Fabrication de dispositifs de réfraction-index-assortie de microfluidique biomédicale

Ce protocole décrit la fabrication des dispositifs microfluidiques de MY133-V2000 pour éliminer les artefacts qui se posent souvent en microcanaux en raison des indices de réfraction incompatible entre les structures de microcanaux et une solution aqueuse. Ce protocole utilise un support acrylique pour compresser l’appareil encapsulé, améliorant l’adhérence chimiquement et mécaniquement.

Cette méthode peut aider à relever un défi important dans la combinaison de la microscopie et de la microfluidique en permettant l’appariement de l’indice de réfraction entre la structure du microcanal et le milieu aqueux à l’intérieur du canal. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est compatible avec les méthodes de fabrication couramment utilisées pour créer des dispositifs microfluidiques. Un autre avantage clé de notre approche est la méthode utilisée pour sceller les microcanaux en matériaux à faible adhérence, ce qui est un problème courant parmi les polymères à indice de réfraction bien réfractive.

La démonstration visuelle de cette méthode est cruciale, car les étapes de scellement du canal peuvent être difficiles à réaliser. Par exemple, il est important que les réservoirs ne soient pas obstrués lors du serrage. Commencez cette procédure par la fabrication de polydiméthylsiloxane, ou PDMS, négatif, comme décrit dans le protocole texte.

Ensuite, remplissez le négatif PDMS avec 400 microlitres de MY-133-V-2000. Le négatif doit être légèrement trop rempli. Placez le négatif PDMS rempli MY-133-V-2000 dans la chambre à vide pendant deux heures pour éliminer les bulles.

Après avoir retiré le MY-133-V-2000 de la chambre à vide, appuyez une lame de verre contre le haut du négatif légèrement trop rempli pour créer une surface plane de MY-133-V-2000 et pour empêcher l’oxygène d’inhiber la polymérisation. Ensuite, insérez le MY-133-V-2000 dans un four UV de 400 watts. Réglez le rayonnement UV à 50 % de l’intensité maximale pendant 300 secondes pour durcir le microcanal.

Il s’agit d’une puissance d’environ 4,5 joules par centimètre carré, soit environ le double de la puissance de durcissement minimale recommandée par le fabricant. Après avoir coupé l’acrylique comme décrit dans le protocole de texte, placez deux petites gouttes sur le bord de l’acrylique, puis utilisez un outil jetable pour répartir uniformément la colle. Placez le substrat de verre sur l’acrylique et laissez la colle sécher en utilisant le poids du verre pour le maintenir en place.

Enduire le verre exposé de 100 microlitres de PDMS à l’aide d’une pipette à déplacement positif. Ensuite, insérez la couche de base dans une machine à revêtir sous vide pour recouvrir uniformément le verre d’un film PDMS d’environ 10 micromètres d’épaisseur à une vitesse de 1500 tr/min pendant deux minutes. Retirez la couche de base de la machine à essorer et essuyez soigneusement tout excès de PDMS qui a recouvert l’acrylique d’acétone et d’essuie-tout.

Veillez à ne pas déranger le PDMS non durci. Maintenant, faites cuire la couche de base avec le PDMS dans un four à 65 degrés Celsius pendant deux heures pour durcir le PDMS. Pipetez un millilitre de PDMS sur une lame de verre, puis utilisez une autre lame de verre pour répartir uniformément le PDMS jusqu’à ce qu’il commence à suinter sur les côtés.

Faites-le durcir sur une plaque chauffante à 150 degrés Celsius pendant 10 minutes. Découpez le PDMS durci en un rectangle aux mêmes dimensions que le dispositif MY-133-V-2000. Ensuite, en utilisant la couche intermédiaire de l’acrylique comme moule, percez des trous pour le réservoir et découpez une fenêtre de visualisation carrée dans le PDMS pour fabriquer le joint PDMS.

Retirez maintenant le MY-133-V-2000 durci du four UV et retirez le canal du négatif et placez-le sur un substrat plat avec le côté du canal vers le haut. Retirez la couche de base contenant le PDMS durci du four à 65 degrés et placez-la sur le substrat. Ensuite, placez le substrat avec le canal MY-133-V-2000 et la couche de base dans le nettoyeur plasma d’oxygène.

Réglez la pression du vide sur 200 millitorr et le niveau de radiofréquence sur élevé. Procédez au traitement de surface du canal et du substrat en verre pendant 30 secondes. Le plasma d’oxygène doit s’allumer en bleu lorsque le nettoyeur plasma est allumé.

Après 30 secondes, retirez à la fois le microcanal et la couche de base du nettoyeur plasma. À l’aide d’une pince, placez immédiatement le canal MY-133-V-2000 côté vers le bas dans la découpe rectangulaire de la couche de base en acrylique, de sorte qu’il entre en contact avec le PDMS. Maintenant, placez le joint PDMS sur le dessus de l’appareil MY-133-V-2000, en alignant les trous du joint avec les réservoirs de l’appareil.

L’utilisation de ce joint PDMS est cruciale car le PDMS est plus élastique que le MY-133-V-2000 et peut donc être compressé davantage. Cela permet à la force d’être transférée de l’acrylique au microcanal sans casser le verre. À ce stade, placez l’appareil non fini sur une plate-forme surélevée au-dessus du banc pour fournir une surface de serrage pour l’assemblage de l’appareil.

Ensuite, extrayez trois millilitres de ciment acrylique à l’aide d’une seringue. Répartissez suffisamment de ciment acrylique sur la couche de base pour fournir une couche mince. Rendez la couche aussi uniforme que possible et ne laissez pas le matériau s’infiltrer dans le canal.

Maintenant, placez la pièce acrylique de la couche intermédiaire sur l’acrylique de la couche de base. Assurez-vous que les trous sont alignés avec les réservoirs du caniveau MY-133-V-2000. Fixez la couche intermédiaire sur la couche de base aussi fermement que possible et maintenez-la pendant deux minutes pendant que le ciment durcit pour lier les morceaux d’acrylique ensemble.

Assurez-vous que les réservoirs ne sont pas obstrués pendant cette étape pour éviter que de l’air ne soit emprisonné sous l’appareil MY-133-V-2000. L’air emprisonné entre le MY-133-V-2000 et le substrat restera piégé si les réservoirs sont obstrués. Cela provoquera des fuites dans l’appareil fini.

Par conséquent, il est essentiel que les trous ne soient pas obstrués pendant cette étape. Une fois que le ciment a durci, retirez la pression de l’appareil. Placez le ciment acrylique sur la couche intermédiaire aux endroits de contact anticipé avec la couche supérieure de l’acrylique.

Maintenant, placez la couche supérieure de l’acrylique sur la couche intermédiaire de l’acrylique, en vous assurant que les trous sont alignés avec les réservoirs. Laissez-le reposer sur le banc pendant deux minutes pendant que le ciment acrylique sèche. Testez l’appareil MY-133-V-2000 en ajoutant 10 microlitres de colorant alimentaire ou d’eau déminéralisée dans l’un des trous du réservoir pour tester l’adhérence et l’écoulement.

Insérez un tube dans le réservoir opposé et connectez l’autre extrémité à un piège à vide. Allumez l’aspirateur pour tirer le colorant ou l’eau à travers le canal afin de vous assurer qu’un appareil réussi a été créé. Vérifiez au microscope qu’il n’y a pas de fuites dans le canal ou le réservoir.

À l’aide de l’aspirateur, retirez le colorant des deux réservoirs. Ensuite, rincez les réservoirs avec de l’éthanol. Placez l’éthanol dans un réservoir.

Tirez l’éthanol à travers à l’aide de l’aspirateur. Laissez l’éthanol reposer à température ambiante pendant 10 minutes. Vaporisez soigneusement le canal avec de l’éthanol et mettez-le dans une boîte stérile en polystyrène.

Enveloppez-le hermétiquement avec Parafilm et conservez-le jusqu’à ce que vous en ayez besoin. La carte thermique présentée ici représente la masse des cellules MCF-7 adhérentes aux FOD dans un microcanal. Peu d’artefacts sont visibles près des parois du microcanal.

Dans cette mesure, une seule cellule MCF-7 adéquate peut être vue sur le bord du microcanal à côté de la paroi. L’absence d’artefacts près de la paroi permet d’obtenir des mesures quantitatives précises, même lorsque les cellules sont à proximité de la paroi du canal. Cette dernière figure montre une paire de cellules MCF-7 assises près de la paroi du microcanal.

La masse de ces cellules à chaque pixel peut être mesurée avec précision à l’aide de la microscopie de phase quantitative. Tout en suivant ce protocole, il est important de ne pas obstruer les réservoirs lors du serrage de l’appareil pendant que le ciment acrylique sèche. L’obstruction des trous emprisonne l’air entre le MY-133-V-2000 et le substrat.

Cela provoquera des fuites dans le canal pendant l’écoulement. L’utilisation du MY-133-V-2000 comme matériau de fabrication pour les dispositifs microfluidiques offre un avantage certain par rapport aux matériaux traditionnels en réduisant considérablement les artefacts à proximité des parois des microcanaux. Cela permet d’effectuer des mesures quantitatives à proximité des structures des microcanaux.

Les appareils fabriqués avec ce protocole sont compatibles avec toutes les techniques de microscopie couramment utilisées. Ce protocole est basé sur la pathographie cellulaire, il est donc compatible avec d’autres techniques microfluidiques avancées, telles que les trieurs de cellules ou les générateurs de gradient pour l’étude du comportement cellulaire. Dans l’ensemble, cette technique dote les chercheurs d’un nouvel outil pour les tests microfluidiques biomédicaux basés sur la microscopie.

La précision supplémentaire qu’il accorde aux mesures quantitatives dans les microcanaux a des applications importantes dans de nombreux domaines, notamment la découverte de médicaments et l’analyse de cellules uniques.