Méthodes permettant d’évaluer le rôle de c-Fos et Dusp1 dans la dépendance de l’oncogène

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines thérapeutiques du cancer, tels que l’identification des gènes clés impliqués dans la dépendance oncogène. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise la dépendance oncogène qui est commune à beaucoup de cancers entraînés par kinase donc il est applicable aux types multiples de tumeur. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la leucémie, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, comme les tumeurs solides telles que le cancer du poumon, les tumeurs cérébrales et les tumeurs pancréatiques.

En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal en raison du manque d’expérience en biologie moléculaire et physiologie cellulaire. Pour commencer, récoltez les os des jambes à partir d’une souris euthanasiée. Nettoyez les tissus des os à l’aide d’un scalpel.

Ensuite, placez les os dans le PBS froid sur la glace et écraser les os avec un pilon. Après cela, filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire à cellules de 70 micromètres dans un tube de bouchon à vis de 50 millilitres avec une pipette de 10 millilitres. Lavez le mortier et le pilon plusieurs fois avec du PBS froid et ajoutez la suspension cellulaire au tube de 50 millilitres.

Centrifugeuse suivante de la moelle osseuse et enlever le supernatant avec le vide et pipette en verre. Resuspendez la pastille cellulaire en 5 millilitres de PBS. À l’aide d’une pipette, ajouter lentement la moelle osseuse en suspension au sommet du polycharose à température ambiante.

Après cela, faire tourner le polys saccharose à 400 Gs pendant 20 minutes avec le frein éteint. Après centrifugation, recueillir l’interface nuageuse totale des cellules mononuclées avec une pipette et la transférer dans un nouveau tube de 15 millilitres. Porter le volume à 10 millilitres avec PBS et retirer 20 microlitres pour compter.

Après centrifugation, jeter le supernatant et placer la pastille sur la glace. Ensuite, resuspendez la pastille cellulaire dans PBS avec EDTA et BSA. Ajouter des microbilles CD117 à la suspension cellulaire et du vortex pour mélanger.

Après cela, incuber la suspension pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, porter le volume jusqu’à 10 millilitres avec plus de PBS avec EDTA et BSA et centrifugeuse à 1200 G à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Utilisez un vide pour enlever le supernatant et suspendre la pastille cellulaire dans PBS avec EDTA et BSA.

Ajoutez ensuite 3 millilitres de PBS avec EDTA et BSA à un support magnétique avec une colonne magnétique et laissez-le couler dans un tube de collecte. Une fois que le tampon se termine à travers la colonne, ajouter la suspension cellulaire et lui permettre de circuler à travers la colonne dans le tube de collecte. Ajoutez ensuite 5 millilitres de PBS de plus avec EDTA et BSA à la colonne et rincez-le immédiatement avec le piston.

Retirer le piston et répéter la chasse d’eau avant de compter les cellules. Après avoir centrifugé les cellules, enlever le supernatant et suspendre la pastille cellulaire dans l’IMDM complet pour la culture. Culture des cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.

Tout d’abord, combinez l’ADN plasmide rétroviral avec le plasmide d’emballage, le chlorure de calcium et l’eau dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter ensuite 500 microlitres de HBS à un autre tube de 1,5 millilitre. Ajouter le mélange de transfection drop-wise au tube contenant HBS tout en mélangeant simultanément avec le vortexer réglé au réglage le plus bas.

Incuber le mélange de transfection à température ambiante de 20 à 30 minutes. Pendant la période d’incubation, ajouter de la chloroquine aux cellules HEK et les garder dans l’incubateur. Après avoir ajouté le mélange de transfection, incuber les cellules pendant 8 heures dans un incubateur de 37 degrés Celsius 5%CO2 changer le média cellulaire en ajoutant 14 millilitres de nouveaux médias DMEM10 très lentement.

Pipetting lentement contre la paroi du plat aide à empêcher tout décapage des cellules HEK. Puis incuber les cellules pendant la nuit dans l’incubateur de 37 degrés Celsius 5%CO2. Utilisez une seringue de 10 millilitres pour recueillir le supernatant viral.

Attachez ensuite un filtre à seringues de 0,45 micromètre à la seringue. Plongez le supernatant viral dans un nouveau tube de collection. Recueillir le supernatant viral environ 16 heures plus tard.

Après cela, ajouter deux millilitres de fragment de fibronectine humaine recombinante dans PBS à 6 plaques de culture de puits non traitées. Le lendemain, utilisez une pipette pour enlever la fibronectine des plaques. Bloquer les assiettes avec 2%BSA en PBS et incuber les assiettes à température ambiante pendant 30 minutes.

Utilisez un aspirateur pour enlever bsa et laver les plaques avec PBS avant de l’enlever avec un vide. Après cela, ajoutez immédiatement le supernatant viral filtré et centrifugez la plaque pendant deux heures. Utilisez un aspirateur pour enlever le surnatant et faire tourner la plaque à nouveau.

Ensuite, retirez le supernatant avec un vide et lavez les puits recouverts de pelage viral avec PBS. Retirez le PBS avec un vide, ajoutez les cellules c-Kip plus souris précédemment cultivés aux puits recouverts de virus. Après centrifugation, incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

48 heures après la transduction, pelleter les cellules par centrifugation et les réutiliser dans le tampon FACS 1. Décongelez d’abord la cellulose méthylique avec des cytokines pour souris à température ambiante. Puis aliquot 3 millilitres de cellulose méthylique dans un tube FACS.

Ajouter 100 microlitres de la suspension cellulaire avec les inhibiteurs appropriés à 3 millilitres de cellulose méthylique. Puis vortex de la suspension à haute pendant 10 à 30 secondes. Après que la plupart des bulles d’air s’échappent, utilisez une seringue de 1 millilitre pour plaquer 1 millilitre du média en trois plaques de répétition.

Placer les assiettes dans une grande boîte de Pétri avec un plat ouvert contenant de l’eau stérile. Couvrez ensuite la grande boîte de Pétri et couvez les cellules à 37 degrés Celsius. Préparer la tache de chlorure d’iodonitrotetrazolium en dissolvant 10 milligrammes du chlorure d’iodonitrotetrazolium dans 10 millilitres d’eau.

Filtre stériliser la solution de coloration avec une seringue de verrouillage Luer équipée d’un filtre de 0,2 micromètre. Dans le capot de culture tissulaire, ajouter 100 microlitres de la solution de coloration drop-wise autour de la plaque CFU. Puis incuber les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture cellulaire.

Enfin, après que les colonies ont tourné une couleur brun rouge foncé, utilisez un fond blanc dans le capot stérile de culture de tissu pour prendre des photos de la plaque tachée de CFU. Dans ce protocole, de multiples analyses impartiales de l’expression des gènes ont été utilisées pour identifier la composante génétique qui orchestre la dépendance oncogène. Pour valider le rôle de c-Fos et de Dusp1 comme cible thérapeutique dans la leucémie, leur surexpression a été confirmée avec des cellules exprimant l’oncogène BCR-ABL1.

L’analyse par RT-qPCR et blotting occidental a confirmé que les deux ont été induits par BCR-ABL1 et que leur expression est augmentée par le facteur de croissance IL-3. YFP plus cellules exprimantes ont été triés via FACS pour d’autres analyses in vitro et in vivo. Les résultats ont démontré que la suppression de c-Fos et du Dusp1 à elle seule inhibait les nombres de CFU.

Les cellules dépourvues de c-Fos et de Dusp1 ont été considérablement compromises dans leur capacité à former des colonies et le traitement à l’imatinib a éliminé tous les CFUs, ce qui indique que la perte de c-Fos et de Dusp1 est synthétiquement mortelle pour l’expression BCR-ABL1. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine du cancer pour explorer les réseaux génétiques et les gènes qui conduisent à la dépendance oncogène et comment ces gènes affectent leur réponse particulière dans les modèles muraux et les patients humains. N’oubliez pas que le travail avec des rétrovirus et des échantillons de patients peut être extrêmement dangereux et des pratiques de laboratoire sûres devraient être observées lors de l’exécution de cette procédure.