Name: La génération des Fractures fémorales fermées chez la souris : un modèle pour étudier la guérison osseuse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Découvrez la génération de fractures fémorales fermées chez la souris pour étudier la guérison osseuse. Cette méthode chirurgicale minimalement invasive permet d'explorer les mécanismes biologiques de réparation et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

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Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le Department of Defense (DoD) nous Army Medical Research et commande du matériel (USAMRMC) par le Congrès réalisé Medical Research programmes (CDMRP) (PR121604) et le National Institutes of Arthritis et troubles musculo-squelettiques et dermatoses (NIAMS), NIH R01 AR068332 à Uma Sankar.

La procédure suivante a été réalisée avec l’approbation de l’Indiana University School of Medicine institutionnels Animal Care et utilisation Comité (IACUC). Toutes les chirurgies de survie ont été effectuées dans des conditions stériles, tels que décrits par les NIH guidelines. Douleur et risque d’infections ont été gérés avec bon analgésiques et d’antibiotiques pour assurer une issue positive.
1. anesthésie et préparation
<ol><li>Peser la souris et il anesthésier avec un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) administré par la voie intrapéritonéale de (I.P.). Placez la souris dans une cage vide et surveiller jusqu'à ce qu’il est entièrement sous sédation.</li>
	<li>Veiller à ce que la souris est sous sédation en utilisant un réflexe de pincée d’orteil. Appliquer une pommade ophtalmique à ses yeux pour les protéger du dessèchement.</li>
	<li>Enlever la fourrure de la jambe droite. Essuyer le site chirurgical avec une base d’iode gommage et 70 % d’éthanol. Frottez le champ opératoire à partir du centre du genou et de faire un balayage circulaire vers l’extérieur. Répétez cette x 3 avec gommage frais, se terminant par l’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Administrer une dose préopératoire d’analgésie de chlorhydrate de buprénorphine (0,03 mg/kg) par voie sous-cutanée pour la gestion de la douleur postopératoire immédiate.</li>
	<li>Placez votre souris sur un coussin chauffant recouvert par un bloc chirurgical stérile.</li>
</ol>2. abord chirurgical
Remarque : Avant la rupture, le poids et la hauteur de chute doivent être empiriquement déterminées pour la souche spécifique, âge et sexe des souris avant la chirurgie. Cette intervention chirurgicale est optimisée pour les souris mâles de C57BJ6 à 10 semaines d’âge.
<ol><li>Placez la souris sur le dos et Fléchissez le genou de la jambe du dispositif. À l’aide d’une lame de bistouri Swann-Morton, faire une incision de 1,5 cm, centrée sur l’articulation du genou.</li>
	<li>Latéralement, déplacer la rotule à l’aide de pinces pour exposer l’extrémité distale du fémur. Insérer une aiguille hypodermique de 1,5 po en acier inoxydable de calibre 25 depuis longtemps au centre du sillon trochléen, sur toute la longueur du canal médullaire de manière rétrograde et par le biais de l’extrémité proximale du fémur. Prendre une radiographie pour assurer le positionnement correct de la broche. Remarque : L’aiguille doit se fermer la face dorsale de la souris pour créer un chemin pour le guide.</li>
	<li>Passer un fil-guide de tungstène long calibre 36 4 po par l’intermédiaire de l’axe de l’aiguille, accéder par le moyeu dans le fémur distal et quitter le biseau sur la face dorsale de la souris.</li>
	<li>Suite à la mise en place réussie du fil guide, retirez l’aiguille de calibre 25 en tirant doucement sur le moyeu en maintenant le membre et le guide en place. Confirmer le placement du fil guide par radiographie.</li>
	<li>Maintenez un poids 391 g d’une hauteur de 34,6 cm au-dessus du disque d’impact (Figure 1 a). Position du fémur horizontalement à travers les deux appuient points, tels que les régions intertrochantériennes et supracondylienne du fémur reposent sur les enclumes de soutien (Figure 1 b) et le côté latéral du membre est face au point de chargement (Figure 1 ). Déposer le poids et retirez délicatement la souris l’appareil immédiatement après la rupture.</li>
	<li>Confirmer l’emplacement de la fracture par radiographie.</li>
	<li>Insérer les tubes hypodermiques en acier inoxydable de calibre 24 sur le guide pour stabiliser le fractures du fémur. NOTE : Cette application peut nécessiter une force telle que le point d’entrée a été généré à l’aide d’une aiguille d’un diamètre inférieur. Cette différence de diamètre empêche une migration potentielle de la tige de calibre 24 à travers l’extrémité proximale du fémur. La profondeur d’insertion peut ressentir manuellement car le tuyau émoussé respecte la corticale osseuse du grand trochanter.</li>
	<li>Confirmer la position de la barre d’acier et la stabilisation du fémur fracturé par rayons x avant d’enlever le fil de guidage.</li>
	<li>Couper le tube excédentaire à l’extrémité distale du fémur à l’aide de pinces coupantes. Enterrer le tube exposé sous la surface des condyles à l’aide de pinces à appliquer une force vers le bas douce, en veillant à ne pas déloger l’articulation du genou.</li>
	<li>Repositionner la rotule à l’aide de pinces. Refermer l’incision avec une suture résorbable 5-0.</li>
</ol>3. postopératoire gestion
<ol><li>Après la chirurgie, les souris peuvent être injectés avec jusqu'à 500 µL de stérile saline via la route I.P. pour les aider dans leur récupération post-opératoire.</li>
	<li>Surveiller les animaux sur un lit de récupération chauffée jusqu'à ce qu’ils éveillent de chirurgie. Une fois ambulatoire, renvoyez-les à leur cage.</li>
	<li>Continuer de suivre de près les souris pendant plusieurs jours après la chirurgie pour s’assurer qu’ils sont correctement la guérison et retrouver la mobilité. Administrer une analgésie buprénorphine chlorhydrate (0,03 mg/kg) par voie sous-cutanée toutes les 6 h pendant 3 jours après la chirurgie et au besoin par la suite. Évitez d’utiliser des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) comme ils auraient dû être divulgués pour effet de compromettre la guérison osseuse après une chirurgie.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs de ce manuscrit n’ont rien à divulguer. Les auteurs déclarent qu’il n’y a aucune restriction sur l’accès complet à tous les matériaux utilisés dans l’étude rapportée dans ce manuscrit.

L’objectif de cette intervention chirurgicale est de générer des fractures fémorales fermées normalisées chez la souris. Un avantage majeur de ce modèle est que la fixation interne a lieu après la génération de la fracture, évitant ainsi une angulation de la tige intramédullaire. Peut-être l’aspect le plus important de ce protocole est la génération d’une rupture transversale standardisée à la mi-diaphyse fémorale, comme la géométrie de la fracture dépend de la force de flexion appliquée et le positionnement du membre po...

Les fractures sont parmi les blessures les plus courantes qui se produisent à l’appareil locomoteur et sont associés à un énorme fardeau socio-économique, y compris les frais de traitement qui devraient pour dépasser les $ 25 milliards par an dans les États-Unis1, 2. Bien que la majorité des fractures guérissent sans incident, la guérison est associée à des interruptions de service importante et perte de productivité. Environ 5 à 10 % de toutes les fractures aboutissent à une guérison retardée ou le non syndiqués, en raison d’âge ou d’autres conditions de santé chronique sous-jacente, tels que l’ostéoporose et le diabète sucré3,4,5. Aucun traitement pharmacologique n’approuvé par la FDA est actuellement disponible pour favoriser la guérison osseuse efficace et raccourcir le temps de récupération.
Guérison des fractures est un processus complexe et très dynamique impliquant la coordination de plusieurs types de cellules. Une compréhension globale des événements cellulaires et moléculaires associés à la régénération osseuse est donc important d’identifier des cibles thérapeutiques qui permettent d’accélérer ce processus. Comme pour d’autres maladies humaines, la mise en place d’un modèle animal très favorable et reproductible est cruciale dans l’étude de la guérison osseuse. Des animaux plus gros comme les moutons et les porcs, ont des propriétés de remodelage osseux et biomécanique semblables aux humains, mais sont chers, exigent des temps de guérison important et ne prêtent pas facilement à des manipulations génétiques6. En revanche, petits modèles animaux, tels que les rats et les souris, offrent de nombreux avantages, notamment une facilité de manipulation, de faibles coûts d’entretien, les cycles de reproduction court et une guérison plus court délai7. En outre, le génome de la souris est séquencé, ce qui permet la génération des variants génétiques et la manipulation rapide. Ainsi, la souris est un système puissant modèle pour étudier les maladies humaines, les blessures et réparer les8. Chez l’homme, maladies concomitantes comme le diabète sucré et de l’ostéoporose augmentent la probabilité d’une guérison retardée. Un certain nombre de modèles de souris existants est disponibles pour étudier les effets des comorbidités telles que l’ostéoporose et le diabète sucré sur les lésions osseuses et guérison. Les patients souffrant d’ostéoporose ont une ossification nettement diminué durant les derniers stades d’une fracture9de guérison. Ovariectomisées (OVX) souris présentent une perte osseuse rapide et retardée osseuse guérison similaire à celle observée dans l’ostéoporose postménopausique10,11. En outre, de nombreux modèles de souris de type I et diabète de type II imitent les phénotypes masse osseuse faible et la guérison des fractures altérée chez les humains,11. En outre, les modèles murins fracture servent une plateforme polyvalente pour étudier les processus biologiques complexes qui se produisent dans le CAL et explorent de nouvelles stratégies thérapeutiques qui accélèrent la régénération des tissus osseux.
Malgré les différences dans la structure osseuse et le métabolisme, l’ensemble du processus de fracture osseuse guérison reste très similaire chez les souris et les humains, comportant une combinaison d’endochondral et ossification intramembranaires suivie de remodelage osseux. L’ossification endochondrale implique le recrutement de cellules progénitrices aux régions moins mécaniquement stables autour de l’écart de la fracture, où ils se différencient en chondrocytes qui l’hypertrophie et minéraliser le cartilage pour produire un cal mou. La deuxième vague de cellules progénitrices infiltrer les cals et se différencient en ostéoblastes matures qui sécrètent le nouvel OS matrice12,13,14,15. Au cours de l’ossification intramembranaires, progéniteurs sur les surfaces du périoste et endostique directement se différencient en matrice sécrétant des ostéoblastes et facilitent le comblement de la fracture écart9,11,12 ,,13. Ensemble, l’os endochondral et ossifications intramembranaires déboucher sur l’élaboration d’un cal dur, qui est également remodelé au fil du temps pour former un osseuse secondaire solide capable de supporter des charges mécaniques13,14 ,15. Chez l’homme sain, le processus de guérison prend environ 3 mois, comparées à seulement 35 jours en souris16.
Guérison des fractures a souvent étudiée en utilisant soit des modèles chirurgicale ouverte ou fermée17. Ouvrez les approches chirurgicales, telles que la génération d’un défaut de taille critique ou compléter ostéotomie, normaliser la localisation de la lésion et la géométrie pour réduire les écarts causés par des fractures comminutives. Ostéotomies servent un excellent modèle pour étudier le mécanisme sous-jacent derrière un déboîtement car la guérison est souvent retardée par rapport aux fractures fermées. En outre, une fixation rigide externe est nécessaire pour stabiliser l’OS osteotomized, ce qui signifie que la régénération dépendra principalement de l’ossification intramembranaires. Les approches chirurgicales ouvertes utilisent périphériques tels que les clous verrouillage pin-clips et gâches pour assurer la stabilité axiale et de rotation pour le membre fracturé ; Toutefois, ces appareils sont coûteux et nécessitent beaucoup plus de temps dans la chirurgie18,19,20,21. En revanche, les modèles fermés sont stabilisées avec un dispositif de fixation simple intramédullaire, permettant suffisamment instabilité stimuler la guérison endochondrale. Ainsi, les modèles de fracture fermée imite pas facilement les conditions d’un déboîtement. Techniques de fixation interne, tels qu’intramédullaire épingles, clous et vis de compression, sont avantageux car ils sont bon marché, facile à utiliser et minimiser le temps en chirurgie21,22,23. Dans certains cas, intramédullaire broches sont insérées avant la rupture, mais la flexion de la tige intramédullaire peut conduire à l’angulation ou déplacement du fémur fracturé, contribuant à une taille variable de cals et de guérison. L’emplacement de la fracture et la géométrie sont plus difficiles à standardiser les modèles fermés, telles qu’elles sont créées à l’aide d’un dispositif de flexion trois points, dans lequel un poids est tombé sur la diaphyse. Cependant, avec la bonne technique, cette approche chirurgicale offre des résultats rapides et constants. En outre, le modèle de fracture fermée sert d’outil cliniquement pertinent pour l’étude des fractures causées par l’impact de grande force ou stress mécanique22.
Ce protocole chirurgical est une adaptation de méthodes précédemment décrites à l’aide d’une tige intramédullaire pour stabiliser la fracture fémur chez le rat et la souris22,24,25. Tout d’abord, une aiguille intramédullaire de petit diamètre est insérée dans l’encoche de l’intracondylar d’établir un point d’entrée, et un fil-guide est introduit avant de générer une rupture transversale à la mi-diaphyse fémorale à l’aide d’une gravité dépendante trois-points dispositif de pliage. À la suite de la génération réussie d’une fracture fermée du fémur, une tige intramédullaire d’un plus grand diamètre est incorporée sur le guide métallique pour stabiliser le fractures du fémur. Cette méthode permet d’éviter les risques de cicatrisation retardée causée par l’angulation de la tige intramédullaire lors de la rupture, car le placement de la fracture de la tige permet la stabilisation de repositionnement et optimisée du fémur lésée.

<table><tbody><tr><td>Oster Minimax Trimmer</td><td>Animal World Network</td><td>78049-100</td><td></td></tr><tr><td>POVIDONE-IODE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>395516</td><td></td></tr><tr><td>POMMADE OPHTALMIQUE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0490117</td><td></td></tr><tr><td>Styker T/Pump Recirculateur d’eau chaude</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 1ml Sub-Q</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>309597</tr><tr><td>ENCORE Sensi-Touch PF</td><td>Moore Medical LLC</td><td>30347</td><td>Latex Gant chirurgical non poudré</td></tr><tr><td>PrecisionGlide 25G Aiguilles hypodermiques Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-49</td><td></td></tr><tr><td>Fil de tungstène à ultra-haute température,</td> <td>McMaster-Carr</td><td>3775K37</td><td>Diamètre de 0,005 po, bobine de 1/16 lb, acier inoxydable 304 de 380 pi de long</td></tr><tr><td>, tube à paroi mince de 24 g</td><td>Microgroup Inc</td><td>304H24TW-5FT</td><td></td></tr><tr><td>#15 Lames de Scalpel</td><td>Outils Scientifiques Fins</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>#10 Lames de Scalpel</td><td>Outils Scientifiques Fins</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Pince à motif étroit</td><td>Outils Scientifiques Fins</td><td>11002-12</td><td>Dentelée/Droite/12cm</td></tr><tr><td>Pince à Iris</td><td>Outils Scientifiques Fins</td><td>11066-07</td><td>1x2 Dents/Droite/7cm</td></tr><tr><td>Ciseaux Dissector</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>14081-09</td><td>Lames minces/Inclinées sur le côté/Tranchantes-Tranchantes/10cm</td></tr><tr><td>Ciseaux fins</td><td>Outils</td> scientifiques <td>fins 14058-11</td><td>ToughCut/Droit/Tranchant-Tranchant/11,5 cm</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Porte-aiguille avec coupe-suture</td><td>Outils</td> scientifiques <td>fins 12002-12</td><td>Droit/Dentelé/12cm/avec serrure</td></tr><tr><td>Crile Hemostat</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>13004-14</td><td>Coupe-fil de tungstène dentelé / droit / 14cm</td></tr><tr><td></td><td>ACE Surgical Supply Co., Inc.</td><td>08-051-90</td><td>ACE #150 Coupe-fil, pointes en carbure de tungstène</td></tr><tr><td>3-0 VICRYL Suture</td><td>Ethicon Suture</td><td>J423H</td><td>3-0 VICRYL UNDYED 27" FS-2 CUTTING</td></tr><tr><td>piXarray 100 Système de radiographie numérique d’échantillons</td><td>Bioptics, Inc</td><td></td><td>Système à rayons X d’armoire</td></tr><tr><td>Einhorn Dispositif de pliage en 3 points</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Construit sur mesure</td></tr></tbody></table>

la génération des fractures fémorales fermées chez la souris : un modèle pour étudier la guérison osseuse

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Fractures osseuses imposent un énorme fardeau socio-économique pour les patients, en plus d’affecter considérablement leur qualité de vie. Les stratégies thérapeutiques qui favorisent la guérison osseuse efficace sont inexistants et très en demande. Efficaces et reproductibles des modèles animaux de fractures de guérison sont nécessaires pour comprendre les processus biologiques complexes associées à la régénération osseuse. Nombreux modèles animaux de la guérison des fractures ont été générés au cours des années ; Cependant, des modèles murins de fracture ont récemment émergé comme des outils puissants pour étudier la guérison osseuse. Une variété de modèles ouverts et fermés ont été développées, mais le modèle de fracture fémorale fermée s’impose comme une méthode simple pour générer des résultats rapides et reproductibles de façon physiologiquement pertinente. L’objectif de ce protocole chirurgical consiste à générer des fractures fémorales fermées unilatérales chez la souris et de faciliter une stabilisation après fracture du fémur en insérant une tige intramédullaire en acier. Bien que les dispositifs comme un clou ou une vis offrent une plus grande stabilité axiale et de rotation, l’utilisation d’une tige intramédullaire fournit une stabilisation suffisante pour les résultats de guérison uniformes sans produire de nouveaux défauts dans le tissu osseux ou d’endommager à proximité de soft tissus. L’imagerie radiographique est utilisé pour surveiller la progression de la formation de cals, consolidation osseuse et ultérieures de remodelage du cal osseux. Résultats de guérison osseuse sont généralement associées à la force de l’os cicatrisé et mesurés avec l’essai de torsion. Pourtant, comprendre les premiers événements cellulaires et moléculaires associés à la réparation de la fracture est critique dans l’étude de la régénération des tissus osseux. Le modèle fermé fracture fémorale chez les souris avec fixation intramédullaire sert une plate-forme attrayante pour étudier la guérison des fractures osseuses et d’évaluer des stratégies thérapeutiques pour accélérer la guérison.

La mise en œuvre réussie de cette intervention chirurgicale a été suivie avec l’imagerie radiographique. Étapes clés incluent l’insertion d’une aiguille intramédullaire, le placement d’un fil-guide, l’induction d’une rupture transversale à la mi-diaphyse fémorale et la stabilisation correcte avec une tige intramédullaire (Figure 2 aje - 2Aiv). La progression de guérison de la Cal de fracture a été suivie avec des images radio...

Le modèle murin fracture fémorale fermée est une plateforme puissante pour étudier la guérison des fractures et nouvelles stratégies thérapeutiques pour accélérer la régénération osseuse. L’objectif de ce protocole chirurgical est de générer des fractures fémorales fermées unilatérales chez la souris à l’aide d’une tige intramédullaire en acier pour stabiliser le fémur.

La génération des Fractures fémorales fermées chez la souris : un modèle pour étudier la guérison osseuse

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la recherche sur la guérison des fractures sur les mécanismes biologiques de réparation et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour promouvoir une cicatrisation osseuse efficace. Le principal avantage de cette technique est qu’elle sert de procédure peu invasive pour générer des fractures standardisées afin d’étudier la cicatrisation des fractures osseuses chez la souris. Yong Li et Anuradha Valiya Kambrath, techniciens de notre laboratoire, feront la démonstration de l’intervention chirurgicale.Après avoir confirmé le niveau approprié de sédation par pincement des orteils, appliquez la pommade sur les yeux d’une souris mâle anesthésiée de 10 semaines et retirez la fourrure du membre postérieur droit. En commençant par le centre du genou et en effectuant un balayage circulaire vers l’extérieur, désinfectez la peau exposée avec trois gommages séquentiels à base d’iode et à 70 % d’éthanol, et placez la souris sur un coussin chauffant recouvert d’un champ chirurgical stérile en position couchée. Fléchissez le genou de la jambe opératoire et utilisez une lame de scalpel pour faire une incision de 1,5 cent

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Méthodologie améliorée pour l’étude de l’ostéogenèse postnatale par ossification intramembraneuse dans un modèle de lésion de la moelle osseuse murine

Découvrez la génération de fractures fémorales fermées chez la souris pour étudier la guérison osseuse. Cette méthode chirurgicale minimalement invasive permet d'explorer les mécanismes biologiques de réparation et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

La génération des Fractures fémorales fermées chez la souris : un modèle pour étudier la guérison osseuse

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