Name: Une approche In Vitro à la thérapie photodynamique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
Description: Apprenez une approche in vitro de la thérapie photodynamique pour étudier l'apoptose cellulaire. Ce protocole utilise le 5-ALA et la lumière bleue pour optimiser les traitements contre le cancer de la peau.

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Les auteurs n’ont aucun remerciements.

1. préparation des cellules
<ol><li>Plaque 20 000 cellules dans 2 mL de milieu de culture dans chaque puits d’une plaque de 6 puits utilisant une technique stérile dans une armoire de sécurité biologique.</li>
	<li>Placer les plaques 6 puits dans un incubateur humidifié (37 ° C, 5 % de CO2) pendant 24 heures afin de permettre aux cellules d’adhérer aux plaques.</li>
</ol>2. préparation des photosensibilisants pour le traitement des cellules
<ol><li>Préparer des solutions 5-ALA 0,5, 1 et 2 mM en milieu de culture. Si le sérum fœtal (SVF) est un ingrédient de milieu de culture, préparer et traiter des cellules avec le 5-ALA en solution de milieu de culture avec 0,1 % FBS pour des incubations. 11 , 12 dans ce cas, CSC-13 cellules n’exigent pas des BF, donc 5-ALA a été ajouté directement au milieu sans sérum des kératinocytes, additionné de l’extrait pituitaire bovine et facteur de croissance épidermique.</li>
	<li>Aspirer le milieu de culture et laver les cellules avec au moins 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
	<li>Aspirer les PBS et ajouter 2 mL de solutions 5-ALA 0, 0,5, 1 ou 2 mM dans les puits ou plaques séparées.</li>
	<li>Incuber les cellules avec 0, 0,5, 1 ou 2 mM 5-ALA sur un bloc pour 30 min. de chauffage de 36 à 37 ° C protègent les cellules de l’exposition à la lumière durant l’incubation à l’aide de papier d’aluminium.</li>
	<li>Aspirer les solutions de 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA et laver les cellules avec 2 mL de PBS.</li>
	<li>Aspirer les PBS et ajouter 2 mL de milieu de culture pour l’irradiation de lumière bleue.</li>
</ol>3. blue Light photothérapie
<ol><li>Avant d’irradier les cellules, activer le dispositif de lumière bleu (p. ex., diode électroluminescente, fluorescente ou halogène) et faites fonctionner pendant un cycle (1 000 s) pour réchauffer l’appareil. Le dispositif de lumière bleu devrait avoir une longueur d’onde de sortie de 417 +/-5 nm. Permettant à l’appareil de fonctionner pendant un cycle avant les traitements s’assure que la longueur d’onde de lumière bleue et le rayonnement sont cohérentes au cours de la phase de photoactivation.</li>
	<li>Un photomètre permet de mesurer le rayonnement à la surface cellulaire. L’irradiance lumineuse bleue à la surface cellulaire devrait être de 10 mW/cm2. La distance entre la lumière et les cellules peut devoir être ajustée pour obtenir un éclairement énergétique de 10 mW/cm2 selon l’intensité de la source lumineuse.</li>
	<li>Placer les groupes de traitement ALA 0, 0,5, 1 et 2 mM sur une surface noire sous la source de lumière bleue. Irradier les cellules avec la lumière bleue pour 1 000 s (16 min et 40 s) pour une fluence totale de 10 J/cm2. Suite de photoactivation de lumière bleue, les cellules sont prêts pour l’analyse.</li>
</ol>4. collecte et coloration
<ol><li>Préparer le tampon du flux conformément aux directives de fabricant (voir Table des matières).</li>
	<li>Aspirez le milieu de culture et laver les cellules avec 2 mL de PBS.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA et permettre aux cellules de se détacher pendant environ 3 à 5 min. Les cellules peuvent être examinés au microscope afin de confirmer le détachement cellulaire.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu de culture (ou PBS) avec 10 % sérum de veau fœtal pour désactiver la trypsine.</li>
	<li>Recueillir suspension cellulaire dans des tubes de flux marqués 5 mL.</li>
	<li>Essorage tube de mesure de 5 mL dans une centrifugeuse à 201 x g pendant 5 min. aspirer solution sans enlever le culot cellulaire.</li>
	<li>Ajouter 200 µL de tampon de flux avec l’anticorps conjugué d’annexine-V (1 µL d’annexine-v par 39 µL de tampon de flux) pour chaque échantillon.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules et les placer dans l’incubateur (37 ° C, 5 % de CO2) pendant 20 min pour autoriser la liaison annexine-V.</li>
	<li>Ajouter 3 µL de 7-AAD dans chaque échantillon. Incuber 5 min à température ambiante.</li>
</ol>5. cytométrie
<ol><li>Suivez les instructions de fabricant de cytomètre en flux pour la mise en place (voir Table des matières).</li>
	<li>Recueillir et analyser des échantillons par cytométrie en flux. 13
</li>
	<li>Effectuer une comparaison statistique de traitement et les groupes de contrôle à l’aide de l’analyse de variance (ANOVA)14. Comparer les moyens des groupes de traitement à la moyenne du contrôle avec test de Dunnett, une analyse post hoc .</li>
</ol>

<ol><li>Morton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+Dermatology+Forum+guidelines+on+topical+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">European Dermatology Forum guidelines on topical photodynamic therapy.</a> European Journal of Dermatology. 25 (4), 296-311 (2015).</li>
<li>Ozog, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%3A+A+clinical+consensus+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%3A+Official+Publication+for+American+Society+for+Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy: A clinical consensus guide.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. 42 (7), 804-827 (2016).</li>
<li>Abrahamse, H., Hamblin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+photosensitizers+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">New photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).</li>
<li>Josefsen, L. B., Boyle, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+and+the+development+of+metal-based+photosensitisers%5BTitle%5D)+AND+%22Metal-Based+Drugs%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy and the development of metal-based photosensitisers.</a> Metal-Based Drugs. 2008, 276109(2008).</li>
<li>Ohgari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+involved+in+%CE%B4-aminolevulinic+acid+%28ALA%29-induced+photosensitivity+of+tumor+cells%3A+Relation+of+ferrochelatase+and+uptake+of+ALA+to+the+accumulation+of+protoporphyrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms involved in δ-aminolevulinic acid (ALA)-induced photosensitivity of tumor cells: Relation of ferrochelatase and uptake of ALA to the accumulation of protoporphyrin.</a> Biochemical pharmacology. 71 (1-2), 42-49 (2005).</li>
<li>Kessel, D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+photodamage+and+PDT-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 42 (2), 89-95 (1998).</li>
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<li>Sakamoto, F. H., Lopes, J. D., Anderson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+for+acne+vulgaris%3A+A+critical+review+from+basics+to+clinical+practice%3A+Part+I.+Acne+vulgaris%3A+When+and+why+consider+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy for acne vulgaris: A critical review from basics to clinical practice: Part I. Acne vulgaris: When and why consider photodynamic therapy.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 63 (2), 183-193 (2010).</li>
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<li>Allison, R. R., Moghissi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncologic+photodynamic+therapy%3A+Clinical+strategies+that+modulate+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Oncologic photodynamic therapy: Clinical strategies that modulate mechanisms of action.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 10 (4), 331-341 (2013).</li>
<li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+ultra+short+photodynamic+therapy%3A+heating+fibroblasts+during+sub-30-minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+increases+photodynamic+therapy-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%3A+Official+Publication+for+American+Society+for+Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Thermal ultra short photodynamic therapy: heating fibroblasts during sub-30-minute incubation of 5-aminolevulinic acid increases photodynamic therapy-induced cell death.</a> Dermatologic Surgery: Official Publication for American Society for Dermatologic Surgery. , (2017).</li>
<li>Koo, E., Austin, E., Mamalis, A., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+ultra+short+sub-30+minute+incubation+of+5-aminolevulinic+acid+photodynamic+therapy+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of ultra short sub-30 minute incubation of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy in vitro.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 49 (6), 592-598 (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5650/annexin-v-and-propidium-iodide-labeling">Cell Biology. Annexin V and Propidium Iodide Labeling.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Mamalis, A., Koo, E., Sckisel, G., Siegel, D., Jagdeo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+impact+of+thermal+aminolaevulinic+acid+photodynamic+therapy+on+apoptosis+and+reactive+oxygen+species+generation+in+human+dermal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent impact of thermal aminolaevulinic acid photodynamic therapy on apoptosis and reactive oxygen species generation in human dermal fibroblasts.</a> British Journal of Dermatology. 175 (3), 512-519 (2016).</li>
<li>Gilaberte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+intrinsic+factors+involved+in+the+resistance+of+squamous+cell+carcinoma+to+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cellular intrinsic factors involved in the resistance of squamous cell carcinoma to photodynamic therapy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 134 (9), 2428-2437 (2014).</li>
<li>Yoon, H. K., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cm403505s">Nanophotosensitizers engineered to generate a tunable mix of reactive oxygen species, for optimizing photodynamic therapy, using a microfluidic device.</a> Chemistry of Materials. 26 (4), 1592-1600 (2014).</li>
<li>Chen, Y. -C., Lou, X., Zhang, Z., Ingram, P., Yoon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cancer+cell+sphere+formation+for+characterizing+the+efficacy+of+photo+dynamic+therapy+in+3D+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput cancer cell sphere formation for characterizing the efficacy of photo dynamic therapy in 3D cell cultures.</a> Scientific Reports. 5, 12175(2015).</li>
<li>Campos, C., Inada, N., Kurachi, C. <a target="_blank" href="https://www.spiedigitallibrary.org/conference-proceedings-of-spie/10476/104760S/Low-dose-PDT-on-breast-cancer-spheroids/10.1117/12.2290915.short?SSO=1">Low-dose PDT on breast cancer spheroids.</a> Optical Methods for Tumor Treatment and Detection: Mechanisms and Techniques in Photodynamic Therapy XXVII. , (2018).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+temperature+on+5-aminolevulinic+acid-based+photodynamic+reaction+in+keratinocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photodermatology%2C+Photoimmunology+%26+Photomedicine%22%5BJournal%5D)">The influence of temperature on 5-aminolevulinic acid-based photodynamic reaction in keratinocytes in vitro.</a> Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (2), 83-88 (2010).</li>
<li>Juzeniene, A., Juzenas, P., Kaalhus, O., Iani, V., Moan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+Accumulation+of+protoporphyrin+IX+after+topical+application+of+5-aminolevulinic+acid+and+its+methylester+and+hexylester+derivatives+in+normal+mouse+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on Accumulation of protoporphyrin IX after topical application of 5-aminolevulinic acid and its methylester and hexylester derivatives in normal mouse skin.</a> Photochemistry and Photobiology. 76 (4), 452-456 (2002).</li>
<li>Novak, B., Heesen, L., Schary, N., Lubbert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+different+illumination+parameters+on+protoporphyrin+IX+induced+cell+death+in+squamous+cell+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">The influence of different illumination parameters on protoporphyrin IX induced cell death in squamous cell carcinoma cells.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 21, 385-392 (2018).</li>
</ol>

DUSA/Sun pharmaceutiques fournis 5-ALA et le dispositif de lumière BLU-U. Ce manuscrit a été appuyé par résiduel du Dr Jagdeo financement. Le contenu ne représente pas les vues du ministère américain des anciens combattants ou le gouvernement des États-Unis.

Il y avait une augmentation significative de la CSC-13 l’apoptose après incubation de 30 min de 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA suivie par 1 000 s de lumière bleue. Ces résultats sont en accord avec nos recherches déjà publiées démontrant que le 5-ALA incubations de 30 min, suivie d’une activation lumineuse bleue conduit à une augmentation dose-dépendante du pourcentage de cellules de fibroblaste subissant l’apoptose12, 14.
Cette approche expérimentale pour étudier PDT a les avantages et les limites. Les méthodes décrites sont conformes à la pratique clinique comme un PS commercialement disponible et source de lumière ont été utilisés. Les chercheurs peuvent personnaliser les méthodes avec différents types de cellules, PSs, sources lumineuses et paramètres de l’irradiation. Cependant, il y a des limites de cette approche que ce protocole est conçu pour les cellules adhérentes cultivées dans une monocouche. Dans la pratique clinique, des différences dans la pathologie d’architecture ou de la maladie de tissu (c.-à-d., une hyperkératose ou fibrose) peuvent diminuer l’absorption de PS ou15de la pénétration de la lumière. Ainsi, les doses de traitement et les résultats expérimentaux ne peuvent pas correspondre directement à la pratique clinique. Modèles de tumeur sphéroïde et puce microfluidique ont été étudiés comme des méthodes pour mieux reproduire tumeur microenvironnements16,17,18. Sphéroïdes ont des niches cellulaires internes et externes qui peuvent différentiellement incorporent les photosensibilisants et représentent la tumeur hétérogène architecture. D’autres chercheurs ont utilisé des puces microfluidiques pour écran traitement et de livraison vasculaire des photosensibilisants. Cependant, puces microfluidiques peuvent être coûteux pour développer ou difficile à mettre en œuvre pour les chercheurs peu familiers avec la technique. En outre, les sphéroïdes et puces microfluidiques peuvent ne pas refléter le traitement clinique des cancers de la peau dans laquelle photosensibilisants sont directement appliquées à la surface de la tumeur sans diffusion vasculaire. Les chercheurs peuvent doivent évaluer les avantages et les inconvénients de culture monocouche, modèles de tumeur sphéroïde et de puces microfluidiques pour étudier PDT dans des systèmes différents de la maladie. Comme il n’y a pas de cellules immunitaires ou matrice extracellulaire, il n’est pas possible de déterminer comment la PDT affecte les interactions cellule-cellule complexe. Les chercheurs peuvent doivent confirmer in vitro les résultats expérimentaux à l’aide de modèles animaux et des essais cliniques. Pour atteindre la grande validité inter-test, il est important de maintenir cohérente incubation et paramètres de lumière lors de l’exécution des expériences in vitro PDT.
Température est connue pour altérer l’efficacité du PDT19. Une étude a démontré que la mort cellulaire, absorption de 5-ALA, PP-IX formation et cytokines peuvent être améliorées en incubant les cellules avec le 5-ALA à des températures jusqu'à à 44 ° C19. Températures d’incubation supérieure à 44 ° C peuvent conduire à la mort cellulaire induite thermique et températures d’incubation inférieure à 20 ° C peuvent entraîner non significative 5-ALA absorption et l’accumulation de19. Il est recommandé que les chercheurs effectuent des incubations PS sur un bloc de chauffage réglable en température à une température constante au contrôle de confusion potentiellement les effets thermiques. En outre, il est important à incuber le photosensibilisateur pendant une durée suffisante pour permettre la conversion des 5-ALA en PP-IX. Dans ce protocole, CSC-13 cellules ont été incubées avec le 5-ALA pendant 30 min, qui avec succès induit l’apoptose des cellules. Nous avons démontré précédemment qu’une incubation de 10 min de 5-ALA n’augmente pas sensiblement l’apoptose des fibroblastes par rapport au témoin non traité fibroblastes11,14. PP-IX commence à s’accumuler dans la peau de souris après que 5-ALA est en incubation pendant six minutes à 37 ° C. C’est pourquoi, après dix minutes d’incubation 5-ALA, il peut-être pas une accumulation suffisante de PP-IX pour induire l’apoptose de cellules20. Nous recommandons une période d’incubation minimale de 20 à 30 min pour 5-ALA basé sur nos précédentes études11,14. Les chercheurs peuvent doivent optimiser la période d’incubation, basée sur le laboratoire, photosensibilisateur d’intérêt, type de cellules et indication clinique. Expériences de titrage et d’optimisation des anticorps peuvent être effectués pour de meilleurs résultats en utilisant les directives du fabricant. Autres tests d’intérêt peuvent être réalisés après photoactivation de lumière bleue dont dihydroethidium quantification de cytométrie en flux de ROS. 14
Variation de quantité de lumière livré par unité de surface (p. ex., rayonnement solaire) et la dose d’irradiation totale (c'est-à-dire, fluence) pendant la phase de photoactivation susceptibles d’affecter la formation de ROS et de l’apoptose cellulaire21. La relation entre la fluence, éclairement et le temps peut être décrit par l’équation suivante :
Fluence (J/cm2) = éclairement énergétique (W/cm2) x temps (s)
Car fluence dépend de l’heure, allongeant ou en raccourcissant les phases de photoactivation peut modifier l’efficacité du traitement. L’irradiance est proportionnel à la distance au carré entre la source lumineuse et le tissu cible. Ainsi, si la lumière est trop loin, il peut-être pas suffisamment d’énergie lumineuse envoyée vers les tissus ciblés pour exciter le PS. Subsidiairement, l’éclairement énergétique peut être augmentée par la lumière se reflétant sur les surfaces environnantes. Par conséquent, nous recommandons de procéder irradiations légers avec les plaques de culture cellulaire placés sur une surface noire pour empêcher la réflexion de la lumière. Les chercheurs peuvent acquérir commercialement disponibles ou approuvés par la FDA bleus diodes électroluminescentes et appareils fluorescents à utiliser dans les expériences de PDT, mais ces dispositifs peuvent avoir des puissances différentes et une uniformité du champ lumineux. Un photomètre de longueur d’onde spécifique devrait servir à mesurer l’éclairement énergétique à la surface des cellules et l’uniformité du champ lumineux avant chaque expérience pour des résultats uniformes. Un diffuseur disponible dans le commerce peut servir à améliorer l’uniformité du champ, si nécessaire.
En résumé, nous avons décrit une approche in vitro d’enquêter sur les PDT en détaillant la théorie, méthodes expérimentales, limites, pièges potentiels et des recommandations pour l’optimisation. PDT est qu'une recherche clinique utile de la procédure et in vitro peut permettre le développement de nouveaux PSs, optimisation de protocoles et de nouvelles indications de PDT.

La thérapie photodynamique (PDT) est un acte médical qui implique d’incubation d’un photosensibilisateur exogène appliquée (PS) suivie de visible photoactivation léger pour induire l’apoptose des cellules. La Federal Drug Administration (FDA) a approuvé la PDT pour le traitement de la kératose actinique (Ka) et lignes directrices cliniques recommandent PDT comme traitement de certains cancers cutanés non mélanocytaires et vulgaris d’acné,1,2. Nouvelles utilisations non dermatologiques pour PDT incluent le traitement des cancers gastro-intestinaux, la prostate et gynécologiques3. PDT est une modalité thérapeutique avantageuse car elle est associée à des événements indésirables minimes et cicatrisation2, non invasif et faible coût.
Dans la première étape de PDT, un PS est appliqué et s’accumule dans les cellules2. Aux États-Unis, l’acide 5-aminolévulinique topique (5-ALA) est couramment pour traiter l’AKs. Pendant l’incubation phase, 5-ALA est convertie en protoporphyrine IX (PP-IX) par l’intermédiaire de la voie de biosynthèse heme dans des cellules constituées de3. Cancer et les cellules ont diminué l’activité de ferrochélatase, qui convertit la protoporphyrine IX (PP-IX), le produit final, hème. Ainsi, les cellules de cancers s’accumulent PP-IX par rapport aux cellules normales4,5. Cette accumulation de PP-IX dans le cancer et les cellules de précancer par rapport aux tissus environnants permet PDT une approche ciblée avec des effets secondaires minimes. Irradiation lumineuse conduit à la génération de (ROS) les espèces réactives de l’oxygène lorsque l’oxygène accepte des électrons excités de PP-IX. PP-IX a une absorption de pic dans le spectre ultraviolet avec des petits pics dans tout le spectre de lumière visible, y compris la lumière bleue et rouge2. Formation de ROS pourrait déboucher sur l’apoptose des cellules, rupture de la membrane, dommages mitochondrial, modulation du système immunitaire, la prolifération des kératinocytes et collagène chiffre d’affaires de6,7,8,9 , 10.
PDT a été développé dans les années 1970 et est une évolution de la modalité thérapeutique3. Le protocole approuvé par la FDA pour le traitement de l’AKs recommande 5-ALA peau une incubation de 14 à 18 h, mais les incubations de 1 à 2 h sont couramment utilisées en pratique clinique2. In vitro, nous avons montré que des incubations plus courtes de 5-ALA 15 min augmente l’apoptose des cellules fibroblastes par rapport aux fibroblastes non traitée11,12. En outre, roman chlorine, phtalocyanine et PSs à base de nanoparticules sont étudiées afin d’améliorer l’efficacité de PDT3. Ici, nous présentons une méthode in vitro pour étude PDT dans un carcinome épidermoïde adhérent cellules. Dans ce protocole, CSC-13 les cellules sont incubées avec 0, 0,5, 1,0 et 2 mM 5-ALA pendant 30 min et photoactivées à 417 nm bleu pour 1 000 s. Le critère d’évaluation principal est l’apoptose et nécrose, telle que mesurée par cytométrie annexine-V et 7-Aminoactinomycine D (7-AAD). Ce protocole de traitement est conçue pour simuler les PDT et peut être ajusté à l’étude de l’utilisation de PDT avec d’autres lignées cellulaires, photosensibilisants, températures d’incubation ou longueurs d’onde de photoactivation. Préparation des groupes témoins supplémentaires peut-être être nécessaire, y compris sans tache, seul un fluorophore tachée, contrôles négatifs et positifs pour la cytométrie en flux. Un examen approfondi de la théorie, des protocoles, conception expérimentale et blocage pour cytométrie en apoptose/nécrose peut être trouvé ailleurs13.

<table><tbody><tr><td>Sérum de kératinocytes sans moyen&nbsp ;</td><td>Thermofisher</td><td>17005042</td><td>Milieu de culture pour cellules SSC-13</td></tr><tr><td>DMEM low glucose glutamax</td><td>Thermofisher</td><td>10567022</td><td>Milieu de culture possible pour d’autres types de cellules</td></tr><tr><td>Plaques de culture à 6 puits</td><td>Thermofisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td>Pour le comptage et le placage de cellules</td></tr><tr><td>Lumière BLU-U&nbsp ;</td><td>DUSA</td><td>Demande du fabricant</td><td>D’autres lampes à LED bleues, fluorescentes ou halogènes peuvent être utilisées.</td></tr><tr><td>5-ALA</td><td>DUSA</td><td>Demande du fabricant</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>C17032</td><td></td></tr><tr><td>FlowCellect Annexin Red Kit</td><td>Millipore Sigma&nbsp ;</td><td>FCCH100108&nbsp ;</td><td>L’iodure de propidium peut remplacer le 7-AAD. Livré avec annexin-V, 7-AAD et tampon</td></tr><tr><td>de débit FACSCanto II</td><td>BD</td><td>Demande du fabricant</td><td>Tout cytomètre de flux peut être utilisé&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chambre de comptage</td><td>Hausser</td><td>3120</td><td>Pour le comptage et le placage de cellules</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo Demande</td><td>du fabricant</td><td>Logiciel d’analyse par cytométrie en flux</td></tr></tbody></table>

une approche in vitro à la thérapie photodynamique

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

La thérapie photodynamique (PDT) est un acte médical qui implique d’incubation d’un photosensibilisateur exogène appliquée (PS) suivie de visible photoactivation léger pour induire l’apoptose des cellules. La Federal Drug Administration a approuvé la PDT pour le traitement de la kératose actinique et lignes directrices cliniques recommandent PDT comme traitement de certains cancers cutanés non mélanocytaires et l’acné vulgaire. PDT est une modalité thérapeutique avantageuse car il est bon marché, non invasif et associé à des effets secondaires minimes et effrayer. Dans la première étape de PDT, un PS est appliqué et s’accumule dans les cellules. Irradiation lumineuse subséquente induit la formation d’espèces réactives de l’oxygène, qui pourrait déboucher sur l’apoptose des cellules, rupture de la membrane, lésions mitochondriales, modulation du système immunitaire, la prolifération des kératinocytes et chiffre d’affaires de collagène. Ici, nous présentons une méthode in vitro pour étude PDT dans une lignée de cellules adhérentes. Ce protocole de traitement est conçue pour simuler les PDT et peut être ajusté à l’étude de l’utilisation de PDT avec diverses lignées cellulaires, photosensibilisants, températures d’incubation ou longueurs d’onde de photoactivation. Carcinome épidermoïde cellules ont été incubées avec 0, 0,5, 1,0 et 2 mM l’acide 5-aminolévulinique (5-ALA) pendant 30 min et photoactivées à 417 nm bleu pour 1 000 s. Le critère d’évaluation principal était l’apoptose et nécrose, telle que mesurée par cytométrie annexine-V et 7-Aminoactinomycine D. Il y avait une augmentation dose-dépendante de l’apoptose des cellules après trente minutes d’incubation de 5-ALA. Pour atteindre la grande validité inter-test, il est important de maintenir cohérente incubation et paramètres de lumière lors de l’exécution des expériences in vitro PDT. PDT est qu'une recherche clinique utile de la procédure et in vitro peut permettre le développement de nouveaux PSs, optimisation de protocoles et de nouvelles indications de PDT.

Après CSC-13 cellules ont été incubées pendant 30 min avec 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA et irradiés avec 1 000 s de bleu clair, il y avait une augmentation dose-dépendante de l’apoptose cellulaire. Total apoptose (moyenne ± écart de moyenne) est de 3,94 ± 0,34, 7.90 ± 0,52, 23.86 ± 0,52 et 38,33 ± 1,81 après 30 min d’incubation avec 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA, respectivement et 1000 secondes du bleu clair (Figure 1). Nous avons comparé le pourcentage moyen d’apoptose cellulaire entre 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA couvés groupes utilisant l’analyse de la variance. Les cellules traitées avec 1 et 2 mM 5-ALA a eu une augmentation significative dans l’apoptose des cellules par rapport à 0 mM 5-ALA les cellules traitées. Figure 2 a montre flux représentatif par cytométrie en flux Gate de dispersion vers l’avant (FSC) par rapport à la diffusion latérale (SSC) pour CSC-13 cellules incubées en présence de 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA. Le blocage du cercle entoure la population de cellules CSC-13. Pour cette expérience, 7500 événements ont été collectés et la porte de la population cellulaire CSC-13 capturé au moins 90 % des événements. Figure 2 b montre un terrain représentatif de la 7-AAD sur l’axe x et l’annexine-V sur l’axe y. Les populations de cellules sont bloquées en quatre quadrants (Q1 à Q4) pour distinguer les cellules apoptotiques. Q1 (haute annexine-v, faible 7-AAD) représente des cellules en apoptose précoce. Q2 (haute annexine-v, haut 7-AAD) représentent des cellules subissant une fin apoptose ou nécrose. T3 (faible annexine-v, haut 7-AAD) représente des cellules subissant une nécrose. Représente (faible annexine-v, faible 7-AAD) Q4 cellules subissant pas l’apoptose ou nécrose. Pour calculer le pourcentage de cellules en apoptose, nous avons ajouté le pourcentage de cellules en Q1 et Q2. Manque d’uniformité dans la longueur de la période d’incubation de 5-ALA, la température d’incubation ou dose d’irradiation de photoactivation peut-être altérer l’efficacité PDT. La figure 3 montre une parcelle de cytométrie de flux d’écoulement annexine-V et 7-AAD représentante lorsque la température d’incubation est variée (c.-à-d., 27, 36 ou 42 ° C). Il y avait une augmentation dépendant de la température dans l’apoptose.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig1.jpg"> Figure 1 : augmentation de la Dose-dépendante l’apoptose après trente minutes d’incubation de 5-ALA 5-ALA incubés à 36 ° C pendant trente minutes suivis par 1 000 s de lumière bleue dans les cellules de la CSC-13. Barres représentent le pourcentage moyens annexine-V cellules positives dans chaque traitement et le groupe témoin. Des expériences ont été effectuées en trois exemplaires, technique. Signification statistique a été déterminée par analyse de la variance, avec p &lt; 0,05 précédé d’un astérisque (*). Barres d’erreur représentent la moyenne ± erreur-type de la moyenne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig2.jpg"> Figure 2 : parcelles représentant Flow Cytometry. (A) représentant avant vs côté scatter cytometry diagrammes en unités arbitraires (UA) pour x - axes et y pour 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA incubé les cellules. Pour cette expérience, 7500 événements ont été collectés et la porte de la population cellulaire CSC-13 capturé 90 % des événements. (B) représentant annexine-V vs 7-AAD cytométrie parcelles en pour - et axe x y 0, 0,5, 1 et 2 mM 5-ALA cellules couvés. Q1 : les cellules apoptotiques précoces, Q2 : fin cellules apoptotic/nécrotiques, Q3 : cellules nécrotiques et Q4 : cellules viables. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig3.jpg"> Figure 3 : incubation 5-ALA à différentes températures peut-être altérer l’efficacité PDT. Cytométrie en flux représentatif annexine-V vs 7-AAD parcelles pour les axes x et y - pour CSC-13 cellules incubées avec 0,5 mM 5-ALA à 27, 36 et 42 ° C. Q1 : les cellules apoptotiques précoces, Q2 : fin cellules apoptotic/nécrotiques, Q3 : cellules nécrotiques et Q4 : cellules viables. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58190/58190fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

La thérapie photodynamique (PDT) est un acte médical qui consiste à l’incubation d’un photosensibilisateur exogène appliquée (PS) suivie de photoactivation de lumière visible pour induire l’apoptose. Nous présentons un protocole en vitro PDT conçu pour simuler des PDT qui peut-être être utilisé pour étudier les différences en incubation de PS et paramètres de traitement par la lumière.

Une approche In Vitro à la thérapie photodynamique

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la thérapie photodynamique, également connue sous le nom de PDT. Les questions auxquelles on peut répondre en utilisant cette méthode comprennent la durée d’incubation d’un photosensibilisateur, ou l’utilisation de différents paramètres dans l’expérience, tels que la modification de la température en chauffant ou en refroidissant les cellules. Cette technique peut faciliter le développement in vitro de nouveaux photosensibilisants, protocoles et indications pour la PDT.Commencez par placer deux fois 10 à la quatrième cellules dans deux millilitres de milieu de culture dans chaque puits d’une plaque à six puits en utilisant une technique stérile pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, lavez les cellules avec au moins deux millilitres de PBS et traitez les cultures avec des dilutions de zéro, zéro virgule cinq, un ou deux millimètres de 5-ALA fraîchement préparé. Placez ensuite l’assiette sur un bloc chauffant à 36-37 degrés Celsius pendant 30 minutes à l’abri de la lumière.Pendant la procédure, nous recommandons aux chercheurs d’utiliser un bloc chauffant pour obtenir une température constante tout au long de la période d’incubation. De plus, nous recommandons de couvrir les cellules pendant la période d’incubation avec du papier d’aluminium pour éviter l’activation précoce du photosensibilisateur. À la fin de l’incubation, lavez les cellules de chaque puits avec deux millilitres de PBS.Et rafraîchissez les cultures avec deux millilitres de milieu de culture frais pour l’irradiation à la lumière bleue. Avant d’irradier les cellules, réchauffez le dispositif de lumière bleue à une longueur d’onde de sortie de 417 nanomètres pendant un cycle de 1 000 secondes et utilisez un photomètre pour mesurer l’irradiance à la surface de la cellule, en ajustant la distance de la lumière pour obtenir l’irradiance appropriée en fonction de l’intensité de la source lumineuse. Placez ensuite les cellules traitées au 5-ALA sur une surface noire sous la lumière bleue pendant 1 000 secondes pour une fluence totale de 10 joules par centimètre carré.Lors de la photoactivation, nous vous recommandons de placer les cellules sur une surface noire pour éviter la réflexion de la lumière et un dosage incohérent. À la fin du traitement de photothérapie, lavez les cellules de chaque puits avec deux millilitres de PBS et détachez les cellules avec un millilitre de 0,25 % de trypsine-EDTA par puits. Après trois à cinq minutes, confirmez le détachement et désactivez la trypsine avec 10 % FBS et PBS.Transférez les cellules de chaque puits dans des tubes d’écoulement individuels de cinq millilitres et collectez les cellules par centrifugation. Ajoutez 200 microlitres de tampon d’écoulement avec l’anticorps annexine-V conjugué à chaque échantillon. Remettez les cellules en suspension et placez les tubes dans l’incubateur pendant 20 minutes pour permettre la liaison de l’annexine-V.À la fin de l’incubation, ajoutez trois microlitres de 7-AAD à chaque échantillon et incubez à nouveau à température ambiante pendant cinq minutes, suivi d’une analyse de l’échantillon effectuée selon les protocoles standard d’analyse par cytométrie en flux. Après cinq traitements de photothérapie à l’ALA et à la lumière bleue, une augmentation dose-dépendante de l’apoptose cellulaire est observée. Pour calculer le pourcentage de cellules subissant une apoptose, on additionne le pourcentage de cellules dans les quadrants à haut taux d’annexine-V, 7-AAD à faible taux et à haut taux d’annexine-V et 7-AAD élevé.Des incohérences dans la durée des cinq périodes d’incubation de l’ALA, la température d’incubation ou la dose d’irradiation par photoactivation peuvent altérer l’efficacité de la photothérapie, entraînant une augmentation de l’apoptose en fonction de la température, par exemple. À la suite de cette procédure, d’autres techniques, y compris la RTQPCR et le western blot, peuvent être effectuées pour déterminer comment la PDT modifie l’expression des gènes et l’activité des protéines. Cette méthode permet aux chercheurs qui s’intéressent à la thérapie photodynamique de découvrir les effets sur les cellules cancéreuses de la peau et d’autres maladies de la peau in vitro.

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