Axée sur la plaque de culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans: préparation des échantillons pour l’étude des modifications métaboliques dans le diabète
24 août 2018
Ce protocole décrit une méthode pour la culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans , sur des milieux solides. Comme alternative à la culture liquide, ce protocole permet d’obtenir les paramètres de différentes échelles en culture axée sur la plaque. Cela augmente la comparabilité des résultats en omettant les différences morphologiques et métaboliques entre culture des médias liquides et solides.
Dans le domaine de C. elegans, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés qui nécessitent la production de grandes populations de nématodes et d’échantillons à l’aide de cultures sur plaques. Les principaux avantages de ce protocole sont sa facilité d’établissement et sa facilité de description, y compris les pièges et les applications. Après avoir obtenu une population synchronisée de nématodes, ajoutez environ un millilitre de tampon M neuf aux plaques et répartissez soigneusement le tampon en balançant les plaques.
Après cela, collectez les nématodes dans un tube de 15 millilitres. Maintenant, retournez le tube et utilisez un microscope pour évaluer la densité des nématodes. Ajustez la densité de la suspension au besoin et continuez à l’évaluer au microscope.
Appliquez 150 microlitres de suspension directement sur les plaques avec des pointes de pipette modifiées. Pour assurer une répartition égale des nématodes entre les plaques, inversez le tube de suspension à intervalles réguliers. Tout d’abord, lavez les nématodes à l’aide d’une pointe de pipette modifiée avec environ 500 microlitres de tampon M nine.
À l’aide du même tampon, continuez à détacher les nématodes jusqu’à ce que la plupart des animaux soient rassemblés en suspension. Ensuite, prélevez les nématodes avec une pointe de pipette modifiée et transférez-les sur une plaque avec OP50. Les pointes de pipette modifiées réduisent les contraintes de cisaillement et les dommages causés aux nématodes en raison d’un diamètre plus grand.
Ensuite, laissez sécher la plaque. Avant de prélever des échantillons, préparez de l’azote liquide pour congeler rapidement les nématodes collectés. Ensuite, placez le tampon M nine sur de la glace.
Appliquez un millilitre de tampon M nine sur chaque assiette et remuez doucement pour laver chaque assiette. Ensuite, prenez le volume de la mémoire tampon M neuf et transférez-le dans de nouveaux tubes de 15 millilitres. Centrifugez brièvement le tube à 800 fois g, avant de retirer la majeure partie du tampon M neuf.
Ensuite, lavez les échantillons trois fois avec 10 millilitres de tampon M neuf pour éliminer toutes les bactéries. À l’aide d’une pipette en verre, transférez chaque pastille dans un tube vide de 1,5 millilitre. À l’aide de la pipette en verre, prélever un millilitre de tampon M nine dans le deuxième tube de 1,5 millilitre, afin de rincer les nématodes de la paroi de la pipette.
Ensuite, lavez les nématodes restants des tubes de 15 millilitres et transférez-les dans les tubes d’échantillon. Ensuite, centrifugez les tubes d’échantillon à 19 000 fois g pendant une minute et retirez autant de surnageant que possible. Ensuite, scellez chaque tube avec un film de paraffine et congelez-les immédiatement dans de l’azote liquide.
Conservez les tubes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à la préparation du lysat. Ajoutez les mêmes volumes de billes d’oxyde de zirconium de 0,5 millimètre et deux fois le volume de tampon de lysat avec cocktail inhibiteur de protéinase à chaque échantillon congelé. Ensuite, placez les tubes dans un homogénéisateur pendant une minute à la vitesse neuf.
Centrifugez les échantillons pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et 19 000 fois g. Enfin, transférez le surnageant dans un nouveau tube sur de la glace et stockez-le à moins 80 degrés Celsius pour les expériences futures. Dans ce protocole, de grandes quantités de C. elegans ont été cultivées pour des applications dans la recherche sur le diabète.
Le nombre de nématodes collectés était corrélé au rendement protéique du lysat, ce qui démontre qu’il est possible d’obtenir un isolement quantitatif reproductible des protéines à l’aide de ce protocole. Des analyses par spectrométrie de masse du métabolite réactif méthylglyoxal et des produits finaux de glycation avancée formés par l’exposition au méthylglyoxal sont présentées ici. Les nématodes traités au glucose et les témoins ont été comparés.
Le transfert des nématodes à l’aide d’une pipette peut créer des contraintes de cisaillement, ce qui peut nuire aux nématodes. Les niveaux de stress oxydatif chez les nématodes pipetés et les nématodes transférés avec un fil métallique ne différaient pas en utilisant ce protocole. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme le western blot peuvent être effectuées, afin de répondre à des questions supplémentaires en protéomique.
Ce protocole facilite également les expériences qui relient plusieurs paramètres à la même population.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode de culture à grande échelle de Caenorhabditis elegans sur milieu solide. Cette approche facilite la production de populations et d'échantillons de nématodes en grand nombre, améliorant ainsi la comparabilité des résultats.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du développement
- Microbiologie
Contexte
- Caenorhabditis elegans est un organisme modèle largement utilisé.
- La culture sur boîte offre des avantages par rapport à la culture en milieu liquide.
- La compréhension de la dynamique des populations de nématodes est cruciale pour diverses applications de recherche.
- Cette méthode répond à des questions clés dans le domaine de C. elegans.
Objectif de l'étude
- Établir un protocole fiable pour la culture de C.elegans sur milieu solide.
- Permettre la production de populations synchronisées de nématodes.
- Faciliter les expériences nécessitant de grandes tailles d'échantillon.
Méthodes utilisées
- Synchronisation des populations de nématodes.
- Application du tampon M neuf aux boîtes.
- Évaluation microscopique de la densité de nématodes.
- Ajustement de la densité de la suspension selon les besoins.
Résultats principaux
- Mise en place réussie de cultures de nématodes à grande échelle.
- Amélioration de la comparabilité des résultats obtenus par culture sur boîtes.
- Identification des éventuels pièges dans le protocole.
- Applications dans divers contextes de recherche.
Conclusions
- Ce protocole fournit une méthode robuste pour la culture de C.elegans.
- Il améliore la capacité à réaliser des expériences à grande échelle.
- La méthode est simple et reproductible.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
La culture à grande échelle de C. elegans permet une isolation quantitative reproductible de protéines pour la découverte de biomarqueurs liés au diabète, soutenant la validation de cibles dans les complications neurodégénératives. Cette méthode fournit un protocole évolutif, minimisant les contraintes de cisaillement, pour l'analyse protéomique des AGEs et des ERO, directement applicable à la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de la découverte de médicaments. En facilitant la préparation synchronisée de populations dans des conditions contrôlées, elle améliore la fiabilité prédictive des modèles précliniques de la pathologie diabétique.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques reliant l'exposition au glucose à la formation de produits avancés de glycation (AGE) et d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans des modèles neuronaux.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles grâce à une corrélation reproductible entre le rendement protéique et le nombre de nématodes.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des portefeuilles en fournissant des données protéomiques quantitatives pour l'identification de candidats prometteurs dans les voies des complications du diabète.
Développement de criblages et de tests
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés pour des applications ultérieures de western blot et de spectrométrie de masse.
- Reproductibilité : Standardise la préparation des échantillons afin de minimiser l'impact physiologique et garantir des résultats protéomiques cohérents.
- Extensibilité : Permet l'intégration de multiples analyses dans des conditions de culture identiques, assurant une compatibilité avec le criblage à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Permet l'étude des complications diabétiques à l'aide de modèles de C. elegans présentant une accumulation de produits de glycation avancée (AGE) et d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), indépendamment de facteurs vasculaires perturbateurs.
- Continuité translationnelle : Assure le passage de la découverte à la validation préclinique en permettant une préparation uniforme des échantillons dans différentes conditions expérimentales.
- Progrès ajusté au risque : Fournit des lysats fiables pour l'analyse de biomarqueurs, réduisant ainsi les faux positifs lors de la priorisation des cibles.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant du test d'hypothèses à l'identification de candidats prometteurs jusqu'à la validation préclinique, en soutenant spécifiquement la recherche sur la neurodégénérescence liée au diabète.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les altérations métaboliques dans le diabète grâce à l'analyse quantitative des protéines et des métabolites.
- Écrans de sélection : Fournit des échantillons prêts à être analysés, avec une densité standardisée et une contrainte de cisaillement minimale, assurant une évaluation fiable des composés.
- Analytique : Permet la mesure par spectrométrie de masse du méthylglyoxal et des AGEs, fournissant des données quantitatives pour la comparaison des conditions.
- Recherche translationnelle : Relie la découverte de phénotypes neuronaux à la continuité préclinique par des protocoles protéomiques cohérents.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place une plateforme réutilisable pour la culture à grande échelle de nématodes dans plusieurs études liées au diabète.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des modèles de complications diabétiques.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité des flux de travail protéomiques, en minimisant la variabilité lors de la préparation des lysats.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'avancement ou d'abandon grâce à des données fiables sur les biomarqueurs, réduisant ainsi les risques biologiques en phase tardive des programmes contre le diabète.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des cibles ajustée au risque, fondée sur des données reproductibles de modulation des AGE et des ERO.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation de C. elegans et les techniques de synchronisation.
- Suppose un accès à des centrifugeuses, des homogénéisateurs et de l'azote liquide pour le traitement des échantillons.
- Exige une standardisation interéquipes de l'évaluation de la densité de suspension et des protocoles de lavage.
- Implique des ajustements à prendre en compte lors du transfert entre des boîtes ayant des conditions expérimentales différentes.
- Comprend des limites pratiques liées à l'atténuation des contraintes de cisaillement durant les étapes de pipetage, résolues par l'utilisation de pointes modifiées.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Title
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Large Scale Culture on Plates
1:15
Transfer of Large Amounts of Caenorhabditis elegans
1:52
Harvest of a Large Caenorhabditis elegans Sample
3:20
Protein Isolation for Mass Spectrometry
3:56
Results: Reproducible Quantitative Protein Isolation and Further Applications of Large-scale C. elegans Culture
4:47
Conclusion
