Digital Polymerase Chain Reaction Assay for la Variation génétique chez un Patient sporadiques de la polypose adénomateuse familiale en utilisant le Format de puce-in-a-tube

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des tests génétiques, telles que la détection du mosaïcisme et les tests génétiques basés sur la biopsie liquide. Le principal avantage de cette technique est la détection à haut débit de la fraction d’allèles de faible variante. Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic des tumeurs, car la détection de mutations oncogéniques à haute sensibilité peut contribuer à la médecine de précision.

Commencez cette expérience en ajoutant 10 L de tampon d’échantillon d’ADN dans les tubes d’une bandelette de 8 tubes. Ajoutez ensuite 1 microlitre d’échelle d’ADN dans le premier tube de la bande de 8 tubes, et un microlitre d’ADN génomique de l’échantillon dans chacun des tubes restants. Utilisez la fixation de microplaque pour mélanger le contenu de la bande de 8 tubes en tourbillonnant pendant une minute.

Placez la bandelette, les pointes de pipette et un appareil à gel dans un instrument d’électrophorèse. Appuyez sur le bouton de démarrage pour démarrer la course. Une fois l’analyse terminée, vérifiez l’électrophérogramme sur l’écran pour confirmer que le marqueur inférieur contenu dans le tampon d’échantillon d’ADN est correctement attribué sur l’électrophérogramme.

Si ce n’est pas le cas, attribuez manuellement le marqueur en mode électrophérogramme du logiciel. Ensuite, dans le mode région du logiciel, spécifiez la région de taille de l’ADN génomique pour calculer automatiquement la concentration d’ADN. Ajoutez des amorces, des sondes et de l’ADN génomique précédemment conçus à une nouvelle bandelette de 8 tubes pour atteindre un volume total de 15 L.

Ajoutez la plate-forme de chargement sur les copeaux intégrés dans la nouvelle bande de 8 tubes, puis placez la bande de tubes dans le chargeur automatique. Assurez-vous qu’il y a un contact entre les copeaux et la plate-forme de chargement. Ensuite, placez un curseur de chargement dans la plate-forme et utilisez un butoir pour maintenir le curseur hors du chargeur.

Pipetez 15 L du mélange PCR près de l’extrémité du curseur, puis appuyez sur le bouton du chargeur pour faire fonctionner le chargeur pendant une minute. Retirez la bande tubulaire du chargeur après le passage et placez-la dans un activateur d’étanchéité. Poussez avec précaution le couvercle coulissant et le bord du couvercle supérieur.

Faites fonctionner l’activateur d’étanchéité pendant environ deux minutes. Si l’étanchéité est incomplète, indiquée par une flaque de liquide, répétez le passage pendant une minute supplémentaire. Ajouter 230 L de liquide d’étanchéité dans les tubes.

Placez la bande tubulaire dans le thermocycleur et exécutez la PCR comme décrit dans le protocole. S’il y a une répartition inégale des cloisons positives, ajustez la température ou la durée de la PCR. Pour détecter et analyser l’intensité de fluorescence des produits de PCR, placez la bande tubulaire sur le gabarit de détection et ajoutez 6 mL d’eau distillée.

Éliminez toutes les bulles d’air visibles à l’aide d’une pointe de pipette. Chargez le gabarit dans le détecteur. Dans le logiciel de détection, sélectionnez les onglets Fluorescence, Expérience, puis Échantillon NTC, puis cliquez sur le bouton RUN pour démarrer l’exécution.

Une fois l’exécution terminée, confirmez le tracé de position, l’histogramme et le nuage de points 2D. Pour recueillir le produit PCR, retirez le liquide d’étanchéité du tube. Ajoutez 100 L de tampon TE et agitez vigoureusement pendant 30 secondes.

Centrifugez brièvement les tubes dans une centrifugeuse de table et procédez comme décrit dans le protocole textuel pour terminer la collecte du produit PCR. Les graphiques de position créés par PCR numérique montrent une fluorescence HEX jaune dans les échantillons de patients et de père, indiquant la présence de la variante T de l’allèle APC, mais pas dans l’absence de contrôle de matrice. Seul l’ADN génomique des patients contient une variante C, comme le montre une fluorescence verte de FAM.

Comme le confirment les diagrammes de dispersion, le patient et le père sont positifs pour HEX, ou variante T, alors que seul le patient présente la présence de la variante C. La fraction d’allèle variante, ou VAF, calculée par DPCR, était de 13,2 %, similaire aux 12,7 % obtenus par le séquençage de nouvelle génération. D’autre part, les VAF des parents et des donneurs sains des patients étaient inférieurs à 0,1 %L’électrophérèse des produits DPCR collectés et concentrés confirme que la taille du fragment prédit est de 123 paires de bases dans l’ADN des patients et des parents. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder le banc propre, par exemple en utilisant une unité de filtre de ventilateur.