Évaluation de l’Interface synaptique des cellules primaires humaines T du sang périphérique et le tissu lymphoïde

L’approche dont nous allons parler aujourd’hui a été dérivée pour comparer les propriétés et les activités fonctionnelles des cellules T du sang dérivé des tissus et périphériques. L’importance du sujet est illustrée par le fait que les lymphocytes T du sang périphérique ne représentent que 20 % du total des lymphocytes T d’un corps. Il est très essentiel de pouvoir étudier un petit nombre de lymphocytes T dérivés de tissus, et c’est exactement ce que nous avons accompli.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle nécessite un plus petit nombre de cellules et de plus petits volumes de réactifs que les techniques traditionnelles. Commencez par utiliser une pince en polypropylène de type ciseaux pour immerger les lamelles en verre dans une solution acide de piranha fraîchement préparée pendant 25 à 30 minutes. À la fin du lavage, rincez sept fois les lamelles dans un volume frais d’eau ultra-pure à chaque lavage.

Ensuite, mettez les lamelles humides de côté pour laisser l’eau restante s’écouler du verre propre. Lorsque les lamelles sont sèches, aliquote deux microlitres du mélange liposomale final précisément au centre d’un canal de glissement auto-adhésif à l’intérieur d’une hotte d’écoulement stérile. Et alignez immédiatement mais soigneusement une lamelle propre et sèche avec la glissière pour permettre à celle-ci d’être doucement abaissée sur le côté collant de la glissière.

Et utilisez l’anneau extérieur de la pince en polypropylène de type ciseaux pour appliquer une légère pression sur le contact périphérique de la lamelle avec la glissière, en vous assurant que la glissière est bien fixée à la glissière pour éviter les fuites. Retournez ensuite la diapositive et utilisez un marqueur permanent pour dessiner quatre points autour du bicouche sur le côté externe de l’ensemble de diapositives. Avant la première injection, désignez un port du canal comme port d’entrée et l’autre comme port de sortie, en maintenant cette désignation tout au long de l’expérience.

Pour éviter la formation de bulles, insérez l’extrémité de la pointe de la pipette directement dans l’orifice d’entrée jusqu’à ce que vous sentiez le joint en caoutchouc du canal coulissant pénétrer avec la pointe. Remplissez lentement le canal avec 50 microlitres de tampon de dosage à chaud. Injecter 200 microlitres de chlorure de nickel(II) dans une solution bloquant la caséine dans l’orifice d’entrée.

Et retirez 50 microlitres de tampon de l’orifice de sortie. Après une incubation de 45 minutes, retirez l’excès de solution de caséine de l’orifice de sortie. Injecter 100 microlitres d’un ICAM-1 dans une solution de streptavidine dans l’orifice d’entrée pour une incubation de 45 minutes à température ambiante.

À la fin de l’incubation, retirez l’excès de solution protéique de l’orifice de sortie. Et lavez la bicouche deux fois avec 100 microlitres de tampon de dosage par lavage. Étiquetez ensuite les bicouches avec 100 microlitres d’anticorps anti-CD3 conjugués au fluoro-4 pendant 45 minutes à température ambiante.

Suivi de deux lavages dans 100 microlitres de tampon de dosage par lavage, comme démontré. Pour imager les interactions bicouches des lymphocytes T, placez la lame sur la platine chauffée à 37 degrés Celsius d’un microscope à fluorescence à réflexion interne totale, ou TIRF. Et ajustez la platine à l’aide des marques d’encre pour centrer la bicouche sur l’objectif de puissance 100.

Pour l’imagerie à libération de granules, ajoutez des fragments d’anticorps anti-CD107A conjugués à la fluorescence à la suspension de lymphocytes T CD4. Et mettez à nouveau en suspension les cellules marquées dans 50 microlitres de tampon de dosage pour l’injection dans l’orifice d’entrée du canal de lame. Sélectionnez ensuite le nombre approprié de champs expérimentaux et enregistrez des images de chaque champ une fois par minute pendant 30 minutes après l’injection.

Dans cette expérience représentative, aucune différence n’a été observée entre les lymphocytes T CD8 qui formaient des synapses immunologiques classiques sur les bicouches lipidiques construites dans la cellule d’écoulement ou la lame d’écoulement multicanaux. Lors de l’interaction bicouche lipidique, les lymphocytes T CD4 établissent des synapses immunitaires matures, mais libèrent ou non des granules, libèrent des granules sans formation de synapses matures, ou ne forment pas de synapses et ne libèrent pas de granules. Il convient de noter que les lymphocytes T CD4 dérivés de cellules mononucléées du sang périphérique sont capables de commencer à libérer des granules presque deux fois plus rapidement que les cellules CD4 dérivées des ganglions lymphatiques.

Lors de cette procédure, il est important de maintenir une température constante et de pipeter lentement afin qu’il n’y ait pas de bulles formées. En plus de notre capacité à étudier une interface bicouche de lymphocytes T, cette approche nous permettrait également d’effectuer une coloration intercellulaire des lymphocytes T qui ont touché la bicouche. Ce qui faciliterait considérablement une quantité d’informations pouvant être utilisées pour décrire des lymphocytes T particuliers dérivés de tissus lymphoïdes ou d’autres tissus.

N’oubliez pas que travailler avec une solution piranha est extrêmement dangereux et qu’il est crucial que vous portiez un EPI approprié lors de cette procédure.