Name: Digital Polymerase Chain Reaction Assay for la Variation génétique chez un Patient sporadiques de la polypose adénomateuse familiale en utilisant le Format de puce-in-a-tube (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Découvrez la PCR digitale pour détecter les variants génétiques rares avec une sensibilité élevée. Cette méthode permet le diagnostic précis des mutations oncogéniques dans les échantillons tumoraux.

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Cette étude a été financée par une subvention pour Scientific Research (C) de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) (n ° 15 K 08397) à Tomoaki Kahyo et par des subventions de l’Agence japonaise pour la recherche médicale et le développement (AMED) (n° 927960719), Subventions pour la recherche exploratoire (no 16K 15256), dépenses pour les projets associés d’un Budget spécial incitatif pour la Promotion d’une réforme de l’Université nationale dans la gestion des dépenses des subventions (no 1019253) et la Fondation de recherche de fumer à Haruhiko Sugimura. Les auteurs remercient Dr Iwaizumi et Dr Kurachi pour leur prise en charge clinique. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la préparation du manuscrit. Figure 3et Figure 4 tableau 4 sont adaptées et tiré d’un article par Kahyo et al. 10, avec la permission de Elsevier.

Le plan d’étude a été approuvé par le Conseil de révision institutionnelle de la Hamamatsu University School of Medicine (G-260-4). Consentement éclairé a été obtenu par le patient et ses parents.
1. contrôle de la qualité de l’ADN génomique
Remarque : L’ADN génomique (ADNg) a été extraite du sang périphérique à l’aide de la méthode de purification ADN bien établie en silice-membrane. Avant les procédures à suivre, la concentration d’ADNg a été déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre.
<ol><li>Préparation des échantillons de gDNA à une concentration de 10 à 100 ng/µL.</li>
	<li>Ajouter 10 µL de tampon d’échantillon ADN à une bande de 8 tubes.</li>
	<li>Ajouter 1 µL d’échelle d’ADN ou ADNg aux tubes. Vortex le mélange pendant 1 min à l’aide de l’accessoire de la microplaque.</li>
	<li>Le tube de charge, les bouts de dispositif et pipette de gel dans l’électrophorèse instrument (Table des matières) et commencent à l’exécuter en appuyant sur le bouton «Démarrer». Remarque : Le système d’électrophorèse fonctionnera automatiquement avec un clic sur le bouton Démarrer.</li>
	<li>Confirmer que le marqueur inférieur contenus dans le tampon d’échantillon ADN est correctement assigné sur l’électrophérogrammes. Si elle est incorrectement attribuée, affecter manuellement le marqueur dans le «mode de Electroherogram» du logiciel. Remarque : Le numéro de l’intégrité de l’ADN (DIN) est automatiquement calculé. La valeur DIN provient de l’intégrité de l’ADN. Haute et basse DIN valeurs indiquent ADNg hautement intact et fortement dégradé, respectivement.</li>
	<li>Spécifier la zone de la taille de l’ADNg (&gt; 200 bp) dans le «mode de la région» du logiciel pour calculer automatiquement la concentration de l’ADNg (&gt; 200 bp).</li>
</ol>2. apprêt et conception de la sonde
<ol><li>Calculer les valeurs de température (Tm) fusion à l’aide de n’importe quel outil de libre accès dans les conditions suivantes : 10 – 25 bases, 50 mM Na+/k+, dNTPs 0,80 mM et 3 mM Mg2 + (Table des matières). Concevoir les amorces et inverses pour amplifier la région génomique contenant des allèles de la cible avec la valeur dem T autour de 60 ° C et la longueur de l’amplicon à 100 – 300 bp. Remarque : Se référer au tableau 1 pour la concentration d’oligonucléotides.</li>
	<li>Conception le nucléique verrouillé (LNA) sondes pour les allèles de référence et la variante basée sur les conditions suivantes : (i) LNA de 1 à 6 sont présents dans chaque sonde ; (ii) un colorant fluorescent et un extincteur sont présents à la 5'- et 3'-terminus de chaque sonde, respectivement ; (iii) la différence entre les valeurs dem T des sondes appariés et dépareillées est &gt; 10 ° C ; (iv) Tm valeurs des sondes appariés et dépareillées sont supérieurs et inférieurs à ceux des amorces, respectivement [p. ex., primer avant : 60,8 ° C, primer inverse : 59,8 ° C, sonde d’allèle de référence (appariés/incompatibles) : 62.6/45.3 ° C, variante sonde d’allèle (appariés/incompatibles) : 61.7/50.5 ° C]. Les valeurs dem T ont été calculées à l’aide de l’outil de libre accès également utilisé à l’étape 2.1.</li>
	<li>Veiller à ce que les amorces et les sondes n’englobent pas les polymorphismes de nucléotides simples avec une fréquence de &gt; 0,1 % à partir de bases de données [par exemple, la base de données Single Nucleotide Polymorphism (dbSNP)].</li>
</ol>3. digital PCR
<ol><li>Préparer les amorces et sondes ADNg solutions courantes dans les concentrations décrites dans le tableau 1 avec un tampon TE et les stocker à -20 – 4 ° C.</li>
	<li>
Mélanger les réactifs à température ambiante dans un volume total de 15 µL à une concentration finale comme décrit dans le tableau 1.
	<ol>
<li>Ajouter 3 µL d’eau distillée au lieu de gDNA dans un modèle de non contrôle (NTC).</li>
		<li>Préparer 3. 5 x la quantité du mélange PCR en trois exemplaires pour tenir compte de l’erreur de pipettage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déposer le mélange PCR haut et bas pour le mélanger.</li>
	<li>La valeur de la plate-forme de chargement sur les puces construit dans la bande de 8-tube et installez-les sur le chargeur automatique. Veiller à ce qu’il y a un contact entre la puce et la plate-forme de chargement.</li>
	<li>Tenir un curseur de chargement sur la plate-forme et maintenez le curseur avec le bouchon sur le chargeur.</li>
	<li>Pipetter 15 µL du mélange PCR sur la plate-forme près de l’extrémité du curseur (Figure 1A).</li>
	<li>Exécuter le chargeur en appuyant sur le bouton de la chargeuse (pendant environ 1 min). Remarque : Il n’est pas un problème si une petite quantité de mélange PCR reste sur la plateforme. Il est possible de relancer successivement le chargeur.</li>
	<li>Définissez la puce-in-a-tube rempli du mélange de la PCR dans la fente latérale de l’amplificateur de l’étanchéité. Poussez le couvercle de la lame et le bord du couvercle pour ne pas briser la puce (Figure 1B).</li>
	<li>Exécutez l’étanchéité enhancer (environ 2 min). Séquentiellement, réexécutez l’enrichisseur étanchéité pendant 1 min si une flaque de liquide est encore visible car une fermeture incomplète entraîne une contamination croisée des signaux positifs (Figures 1 et D 1).</li>
	<li>Ajouter 230 µL d’étanchéité liquide, un réactif à base d’huile, aux tubes. Remarque : Les puces devraient maintenant être immergés dans le liquide.</li>
	<li>Mettre les tubes dans le thermocycleur. Exécutez le thermocycleur tel que décrit dans le tableau 2 (pendant environ 2 h). Régler la température ou la durée de la PCR, s’il y a une répartition inégale des partitions positives (Figure 1E). Remarque : Il est recommandé de définir la vitesse de montée d’environ 1 ° C/s.</li>
	<li>Laisser les tubes dans le thermocycleur pendant au moins 15 minutes pour réduire le bruit de la ligne de base. NOTE : Les tubes peuvent être laissés toute la nuit ainsi. Signaux de fluorescence ont été détectés même le lendemain.</li>
	<li>Définir les tubes sur la gigue de la détection et verser 6 mL d’eau distillée dans le gabarit. Si les bulles d’air sont visibles à l’intérieur et à l’extérieur des tubes, effacer (Figures 1F et 1 G).</li>
	<li>Charger la gigue dans le détecteur et exécutez-le en cliquant sur le bouton «exécuter» du logiciel après la sélection d’onglets Fluorescene, expérience et échantillon/NTC (Table des matières). Remarque : La détection de double couleur de huit échantillons avec une intensité de défaut prend environ 4-5 min.</li>
	<li>Confirmer le tracé de la position, l’histogramme et la nuage de points 2D. NOTE : iIf l’intensité de la fluorescence des partitions négatives est élevé, régler l’intensité d’un clic sur le bouton Paramètres du logiciel afin qu’il relève de l’ordre de 30 à 70.</li>
	<li>Calculer la fraction d’allèle variant (VAF) à l’aide de la formule suivante : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58199/58199eq1.jpg"> Ici, Cv et Cr sont respectivement le nombre de copies de l’allèle de référence et de la variante. NOTE : Ils sont calculés automatiquement dans le logiciel basé sur les statistiques de Poisson.</li>
</ol>4. perception du produit de PCR
<ol><li>Retirer le liquide d’étanchéité du tube.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de tampon TE dans le tube. Vortex vigoureusement pendant 30 s et brièvement Centrifuger le tube.</li>
	<li>Transférer la solution de TE dans un autre tube et ajoutez 30 µL d’acétate de sodium 3M et 200 µL d’éthanol.</li>
	<li>Refroidir la solution à-20 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Centrifuger la solution pendant 30 min à 16 000 x g et éliminer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 300 µL d’éthanol à 80 % pour le tube et vortexer.</li>
	<li>Centrifuger la solution à 16 000 x g pendant 15 minutes et retirez le surnageant. Laisser le précipité à sécher à l’air pendant 5 min.</li>
	<li>Dissoudre le précipité dans 1 à 5 µL de tampon TE après séchage à l’air.</li>
	<li>Si nécessaire, évaluer la taille du produit à l’aide d’un instrument d’électrophorèse en ce qui concerne l’étape 1. Charge 1 µL de la solution à l’appareil de gel pour une haute sensibilité (Table des matières).</li>
</ol>

<ol><li>Majumdar, N., Wessel, T., Marks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+modeling+for+maximal+sensitivity%2C+dynamic+range+and+measurement+precision%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital PCR modeling for maximal sensitivity, dynamic range and measurement precision.</a> PLoS One. 10 (3), 0118833(2015).</li>
<li>Huggett, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digital+MIQE+guidelines%3A+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Digital+PCR+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments.</a> Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).</li>
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<li>Kiss, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+polymerase+chain+reaction+in+picoliter+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets.</a> Analytical Chemistry. 80 (23), 8975-8981 (2008).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
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<li>Iwaizumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+APC+mosaicism+in+a+patient+with+familial+adenomatous+polyposis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genome+Variation%22%5BJournal%5D)">A novel APC mosaicism in a patient with familial adenomatous polyposis.</a> Human Genome Variation. 2, 15057(2015).</li>
<li>Kahyo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+digital+PCR+with+chip-in-a-tube+format+to+analyze+Adenomatous+polyposis+coli+%28APC%29+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Application of digital PCR with chip-in-a-tube format to analyze Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism.</a> Clinica Chimica Acta. 475, 91-96 (2017).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Japanese+Society+of+Pathology+Guidelines+on+the+handling+of+pathological+tissue+samples+for+genomic+research%3A+Standard+operating+procedures+based+on+empirical+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">The Japanese Society of Pathology Guidelines on the handling of pathological tissue samples for genomic research: Standard operating procedures based on empirical analyses.</a> Pathology International. 68 (2), 63-90 (2018).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
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<li>Bio-Rad Laboratories. , Available from: 
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La valeur DIN est souvent utilisée pour évaluer l’ADN endommagé (par exemple, gDNA de tissus fixés au formol de paraffine) avant de quantification ou de séquençage, parce que les données de mauvaise qualité peut entraîner une dégradation avancée des ADNg. Évaluation de DIN devient, donc, une étape importante dans le contrôle de la qualité de la génomique humaine11. Puisque l’ADNg utilisée pour l’expérience représentant avait été stocké à 4 ° C pendant 4 à 11 ans après son extraction du sang, ses valeurs DIN ont été déterminés pour un contrôle de qualité avant le dosage dPCR. Cette étape est particulièrement recommandée si les matériaux sont suspectés d’être endommagé. La concentration de l’ADNg a été également déterminée par électrophorèse. Parce que la plage dynamique de dPCR n’est pas aussi large que pour qPCR en raison des limitations des partitions, une mesure de la concentration de la génomique est une étape importante pour un dosage dPCR réussie. Comme la quantité d’entrées ADN était corrélé avec le nombre de copies total des allèles variante et référence dans l’essai dPCR (R-carré = 0.935 ; Tableau 4), l’électrophorèse est utile pour mesurer la concentration de l’ADNg avant le dosage dPCR.
Le chargement et la fermeture de processus sont des étapes importantes pour obtenir des résultats. Il est essentiel confirmer le montage approprié du mélange PCR sur la plate-forme et assurer un contact entre la puce et la plate-forme (Figure 1A). Saillie du mélange PCR du fourreau peut causer une distribution non valide sur la puce. Confirmant la distribution des partitions positifs et négatifs sur un terrain de position est également nécessaire pour une analyse précise, car il est supposé dans les statistiques de Poisson que matrices d’ADN sont aléatoirement répartis dans chambres1. Dans les résultats représentatifs, cloisons positifs ont été distribués tout au long de la puce (Figure 3). Ce résultat répond à l’exigence pour les statistiques de Poisson et reflète que le chargement et la fermeture des procédures ont été efficaces. Lorsque vous définissez les tubes dans l’amplificateur de l’étanchéité, les puces pourraient être rompus si la partie centrale du couvercle est Poussée trop fortement (Figure 1B). Pour éviter cela, poussez délicatement le bord du couvercle. S’il y a un cluster artificiel des partitions positives (Figure 1D), le nombre de copies peut être surestimé en raison d’une contamination croisée entre les partitions. La procédure d’étanchéité doit être améliorée si une flaque de liquide est visible sur la surface (Figure 1C) (p. ex., en réexécutant séquentiellement l’enrichisseur étanchéité pendant 1 min). S’il y a une répartition inégale des partitions positives (Figure 1E), le nombre de copies peut être sous-estimée en raison de l’amplification insuffisante ou contamination d’étanchéité liquide et d’eau. Les conditions de la PCR doivent être ajustées dans le cas présent [p. ex., par le réglage de la température ou la durée de la PCR (étape 3.11 du protocole), ou en veillant à ce que l’étanchéité liquide et eau versé dans la sauteuse sont propres]. Signaux de fluorescence sont détectés de la bande de 8-tube immergée dans l’eau distillée. Si les bulles d’air adhèrent à la surface du tube, il est possible qu’elles risquent d’interférer avec la détection du signal (Figure 1F). Donc, les bulles doivent être nettoyées à l’aide d’un outil, comme une fine de la pipette. En outre, bulles d’air peuvent se former à l’intérieur des tubes lorsqu’ils sont placés dans le gabarit (Figure 1G). Si les bulles à l’intérieur des tubes sont suffisamment larges pour couvrir la puce, ils doivent aussi être provisionnés. Les bulles peuvent effacer si on les laisse pendant plusieurs minutes à la température ambiante.
Quelques partitions positifs pourront être détectées dans le CNT. Pour éviter une contamination des modèles ADN, nettoyer le banc et, si possible, faire un espace propre avec un ventilateur de filtre. Si l'on soupçonne une contamination des modèles de l’ADN, bien nettoyer l’espace et/ou jeter les réactifs utilisés. En revanche, si les partitions positives de l’allèle de référence ne sont pas détectées en présence de l’ADNg, reconfirmer les concentrations de l’ADNg, amorces et sondes. Notamment, les amorces ont été utilisés à une concentration inférieure à l’expérimentation représentative, par rapport aux classiques PCR (tableau 1)12. Il est également crucial confirmer la vitesse de montée, qui est rarement altérée dans la PCR classique.
Ce qui rend dPCR avec le format de puce-in-a-tube unique, c’est la séparation du mélange PCR à l’intérieur de la bande de 8-tube universel8,13. Un transfert des chambres de partitionnement dans un tube PCR n’est pas nécessaire dans ce système, réduisant ainsi le risque de contamination. Il y a aussi un avantage dans le système dPCR avec puce-in-a-tube format ; Il faut 4 h < pour finir 96 essais dans ce système dPCR, alors qu’il faut au moins 5 h pour finir le même nombre d’épreuves en axée sur les gouttelettes dPCR14. En outre, la bande de 8-tube universelle permet l’utilisation d’un thermocycleur classique, contrairement à une autre puce dPCR15, qui exige un thermocycleur avec un bloc plat. En outre, les connaissances accumulées et les réactifs pour la PCR classique peuvent être appliqués au système dPCR. Ce sera utile pour étendre les applications de dPCR.
Il est à noter que dPCR présente plusieurs limites. Dans dPCR avec le format de puce-in-a-tube, le numéro de partition de la puce est relativement faible par rapport à ceux d’autres plateformes dPCR. Nouvelles améliorations à l’appareil de puce devront augmenter la plage dynamique, qui dépend du nombre de partitions. L’espace intérieur du tube universel étant limitée, un design novateur pour le dispositif à puce est nécessaire pour augmenter le nombre de partitions. L’automatisation de la procédure dPCR ensemble à l’avenir réduirait grandement l’erreur humaine, ce qui entraîne des résultats encore plus fiables. En raison de son caractère haut débit et haute sensibilité, le dPCR avec puce-in-a-tube format devrait être appliquée pour traiter un certain nombre d’échantillons pour biopsies liquides et ADN environnemental.

La PCR quantitative (qPCR) est fréquemment utilisée pour quantifier la variation génétique humaine, y compris les variantes de nucléotide (SNVs) et les variations de nombre de copie de l’ADN (CNV). QPCR, une réaction de polymérase est effectuée dans chaque tube de la même manière que dans la PCR classique point final, en un signal amplification est acquise à partir du tube après chaque cycle thermique. En revanche, dans dPCR, ce qui signifie dPCR point final dans le présent rapport, le mélange PCR est chargé dans plusieurs chambres microscopiques, appelés partitions, là où les matrices d’ADN sont présents ou absents à une dilution limite et chaque partition contenant mélange PCR est jugée négatif ou positif après la PCR complet. Bien qu’il soit facile d’estimer qu’il n’y a aucun modèle de l’ADN dans les partitions de négatives, on ignore combien d’exemplaires des gabarits d’ADN est présentes dans les partitions de positives. Par conséquent, le nombre des gabarits d’ADN dans les partitions positives est estimé basé sur la distribution de Poisson, en utilisant le nombre de partitions négative1. dPCR est plus cher et a une plus petite gamme dynamique par rapport à qPCR, mais cette méthode permet une quantification absolue et offre une sensibilité plus élevée et une plus grande précision2.
Une des applications principales de dPCR est la validation des variantes identifiées par séquençage de prochaine génération (NGS). Surtout dans le cas de variants rares, fractions variant peu de sens, la validation est cruciale en raison d’erreurs de séquençage qui peuvent survenir dans NGS3. Tandis que Sanger séquençage et qPCR constituent des outils utiles pour la validation des SNVs et CNV, leur sensibilité est faible par rapport à dPCR. Par conséquent, dPCR technologie est en demande pour des études génétiques traitant de variants rares. Récemment, la détection de liquide biopsie de variants rares liés aux caractéristiques du cancer, tels que la résistance aux médicaments, est devenue un sujet brûlant dans le diagnostic moléculaire et thérapie4. La technologie dPCR semble convenir pour les études de biopsie liquide et devrait avoir des applications cliniques importantes dans un proche avenir, bien que les améliorations liées à la dynamique et de coût doivent toujours être mises en œuvre.
Technologie dPCR disponible dans le commerce peut être grossièrement classée en plateformes sur le droplet et puce ; la différence, c’est comment les modèles de l’ADN sont partitionnées5,6,7. Dans le dPCR avec puce-in-a-tube format, le mélange PCR est distribué par l’action capillaire dans les partitions d’une puce. Les puces sont construites en tube en huit bandes, dont plusieurs membres du personnel de laboratoire sera déjà familier avec, et, ainsi, huit échantillons peuvent être considérées à un temps8. Dans l’étape de la lecture, il faut 1 h < pour traiter 96 échantillons en détectant toute l’image de la puce et non à chaque partition. Puisque dPCR avec le format de puce-in-a-tube a un débit élevé par rapport aux autres systèmes dPCR, facilité d’utilisation et la productivité sont les principaux avantages pour ses utilisateurs.
Dans ce rapport, mosaïsme somatique du gène APC dans un patient présentant le polyposis adénomateux sporadique est utilisé comme un cas représentatif et on compare les résultats de dPCR et NGS. L’objectif principal de ce rapport est de quantifier clairement une variante de nucléotide simple à l’aide de dPCR avec le format de puce-in-a-tube. Nous espérons que ce rapport est utile pour les chercheurs qui s’intéressent en adoptant la plate-forme dPCR pour leur propre travail.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Blood Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>51194</td><td>Avant le protocole 1 : Extraction de l’ADN génomique</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>ND-8000</td><td>Avant le protocole 1 : Spectrophotomètre</td></tr><tr><td>à 8 bandelettes</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td>Protocole 1</td></tr><tr><td>Tampon d’échantillon d’ADN génomique</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5366</td><td>Protocole 1 : Un composant du test de bande de criblage d’ADN génomique</td></tr><tr><td>Échelle d’ADN</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5366</td><td>Protocole 1 : Un composant du test de bande de criblage d’ADN génomique</td></tr><tr><td>MS3 Basic Small Shaker</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td>Protocole 1 : Mélangeur vortex</td></tr><tr><td>Crible d’ADN génomique ScreenTape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5365</td><td>Protocole 1 : Dispositif de gel</td></tr><tr><td>2200 Système</td> <td>TapeStationAgilent Technologies</td><td>G2965AA</td><td>Protocole 1 : Instrument d’électrophorèse</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse TapeStation</td><td>Agilent Technologies</td><td>Fourni avec G2965AA</td><td>Protocole 1 : Logiciel d’analyse</td></tr><tr><td>Amorces d’oligo-ADN</td><td>IDT</td><td>Ordre personnalisé</td><td>Protocole 2</td></tr><tr><td>Sondes LNA</td><td>IDT</td><td>Ordre personnalisé</td><td>Protocole 2</td></tr><tr><td>Outil logiciel</td><td>IDT</td><td>Site Web : http://biophysics.idtdna.com/</td> <td>Protocole 2</td></tr><tr><td>Base de données dbSNP</td><td>Site Web du</td> <td>NCBI</td> : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ <td>Protocole 2</td></tr><tr><td>TE</td><td>buffer ThermoFisher SCIENTIFIC 12090015</td><td></td><td>Protocol 3</td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free Distilled Water</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>10977015</td><td>Protocol 3 (Tableau 1)</td></tr><tr><td>Clarity Digital PCR Probe Mastermix</td><td>JN Medsys</td><td>12013</td><td>Protocole 3 (Tableau 1) : 2xPCR Master Mix Un composant du fluide d’étanchéité #10011</td></tr><tr><td>Clarity</td><td>JN Medsys</td><td>12005</td><td>Protocole 3 : Fluide d’étanchéité Un composant de #10011</td></tr><tr><td>Clarity JN Solution</td><td>JN Medsys</td><td>12006</td><td>Protocole 3 (Tableau 1) : Solution 20xdPCR Un composant du #10011</td></tr><tr><td>Clarity Tube-strip</td><td>JN Medsys</td><td>12007</td><td>Protocole 3 : Chip-in-a-tube Un composant du kit de chargement d’échantillons Clarity #10011</td></tr><tr><td></td><td>JN Medsys</td><td>12008</td><td>Protocole 3 : Plate-forme de chargement et curseur Un composant de #10011</td></tr><tr><td>Clarity Auto Loader</td><td>JN Medsys</td><td>11002</td><td>Protocole 3 : Chargeur automatique Un composant de #10001</td></tr><tr><td>Clarity Sealing Enhancer</td><td>JN Medsys</td><td>11003</td><td>Protocole 3 : Améliorateur d’étanchéité Un composant de #10001</td></tr><tr><td>Clarity Reader</td><td>JN Medsys</td><td>11004</td><td>Protocole 3 : Reader Un composant de #10001</td></tr><tr><td>Life Eco Thermal Cycler</td><td>Bioer Technology</td><td>TC-96GHbC</td><td>Protocole 3 : Thermocycleur</td></tr><tr><td>Clarity Software</td><td>JN Medsys</td><td>Bundleed with #10001</td><td>Protocol 3 : Logiciel d’analyse</td></tr><tr><td>Haute sensibilité D1000 screen tape</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5584</td><td>Protocole 4 : Dispositif à gel pour une sensibilité élevée</td></tr></tbody></table>

digital polymerase chain reaction assay for la variation génétique chez un patient sporadiques de la polypose adénomateuse familiale en utilisant le format de puce-in-a-tube

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

L’analyse quantitative des variations génétiques est cruciale pour la compréhension des caractéristiques moléculaires de graves problèmes médicaux, comme les tumeurs. Parce que les réactions en chaîne numérique de polymérase (PCR) permettent la quantification précise des variantes numéros de copie ADN, elles deviennent un outil indispensable pour détecter des variations génétiques rares, comme les mutations résistantes aux médicaments. Il est prévu que le diagnostic moléculaire par PCR numérique (dPCR) seront disponible en pratique clinique dans un proche avenir ; ainsi, comment mener efficacement dPCR avec le matériel génétique humain est un sujet d’actualité. Ici, nous présentons une méthode pour détecter le mosaïsme somatique polypose adénomateuse familiale (APC) à l’aide de dPCR avec le format de puce-in-a-tube, qui permet des réactions dPCR huit à être conduites simultanément. Être prudent lors de remplissage et de fermeture du mélange réactionnel sur les puces. Cet article montre comment éviter les sur - et une sous-estimation des partitions positives. Par ailleurs, nous présentons une procédure simple pour recueillir le produit dPCR partir des partitions sur les puces, qui peuvent alors être utilisés pour confirmer l’amplification spécifique. Nous espérons que ce rapport de méthodes contribuera à promouvoir le dPCR avec la méthode chip-in-a-tube dans la recherche génétique.

Nous avons examiné le mosaïsme somatique du gène APC dans un patient présentant la polypose adénomateuse familiale sporadique selon les procédures décrites ci-dessus. Dans une étude antérieure, l’APC c.834 + 2 t &gt; C mutation a été trouvée chez le patient, mais pas chez leurs parents, à l’aide de Sanger séquençage et NGS9. Les dessins des amorces et des sondes utilisées dans les résultats représentatifs sont présentés au tableau 3. L’ADN génomique a été extrait du sang de la proband, les parents et six donneurs sains. Les valeurs DIN des neuf échantillons ADNg que se situait à 6,7 – 7,9 (Figure 2 et tableau 4). FAM et HEX ont été utilisés comme les colorants de fluorescence pour les allèles de C et T, respectivement. Les taches jaunes et verts sur les parcelles de position représentent partition FAM-positive et HEX-positif, respectivement (Figure 3A). Les taches bleues représentent partition négative pour les FAM et HEX. Le fond noir correspond aux partitions où le mélange réactionnel n’a été ajouté. Nombreuses partitions positives des allèles C et T ont été détectées dans le proband, tandis que quelques partitions positives de l’allèle C ont été détectées dans père du proband ou le CNT et, dans les partitions de ce dernier, positives du T allèle n’a pas détecté. La séparation du signal entre les allèles de C et T a été claire sur le diagramme de dispersion à deux dimensions (2d), et les signaux plus positifs de HEX et FAM ont été hors de l’autre (Figure 3B). Le VAF de la proband 13,2 %, ce qui est similaire à celui déterminé à l’aide de NGS (12,7 %) (Tableau 4). Les VAFs des parents et des donneurs sains de la proband étaient &lt; 0,1 %. La limite de détection pour les APC c.834 + 2 t &gt; C mutation a été estimée à 0,3 %, à l’aide de 3 x l’écart-type pour les mesures répétées avec 10 – 11 ng de l' ADNg total10.
La taille de l’amplicon lors de l’essai dPCR pour APC c.834 + 2 t &gt; C était prévue pour 123 bp. Pour confirmer que le produit dPCR a été amplifié en une seule bande, on le produit dPCR a prélevé la puce dosage. Par électrophorèse, une seule bande a été clairement détectée, et la taille du produit était conforme à la prévision (Figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig1.jpg"> Figure 1 : Points à noter pour le dosage dPCR avec puce-in-a-tube format. (A), ce panneau indique comment mettre en place la bande 8-tube dans le chargeur automatique. (B), ce panneau affiche puces cassés. (C), ce tableau montre comment la puce surfaces juste après (i) chargement et (ii) l’imperméabilisation. (iii) une flaque de liquide est visible dans le cas d’une fermeture incomplète. (D), ce panneau indique l’intrigue de position dans le cas d’une contamination croisée. (E), ce panneau indique l’intrigue de position dans le cas d’une distribution inégale. (F), ce tableau montre comment l’air des bulles sur la surface du tube immergé dans l’eau. (G), ce panneau affiche des bulles d’air à l’intérieur du tube. Tout au long de la figure entière, pointes de flèches noires et blanches indiquent les morceaux cassés puce et bulles d’air, respectivement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig2.jpg"> Figure 2 : Représentant électrophérogrammes de sang ADNg. Électrophérogrammes de sang ADNg valeurs DIN 6,7 et 7,9 apparaissent dans les haut et bas, respectivement. L’astérisque indique un marqueur plus bas. DIN : Numéro de l’intégrité de l’ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig3.jpg"> Figure 3 : Les résultats représentatifs du mosaïsme somatique APC avec le format de puce-in-a-tube à l’aide de dPCR. (A), la position des emplacements et de nuages de points (B) de la commande non-modèle (NTC), le proband et le père sont indiqués ici. HEX et FAM correspondent respectivement à des allèles de référence et la variante. Lignes verticales et horizontales indiquent les seuils d’intensités HEX et FAM, respectivement. Ce chiffre a été modifié par Kahyo et al. 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58199/58199fig4.jpg"> Figure 4 : Collection de produits dPCR de la puce dosage. Les produits collectés et concentré dPCR ont été soumis à une électrophorèse. La taille de la cible prévue était de 123 bp. Ce chiffre a été modifié par Kahyo et al. 10. CNT : contrôle non-modèle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58199/58199fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Réactif</td>
			<td>Concentration de de solution mère</td>
			<td>Volume (μL)</td>
			<td>Concentration finale</td>
			<td>Recommandé concentration finale</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase/RNase-libre de l’eau distillée</td>
			<td>-</td>
			<td>1,75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 x PCR Master mix</td>
			<td>-</td>
			<td>7.5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonde LNA pour l’allèle majeur</td>
			<td>2 ΜM</td>
			<td>0,5</td>
			<td>66,7 nM</td>
			<td>3.33 à 100 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonde LNA pour l’allèle mineur</td>
			<td>2 ΜM</td>
			<td>0,5</td>
			<td>66,7 nM</td>
			<td>3.33 à 100 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer avant</td>
			<td>1 ΜM</td>
			<td>0,5</td>
			<td>33,3 nM</td>
			<td>3.33-50,0 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inverser l’apprêt</td>
			<td>1 ΜM</td>
			<td>0,5</td>
			<td>33,3 nM</td>
			<td>3.33-50,0 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 x dPCR solution</td>
			<td>-</td>
			<td>0,75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>ADNg</td>
			<td>3,33 ng/μL</td>
			<td>3</td>
			<td>666 pg/μL</td>
			<td>20 pg/μL – 2 000 pg/μL1
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : les réactifs utilisés pour le dosage dPCR. 1 Selon les attendus de précision et de sensibilité.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Étape</td>
			<td>Température</td>
			<td>Temps</td>
			<td>Cycles</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dénaturation initiale</td>
			<td>95 ° C</td>
			<td>5 m</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dénaturer Recuit et extension</td>
			<td>95 ° C 58 ° C</td>
			<td>50 s 90 s</td>
			<td>42</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extension finale</td>
			<td>70 ° C</td>
			<td>5 m</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Conditions de thermocycleur.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Nom</td>
			<td>Séquence1</td>
			<td>Tm valeur2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer avant</td>
			<td>5'-GGTCAAGGAGTGGGAGAAATC-3′</td>
			<td>60,8 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inverser l’apprêt</td>
			<td>5'-TCTTAGAACCATCTTGCTTCATACT-3′</td>
			<td>59,8 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonde LNA pour l’allèle T</td>
			<td>5'-HEX-ATTT [A] CCTGACCA-IBFQ-3'</td>
			<td>Correspondance : 62,6 ° C Dépareillées : 45,3 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sonde LNA pour l’allèle C</td>
			<td>5'-FAM-TTT [G] CCTGACC-IBFQ-3'</td>
			<td>Correspondance : 61,7 ° C Dépareillées : 50,5 ° C</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : conception des amorces et des sondes. 1 Les lettres soulignées et entre crochets sont de la LNA et la variante ciblé, respectivement. 2 Calculée selon l’étape 2 du protocole.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NGS3</td>
			<td colspan="4">dPCR4</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Échantillon1</td>
			<td rowspan="2">Tissu</td>
			<td rowspan="2">Entrée ADN (ng)</td>
			<td rowspan="2">DIN2</td>
			<td rowspan="2">VAF (%)</td>
			<td rowspan="2">Variante (copies)</td>
			<td rowspan="2">Référence (copies)</td>
			<td colspan="2">VAF (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Moyenne</td>
			<td>RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>NTC</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1.23</td>
			<td>0</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proband</td>
			<td>Sang</td>
			<td>11.3</td>
			<td>7.6</td>
			<td>12.7</td>
			<td>379</td>
			<td>2.48 x 103
</td>
			<td>13.2</td>
			<td>0.0353</td>
		</tr>
<tr>
<td>Père</td>
			<td>Sang</td>
			<td>10.3</td>
			<td>7.7</td>
			<td>0,0167</td>
			<td>1.08</td>
			<td>3,42 x 103
</td>
			<td>0.0341</td>
			<td>0,439</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mère</td>
			<td>Sang</td>
			<td>10,8</td>
			<td>7.6</td>
			<td>0.0136</td>
			<td>0,956</td>
			<td>3.04 x 103
</td>
			<td>0.0313</td>
			<td>0.637</td>
		</tr>
<tr>
<td>Donateurs-1</td>
			<td>Sang</td>
			<td>11,7</td>
			<td>7.3</td>
			<td>-</td>
			<td>1.64</td>
			<td>3.01 x 103
</td>
			<td>0,0543</td>
			<td>0,414</td>
		</tr>
<tr>
<td>Donateurs-2</td>
			<td>Sang</td>
			<td>10.5</td>
			<td>7.6</td>
			<td>-</td>
			<td>1.06</td>
			<td>2,90 x 103
</td>
			<td>0,0406</td>
			<td>0,539</td>
		</tr>
<tr>
<td>Donateurs-3</td>
			<td>Sang</td>
			<td>17,6</td>
			<td>7.9</td>
			<td>-</td>
			<td>4.24</td>
			<td>5,65 x 103
</td>
			<td>0,0713</td>
			<td>0,783</td>
		</tr>
<tr>
<td>Donateurs-4</td>
			<td>Sang</td>
			<td>12.3</td>
			<td>7.6</td>
			<td>-</td>
			<td>2.38</td>
			<td>4.16 x 103
</td>
			<td>0,0666</td>
			<td>0,557</td>
		</tr>
<tr>
<td>Donateurs-5</td>
			<td>Sang</td>
			<td>19.2</td>
			<td>7</td>
			<td>-</td>
			<td>1.48</td>
			<td>6,79 x 103
</td>
			<td>0,0213</td>
			<td>0,571</td>
		</tr>
<tr>
<td>Donateurs-6</td>
			<td>Sang</td>
			<td>14.4</td>
			<td>6.7</td>
			<td>-</td>
			<td>3.44</td>
			<td>4.67 x 103
</td>
			<td>0.0728</td>
			<td>0,729</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 4 : résultats de la dPCR dosage pour APC mosaïsme somatique. 1 NTC : contrôle de non-modèle ; Donateur : donneur sain. 2 DIN : Numéro de l’intégrité de l’ADN. 3 Iwaizumi et al. 9, hum génome Var. 15057 2 (2015). 4 Les expériences ont été exécutés indépendamment répétées et triple x 3 ; les données sont exprimées comme valeur moyenne ; RSD : écart type relatif ; S/o : sans objet. Le tableau a été modifié par Kahyo et al. 10.

Numérique d’amplification génique (PCR) est un outil utile pour la détection ultrasensible de variantes de nucléotide et ADN copie numéros variantes. Ici, nous démontrons les considérations clés pour les variants rares dans le génome humain en utilisant la PCR numérique avec le format de puce-in-a-tube de mesure.

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for la Variation génétique chez un Patient sporadiques de la polypose adénomateuse familiale en utilisant le Format de puce-in-a-tube

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des tests génétiques, telles que la détection du mosaïcisme et les tests génétiques basés sur la biopsie liquide. Le principal avantage de cette technique est la détection à haut débit de la fraction d’allèles de faible variante. Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic des tumeurs, car la détection de mutations oncogéniques à haute sensibilité peut contribuer à la médecine de précision.Commencez cette expérience en ajoutant 10 L de tampon d’échantillon d’ADN dans les tubes d’une bandelette de 8 tubes. Ajoutez ensuite 1 microlitre d’échelle d’ADN dans le premier tube de la bande de 8 tubes, et un microlitre d’ADN génomique de l’échantillon dans chacun des tubes restants. Utilisez la fixation de microplaque pour mélanger le contenu de la bande de 8 tubes en tourbillonnant pendant une minute.Placez la bandelette, les pointes de pipette et un appareil à gel dans un instrument d’électrophorèse. Appuyez sur le bouton de démarrage pour démarrer la course. Une fois l’analyse terminée, vérifiez l’électrophérogramme sur l’écran pour confirmer que le marqueur inférieur contenu dans le tampon d’échantillon d’ADN est correctement attribué sur l’électrophérogramme.Si ce n’est pas le cas, attribuez manuellement le marqueur en mode électrophérogramme du logiciel. Ensuite, dans le mode région du logiciel, spécifiez la région de taille de l’ADN génomique pour calculer automatiquement la concentration d’ADN. Ajoutez des amorces, des sondes et de l’ADN génomique précédemment conçus à une nouvelle bandelette de 8 tubes pour atteindre un volume total de 15 L.Ajoutez la plate-forme de chargement sur les copeaux intégrés dans la nouvelle bande de 8 tubes, puis placez la bande de tubes dans le chargeur automatique. Assurez-vous qu’il y a un contact entre les copeaux et la plate-forme de chargement. Ensuite, placez un curseur de chargement dans la plate-forme et utilisez un butoir pour maintenir le curseur hors du chargeur.Pipetez 15 L du mélange PCR près de l’extrémité du curseur, puis appuyez sur le bouton du chargeur pour faire fonctionner le chargeur pendant une minute. Retirez la bande tubulaire du chargeur après le passage et placez-la dans un activateur d’étanchéité. Poussez avec précaution le couvercle coulissant et le bord du couvercle supérieur.Faites fonctionner l’activateur d’étanchéité pendant environ deux minutes. Si l’étanchéité est incomplète, indiquée par une flaque de liquide, répétez le passage pendant une minute supplémentaire. Ajouter 230 L de liquide d’étanchéité dans les tubes.Placez la bande tubulaire dans le thermocycleur et exécutez la PCR comme décrit dans le protocole. S’il y a une répartition inégale des cloisons positives, ajustez la température ou la durée de la PCR. Pour détecter et analyser l’intensité de fluorescence des produits de PCR, placez la bande tubulaire sur le gabarit de détection et ajoutez 6 mL d’eau distillée.Éliminez toutes les bulles d’air visibles à l’aide d’une pointe de pipette. Chargez le gabarit dans le détecteur. Dans le logiciel de détection, sélectionnez les onglets Fluorescence, Expérience, puis Échantillon NTC, puis cliquez sur le bouton RUN pour démarrer l’exécution.Une fois l’exécution terminée, confirmez le tracé de position, l’histogramme et le nuage de points 2D. Pour recueillir le produit PCR, retirez le liquide d’étanchéité du tube. Ajoutez 100 L de tampon TE et agitez vigoureusement pendant 30 secondes.Centrifugez brièvement les tubes dans une centrifugeuse de table et procédez comme décrit dans le protocole textuel pour terminer la collecte du produit PCR. Les graphiques de position créés par PCR numérique montrent une fluorescence HEX jaune dans les échantillons de patients et de père, indiquant la présence de la variante T de l’allèle APC, mais pas dans l’absence de contrôle de matrice. Seul l’ADN génomique des patients contient une variante C, comme le montre une fluorescence verte de FAM.Comme le confirment les diagrammes de dispersion, le patient et le père sont positifs pour HEX, ou variante T, alors que seul le patient présente la présence de la variante C. La fraction d’allèle variante, ou VAF, calculée par DPCR, était de 13,2 %, similaire aux 12,7 % obtenus par le séquençage de nouvelle génération. D’autre part, les VAF des parents et des donneurs sains des patients étaient inférieurs à 0,1 %L’électrophérèse des produits DPCR collectés et concentrés confirme que la taille du fragment prédit est de 123 paires de bases dans l’ADN des patients et des parents. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de garder le banc propre, par exemple en utilisant une unité de filtre de ventilateur.

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