrit l'isolement et la culture de cellules intestinales petites souris mixtes. Ces cultures primaires intestinales permettent l'étude des voies de signalisation sous-jacents sécrétion de peptide de l'intestin en utilisant un certain nombre de techniques.

Cultures primaires mixtes de murine Petit Intestin destiné à l&#39;étude de la Gut hormone Sécrétion et imagerie de cellules vivantes de cellules entéroendocrines

Nous présentons un protocole qui combine l'isolation cellulaire et l'enregistrement de patch-clamp à cellules entières pour mesurer les propriétés électriques des cellules épithéliales dissociées primaires des épididymides de cauda de rat. Ce protocole permet d'étudier les propriétés fonctionnelles des cellules épithéliales épididymiques primaires afin d'élucider davantage le rôle physiologique de l'épididyme.

Enregistrements de puces et de cellules entières de cellules épithéliales primaires isolées de l&#39;épididyme

Nous décrivons une méthode pour la préparation des cellules lisses lisses fraîchement isolées de détrusor de spécimens humains de réservoir urinaire employant une procédure enzymatique de deux étapes. Les cellules DSM viables obtenues peuvent être étudiées par diverses techniques de cellules uniques, y compris l'électrophysiologie de patch-clamp d'amphotericin-B décrite pour révéler des propriétés physiologiques et pharmacologiques.

Préparation et utilisation des cellules musculaires lisses de Détrusor humain fraîchement isolées pour la caractérisation des courants de cation 9-Phenanthrol-sensibles

Nous présentons la méthodologie pour l'isolement des myocytes murines et comment obtenir des traces de tension ou de calcium simultanément avec des traces de raccourcissement sarcome à l'aide de la photométrie fluorescence avec des mesures numériques simultanées de géométrie cellulaire.

Imagerie optique des myocytes ventriculaires murines isolés

Ce protocole décrit une technique d’imagerie confocale permettant de détecter trois modes de fusion dans les cellules chromaffines surrénales bovines. Ces modes de fusion comprennent 1) la fusion étroite (également appelée kiss-and-run), impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, 2) la stay-fusion, impliquant l’ouverture des pores de fusion et le maintien du pore ouvert, et 3) la shrink-fusion, impliquant un rétrécissement des vésicules fusionnées.

Microscopie confocale pour mesurer trois modes de dynamique des pores de fusion dans les cellules chromaffines surrénales

Cette étude décrit un protocole pour générer des monocouches 2D d’organoïdes porcins dérivés de l’intestin grêle et du gros intestin. La croissance de ces monocouches est marquée par l’augmentation des valeurs TEER, indiquant une intégrité épithéliale robuste. De plus, ces monocouches présentent des réponses sécrétoires physiologiques dans les expériences en chambre d’Ussing après l’application de forskoline.

Organoïdes intestinaux porcins bidimensionnels reflétant les propriétés physiologiques de l’intestin natif

Découvrez l'électrophysiologie sur cellules entières pour étudier l'excitabilité des cellules entérochromaffines murines en culture primaire. Cette méthode permet d'analyser la réponse aux stimuli lumineux et la libération d'hormones gastro-intestinales.

Électrophysiologie germes entiers de cellules entérochromaffines murins cultivés primaires

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