Name: Modélisation de la tuberculose chez Mycobacterium marinum adultes infectés poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Découvrez la modélisation de la tuberculose chez le poisson zèbre adulte infecté par Mycobacterium marinum. Cette méthode permet d'extraire l'ADN et l'ARN pour quantifier les charges bactériennes et les réponses immunitaires par qPCR.

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Ce travail a été soutenu par le finlandais culturel Fondation (H.L.), Tampere tuberculose Foundation (H.L., L.-M.V., M.M.H., député), Fondation de l’Association finlandaise de lutte contre la tuberculose (Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö) (Chambre des lords, M.M.H., député), Sigrid Jusélius Foundation (M.P), Emil Aaltonen Foundation (M.M.H.), Jane et Aatos Erkko Foundation (M.P) et Académie de Finlande (M.P). Leena Mäkinen, Hanna-Leena Piippo et Jenna Ilomäki sont reconnus pour leur assistance technique. Les auteurs reconnaissent le laboratoire de poisson-zèbre de Tampere pour leur service.

Toutes les expériences de poisson-zèbre ont été approuvés par le Conseil d’expérimentation animale en Finlande (ESAVI/8245/04.10.07/2015). Méthodes sont exécutées conformément à la Loi (497/2013) et le décret gouvernemental (564/2013) sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques ou éducatives en Finlande.
1. mise en culture de Mycobacterium marinum
Remarque : Comme Mycobacterium marinum est un agent pathogène susceptible de causer des infections superficielles chez l’être humain, trouver les directives locales pour la sécurité personnelle et d’élimination des déchets biohazard avant de commencer à travailler avec cette bactérie.
<ol><li>M. marinum sur un 7 H 10 la culture plaque additionné de 10 % OADC (albumine, dextrose, acide oléique, catalase) enrichissement et 0,5 % v/v de glycérol à 29 ° C pendant au moins 5 jours. Maintenir M. marinum cultures en prenant des bactéries fraîches du congélateur toutes les deux semaines et le transfert sur une plaque de nouveau toutes les deux semaines. NOTE : M. marinum est un pathogène de poissons naturels qui infectent les espèces aquatiques et il est important de prendre des précautions, ne pas de contaminer les stocks de poisson-zèbre avec les bactéries. Zebrafish infecté et éléments contaminés par des bactéries doivent être distincte des installations d’élevage.</li>
	<li>Utiliser une anse à inoculation stérile 1 µL aseptiquement transférer une anse de M. marinum masse bactérienne dans un flacon de culture cellulaire contenant 10 mL de 7 H 9 moyenne avec 10 % un enrichissement ADC (albumine, dextrose, catalase), polysorbate 80 et 0,2 0,2 % v/v % v/v de glycérol. Culture pour 3 à 4 jours à environ un OD600 (densité optique) de 0,7 à 29 ° C dans l’obscurité sans agitation. Laisser le bouchon desserré ou utilisez un bouchon filtre, permettant l’échange suffisamment de gaz. Remarque : Le Polysorbate 80 est ajouté au milieu pour empêcher l’agrégation des bactéries. En outre, exposition à la lumière conduit à des modifications phénotypiques dans des colonies bactériennes (p. ex., les changements de couleur du blanc au jaune). Pour éviter cela, maintenir les cultures dans l’ignorance.</li>
	<li>Mesurer la valeur de600OD avec un spectrophotomètre. Diluer la culture liquide à une OD600 de 0,07 – 0,09 et continuer la mise en culture pendant 2 jours à 29 ° C dans l’obscurité sans agitation. Laisser le bouchon desserré. Remarque : Pendant ces deux jours, la suspension bactérienne atteindra une OD600d’environ 0,5 correspondant à une phase logarithmique précoce.</li>
</ol>2. préparation de la Solution bactérienne pour infecter le poisson-zèbre adulte
<ol><li>Transférer la suspension bactérienne dans une grande cuvette stérile ou un tube de 15 mL et placez-le dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 min permettre des touffes plus importants à régler.</li>
	<li>Transférer le haut de la page 5-7 mL de la suspension dans un tube propre ou une cuvette et mesurer l' OD600. Utilisez cette phase supérieure de la suspension pour les infections.</li>
	<li>Prélever 1 mL de culture de M. marinum dans un nouveau tube et centrifuger pendant 3 min à 10 000 x g. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS stérile 1 x.</li>
	<li>Diluer jusqu'à atteindre la concentration bactérienne désirée à l’aide de stérile 1 x PBS avec 0,3 mg/mL rouge de phénol comme traceur. Diviser la suspension diluée en trois parties aliquotes. Remarque : Utilisez un prédéterminé de l’OD600 vs UFC (unités formatrices de colonie) / courbe µL pour estimer la dilution requise pour obtenir le nombre voulu de bactéries dans l’injection de 5 µL volume34. La corrélation entre OD600 et la concentration de la suspension bactérienne doit être validé avant de commencer les expériences réelles de l’infection. Réserver deux semaines pour la collecte de ces données de validation.</li>
	<li>Lentement à l’aide d’une seringue de 1 mL, tirez la suspension à travers un G 27 aiguille x 3. Pour chaque aliquote, effectuez cette étape juste avant l’utilisation. Remarque : Ne pas utiliser la même solution bactérienne pendant plus de 2 h.</li>
</ol>3. expérimentale M. marinum Infection par Injection intrapéritonéale
<ol><li>Déposer une goutte de 5 µL de la solution diluée bactérienne sur un morceau de pellicule de parafilm et tirez la goutte dans une aiguille de l’insuline 30 G.</li>
	<li>Utilisez 5 – 8 mois-vieux poisson sauvage et rag1−/−hu1999 mutant pour l’expérience. Anesthésier adult poisson zèbre dans l’eau du réservoir avec 0,02 % 3-aminobenzoïque acide éthyl ester (pH 7,0). Positionner la face ventrale du poisson vers le haut dans une fente sur une mousse plastique humide. Remarque : Rag-/- poissons mutants ne sont pas en mesure de subir une recombinaison somatique et de produire des cellules T et B fonctionnelles.</li>
	<li>Injecter l’aiguille entre les nageoires pelviennes à un angle de 45° environ. Garder l’ouverture de l’aiguille vers le haut pour observer que toute l’ouverture est à l’intérieur de la cavité abdominale. Injecter lentement la suspension bactérienne et retirer délicatement l’aiguille. Remarque : dans le cas où le traceur rouge fuit hors le poisson après injection, exclure les poissons de l’expérience.</li>
	<li>Immédiatement après l’injection, transférer les poissons dans un réservoir de récupération avec frais de réservoir d’eau.</li>
	<li>Prendre des échantillons de la suspension bactérienne sur 7H 10 plaques toutes les 15 min de l’aliquote dans utilisation bactérienne et incuber les bactéries à 29 ° C pendant 5 jours et vérifier la dose de l’infection par comptage des colonies sur les plaques.</li>
	<li>Vérifier le bien-être du poisson régulièrement et euthanasier des poissons présentant des symptômes de l’infection avec plus de 0,02 % concentration de l’ester éthylique de l’acide 3-aminobenzoïque (pH 7,0). NOTE : Environ, 7 % du poisson-zèbre adult infecté par 34 ± 15 UFC et 30 % de poisson-zèbre infectés par 2029 ± 709 UFC aura eu des symptômes de 8 semaines19. Les symptômes peuvent inclure la nage anormale, absence de réponse au toucher, haletant, oedème ou de gaspiller observables.</li>
	<li>Maintenir le poisson-zèbre selon la commune de normes35.</li>
</ol>4. perception des organes internes
<ol><li>Euthanasier le poisson-zèbre avec une surdose de 3-aminobenzoïque l’ester éthylique de l’acide (plus de 0,02 % concentration, pH 7.0) dans le réservoir d’eau.</li>
	<li>Insérer une broche postérieure pour les rayons branchiostèges et l’autre par le biais de la queue de virer le poisson sur la plate-forme.</li>
	<li>Ouvrir la cavité abdominale ensemble avec un scalpel et recueillir les organes internes à l’aide d’une petite cuillère et pincettes sharp à composition non limitée. Commencez du cœur et le long de la colonne vertébrale vers l’arrière pour détacher tous les organes internes en un seul bloc. Remarque : N’oubliez pas de collecter tous les tissus rénaux en grattant le long de la colonne vertébrale avec la cuillère.</li>
	<li>Enfin, utiliser des pinces pour détacher le tube digestif à côté du cloaque et transférer les organes dans un tube d’homogénéisation de 1,5 mL avec six perles en céramique de 2,8 mm. Placer immédiatement sur la glace sèche pour geler l’échantillon. L’échantillon peut être stocké à-80 ° C jusqu'à homogénéisé.</li>
	<li>Rincer les instruments avec l’éthanol à 70 % entre les individus.</li>
</ol>5. homogénéisation et RNA extraction d’un bloc d’orgue.
Remarque : La méthode est modifiée par les protocoles de l’Université de Stanford36.
<ol><li>Ajouter la solution de thiocyanate-phénol de guanidine utilisée pour l’extraction des acides nucléiques (Table des matières) sur le dessus de l’échantillon à un volume total de 1 500 µL. s’assurer que l’échantillon couvre un maximum de 10 % du volume total. ATTENTION : Le volume prévu des tissus récoltés est solution Guanidine 100 µL. sulfocyanure-phénol contient toxique et irritant composés et exige des vêtements protecteurs, gants en nitrile et travailler sous une hotte. Ne pas combiner avec eau de Javel car cela provoquerait la formation de gaz toxiques. Lire la fiche signalétique (FS) avant utilisation.</li>
	<li>Homogénéiser les échantillons à l’aide un homogénéisateur PerLE-battre 3 fois pour 40 s à 3 200 tr/min. Cool sur la glace pendant 30 s entre les cycles. Laisser agir les échantillons homogénéisés dans un bain-marie pendant 9 min.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° C et se déplacent de 1 000 µL de l’homogénat défrichée dans un tube de microcentrifuge frais.</li>
	<li>Ajouter 200 µL de chloroforme, mélanger immédiatement au Vortex pendant 15 s et incuber pendant 2 min à température ambiante. ATTENTION : Le chloroforme est un toxique et irritant composé par inhalation, ingestion ou mis en contact avec la peau ou les yeux. Utiliser des équipements de sécurité nécessaires pour la protection personnelle et travailler sous une hotte. Lire la fiche signalétique (FS) avant utilisation.</li>
	<li>Centrifuger à 12 000 g pendant 15 min à 4 ° C pour séparer les phases aqueuses et organiques.</li>
	<li>Soigneusement, transférer 500 µL de la phase supérieure dans un tube frais pour éviter de contaminer l’ARN. Retirer et jeter le reste de la phase aqueuse (~ 100 µL) et stocker l’interphase et la phase organique à 4 ° C pour l’extraction de l’ADN. Remarque : La phase supérieure contient de l’ARN.</li>
	<li>Ajouter 500 µL de propanol-2 et mélanger immédiatement au Vortex pendant 15 à s. Incuber pendant 10 min à température ambiante à précipiter l’ARN.</li>
	<li>Centrifuger à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C à l’ARN de granule. Retirez le surnageant de pipetage.</li>
	<li>Ajouter 1 mL d’éthanol 75 % et vortexer pendant 10 s. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici, et les échantillons maintenus toute la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Centrifuger à 7 500 x g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez le surnageant de pipetage.</li>
	<li>Répétez les étapes de lavage 5.9 – 5.10. Retirez le surnageant soigneusement en pipettant également, et le culot de laisser sécher à l’air sous une hotte.</li>
	<li>Dissoudre le culot de RNA dans 500 µL d’eau exempte de nucléase et garder les échantillons sur la glace. Mesurer les concentrations avec un spectrophotomètre microvolume ou avec équipement équivalent. Magasin l’ARN à-80 ° C.</li>
</ol>6. purification des extraits de poisson-zèbre et ADN mycobactérien
<ol><li>Préparer un tampon arrière-extraction (BEB) en dissolvant 118,2 g du thiocyanate de guanidine (concentration finale 4 M), 3,68 g de citrate de sodium (concentration finale de 50 mM) et 30,29 g de Tris base libre (concentration finale de 1 M) dans 120 mL d’eau exempte de nucléase (ce qui peut besoin en remuant pendant la nuit). Ajouter l’eau exempte de nucléase pour un volume total final de 250 mL et filtre pour stériliser la solution. Remarque : Cette mémoire tampon peut être stocké à température ambiante pendant 6 mois. Ne pas combiner BEB avec eau de Javel comme ils réagissent pour produire des gaz toxiques tels que le chlorure d’hydrogène et d’acide cyanhydrique.</li>
	<li>Utilisez l’interphase et la phase organique de l’échantillon pour extraire l’ADN mycobactérien. Ajouter 500 μl de BEB dans chaque tube. Mélanger longuement pendant 10 min en le retournant à la température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 12 000 x g pendant 30 min à température ambiante et transvaser avec soin 500 µL de la phase aqueuse supérieure contenant l’ADN dans un nouveau tube.</li>
	<li>Ajouter 400 ml de 2-propanol. Mélanger en retournant et incuber pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. Une pastille contenant l’ADN doit être visible à ce stade. Retirer délicatement le surnageant de pipetage.</li>
	<li>Ajouter 800 μL d’éthanol à 70 %. Laver le culot par inversion. Ne pas vortex les échantillons à ce stade, car l’ADN génomique se décompose facilement.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 15 min à 4 ° C et retirer le surnageant de pipetage. Répéter le lavage de l’éthanol (étapes 6.6 et 6.7).</li>
	<li>Éliminer l’éthanol de pipetage soigneusement. Laissez que sécher à l’air les échantillons pour les 5 à 10 min. dissoudre le culot dans 200 μL d’eau exempte de nucléase.</li>
	<li>Mesure des concentrations d’ADN avec un spectrophotomètre microvolume ou avec équipement équivalent. L’ADN peut être stocké à 4 ° C ou à-20 ° C pour le stockage à long terme.</li>
</ol>7. quantitative PCR pour mesurer les charges mycobactériennes
<ol><li>Préparer des mélanges de réaction qPCR avec no-ROX (carboxy-X-rhodamine) contre le M. marinum espaceur interne transcrit (ITS) entre 16 s-23 s ITS selon les instructions du fabricant avec des amorces MMITS1 (tableau 1). Déposer le mélange de la réaction et dégustez les dilutions comme des doublons sur une plaque de 96 puits pour qPCR. Inclure une série de dilution standard d’ADN d’une quantité connue de bactéries pour chaque série. Remarque : Les attendus M. marinum charge par poisson peut varier de 0 UFC à 1 000 000 UFC à 4 wpi. L’analyse de qPCR peut être également réalisée avec autres kits de qPCR mais la température de recuit pour les amorces doit être ré-optimisé.</li>
	<li>Sceller la plaque avec un film optiquement transparent et centrifuger la plaque à 2 000 x g pendant 2 min à 4 ° C.</li>
	<li>Exécutez le programme de qPCR indiqué dans le tableau 2.</li>
	<li>À l’aide de la courbe d’étalonnage, calculer le nombre de bactéries dans l’échantillon de poissons entiers.</li>
</ol>8. DNase traitement des échantillons d’ARN
<ol><li>Pour supprimer toute trace restant possibles de l’ADN génomique de l’ARN, réalisent DNase I traitement. Décongeler les échantillons d’ARN sur la glace. Remarque : Veillez à utiliser uniquement des solutions et équipement sans RNase et essuyer la surface de travail et des pipettes avec un réactif de décontamination, éliminer les RNases (Table des matières) avant de commencer à travailler. Porter une blouse à manches longues et des gants pour protéger vos échantillons.</li>
	<li>Préparer 10 μL DNase I mélanges de réaction sur la glace selon les instructions du fabricant. Mélanger 1 μL de la DNase I, 1 μL de mémoire tampon DNase 10 x et 8 μL d’ARN goûter comprenant un maximum de 1 µg d’ARN.</li>
	<li>Doucement, mélanger les réactions (aucune agitation) et incuber 30 min à 37 ° C.</li>
	<li>Avant inactivation par la chaleur, ajouter 1 µL de 50 mM EDTA dans chaque échantillon de 10 µL. Si il n’est pas ajouté d’EDTA, l’ARN va subir une dégradation chimique lorsqu’il est chauffé.</li>
	<li>Incuber pendant 10 min à 65 ° C à chaleur-inactiver DNase I. continuer directement à la synthèse de cDNA ou stocker l’ARN imprégnées de DNase à-80 ° C.</li>
</ol>9. synthèse de cDNA
<ol><li>Garder tous les réactifs et des échantillons sur la glace et de préparer les mélanges de réaction selon les instructions du fabricant. Pour un mélange de réaction 5 μL, incluent 1 μL de Reverse Transcription Master Mix, 3 μL d’eau exempte de nucléase et 1 μL de DNase traitement RNA.</li>
	<li>Mélanger délicatement les réactions de la transcriptase inverse et tourner brièvement le tube, si nécessaire.</li>
	<li>Placer les échantillons dans une machine PCR et utiliser le programme indiqué dans le tableau 3.</li>
	<li>Diluer l’ADNc dans de l’eau exempte de nucléase pour qPCR à une concentration maximale de 2,5 ng/μL, si nécessaire. ARNC peut être conservé à-20 ° C.</li>
</ol>10. mesure de l’Expression des gènes de poisson-zèbre par PCR Quantitative
<ol><li>Préparer un mélange maître qPCR sur la glace selon les instructions du fabricant et les protéger de la lumière. Utiliser les amorces a présenté dans le tableau 1. Remarque : Pour calculer le giron de l’induction pour chaque gène, mesurer l’expression également auprès d’un échantillon de référence commun extrait 6 zebrafish sain.</li>
	<li>Préparer les répétitions de chaque échantillon et pipeter les mélanges de réaction sur une plaque de qPCR. Sceller la plaque avec un film optiquement transparent et centrifuger la plaque à 2 000 x g pendant 2 min à 4 ° C avant de commencer la course.</li>
	<li>Exécutez le qPCR programme illustré dans le tableau 4 avec la température de recuit selon la paire d’amorces utilisées (tableau 1).</li>
	<li>Analyser le ratio d’expression de gène par rapport à un gène de ménager (loopern437) avec la méthode ΔCt à l’aide de l’équation : <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58299/58299eq1.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici une application qPCR pour mesurer les charges mycobactériennes de l’ADN extrait de tissus de poisson-zèbre adultes infectés expérimentalement. Cette application est issue des amorces conçues autour de la 16 s-23 s rRNA espaceur interne transcrit séquence40. La charge totale de mycobactéries dans un échantillon de poisson est estimée à l’aide d’une courbe d’étalonnage préparée à partir d’ADN extrait un nombre connu de mycobactéries cultivées et en supposant qu’une bactérie a une ...

Poisson zèbre (Danio rerio) est un modèle animal largement utilisé dans la recherche biomédicale et c’est un modèle accepté pour la biologie des vertébrés commun. Le poisson-zèbre a été adapté à de nombreux domaines de recherche modélisation des maladies humaines et troubles allant du cancer1 et2 de la maladie cardiaque aux maladies infectieuses et immunologiques de plusieurs bactéries 3 et infections virales4 , 5. en outre, le développement ex utero des embryons de poisson-zèbre a rendu le poisson-zèbre un modèle populaire en biologie du développement6 et toxicologie7,8.
Dans de nombreux domaines de recherche, y compris la biologie de l’infection, les larves de poisson zèbre optiquement transparent sont couramment utilisés. Les premières cellules immunitaires apparaissent dans les 24 h après la fécondation (hpf), lorsque les macrophages primitifs sont détectés9. Les neutrophiles sont les cellules immunitaires prochaines à apparaître environ 33 hpf10. Les larves de poisson zèbre sont donc réalisables pour étudier les premiers stades de l’infection et le rôle de l’immunité innée en l’absence de cellules immunitaires adaptatives11. Cependant, le poisson-zèbre adult avec ses entièrement fonctionnelle du système immunitaire adaptatif fournit une couche supplémentaire de complexité pour les expériences d’infection. Les lymphocytes T peuvent être détectées autour de 3 jours après la fécondation,12, et les cellules B sont capables de produire des anticorps fonctionnels par 4 semaines après la fécondation13. Le poisson-zèbre adult a tous les principaux homologues du système immunitaire inné et adaptatif chez les mammifères. Les principales différences entre les immune systems de poissons et les humains sont trouvent dans les isotypes d’anticorps ainsi que dans l’anatomie des tissus lymphoïdes. Le poisson-zèbre a anticorps seulement trois classes14, alors que les humains ont cinq15. En l’absence de la moelle osseuse et les ganglions lymphatiques, les organes lymphoïdes primaires chez les poissons sont les reins et le thymus16 et la rate, le rein et l’intestin servent dans les organes lymphoïdes secondaires17. Malgré ces différences, avec son arsenal complet immunitaire des cellules innées et adaptatives, le poisson-zèbre adult est un modèle très applicable, facile à utiliser, non-mammifère pour les études sur les interactions hôte-pathogène.
Le poisson-zèbre a dernièrement été créé comme un modèle possible d’étudier la tuberculose18,19,20,21,22. La tuberculose est une maladie aéroportée causée par Mycobacterium tuberculosis. Selon l’Organisation mondiale de la santé, la tuberculose due à1,7 million de décès en 2016 et est la principale cause de décès par un pathogène unique dans le monde entier23. Souris24,25, les lapins26 et les primates non humains,27 sont que des modèles l’animal plus connu dans la recherche de la tuberculose mais chaque visage leurs limites. Le modèle primate non humain de M. tuberculosis infection ressemble à la maladie humaine plus étroitement, mais à l’aide de ce modèle est limité en raison de considérations éthiques graves. Autres modèles animaux sont entravés par la spécificité de l’hôte de M. tuberculosis qui influe sur la pathologie de la maladie. Probablement le plus gros problème dans la modélisation de la tuberculose est la gamme large des résultats infection et la maladie dans la maladie humaine : la tuberculose est une maladie très hétérogène, allant de la stérilisation immunité aux infections latentes, active et réactivées28 , qui peut être difficile à reproduire et à modeler de façon expérimentale.
Mycobacterium marinum est un proche parent de M. tuberculosis avec protéines orthologues ~ 3 000 avec 85 % d’acides aminés identité29. M. marinum infecte naturellement le poisson-zèbre, produisant des granulomes, les maîtres mots de la tuberculose, dans ses organes internes19,30. Contrairement à d’autres modèles animaux utilisés en recherche de la tuberculose, zebrafish produit beaucoup de progéniture, il nécessite seulement un espace limité et surtout, il est neurophysiologically le modèle de la tuberculose vertébrés moins avancé disponible. En outre, l’infection de M. marinum provoque une infection latente, une maladie active ou même stérilisation des infections à mycobactéries chez le poisson zèbre adulte, étroitement imitant le spectre des issues des maladies de la tuberculose humaine19, 31 , 32. nous décrivons ici les méthodes pour le modèle de la tuberculose expérimentale du poisson-zèbre adulte en injectant M. marinum dans la cavité abdominale et à l’aide de la PCR quantitative pour mesurer les charges mycobactériennes et les réponses immunitaires de poisson-zèbre échantillons de tissus.

<table><tbody><tr><td>Mycobacterium marinum</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 927</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock 7H10 agar</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11799042</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock OADC enrichment</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11718173</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock 7H9 medium</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11753473</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrock ADC enrichment</td><td>BD, Thermo Fisher Scientific</td><td>11718173</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre GENESYS20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comprimés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Rouge phénolique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 27 G</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004020</td><td></td></tr><tr><td>1 mL seringue</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 100 30 G Aiguille à insuline</td><td>Braun</td><td>9151133</td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoïque ester éthylique (pH 7,0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tube d’homogénéisation</td><td>Qiagen</td><td>13119-1000</td><td></td></tr><tr><td>Perles en céramique de 2,8 mm</td><td>Qiagen</td><td>13114-325</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, ETAX Aa</td><td>Altia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>VWR</td><td>22711.290</td><td></td></tr><tr><td>Thiocyanate de guanidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9277</td><td>FW 118,2 g/mol</td></tr><tr><td>Citrate</td> <td>de sodiumSigma-Aldrich</td><td>1613859</td><td>FW 294.1 g/mol</td></tr><tr><td>Tris (base libre)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td>FW 121.14 g/mol</td></tr><tr><td>Réactif TRI</td><td>Centre de recherche moléculaire</td><td>TR118</td> Solution de <td>thiocyanate-phénol de guanidine</td></tr><tr><td>Solution PowerLyzer24 Homogénéisateur</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator m08</td><td>Finnsonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SENSIFAST No-ROX SYBR, Green Master Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-98005</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Plaque 96 puits</td><td>BioRad</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Film optiquement transparent</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Thermocycleur avec système en temps réel CFX96</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10666421</td><td>réactif de décontamination éliminant les RNases</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Transcription inverse Master Mix</td><td>Fluidigm</td><td>100-6298</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green master mix</td><td>BioRad</td><td>172-5211</td><td></td></tr></tbody></table>

modélisation de la tuberculose chez mycobacterium marinum adultes infectés poisson zèbre

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis est actuellement la plus meurtrière pathogène humain causant des infections 10,4 millions et 1,7 millions de décès chaque année. L’exposition à cette bactérie provoque un spectre large de la maladie chez les humains, allant d’une infection stérilisée à une maladie mortelle activement progresse. La forme la plus courante est la tuberculose latente, qui est asymptomatique, mais a le potentiel pour réactiver en une maladie fulminante. Poisson zèbre adulte et son naturel pathogène Mycobacterium marinum ont récemment prouvé un modèle il y a lieu d’étudier le spectre large de la maladie de la tuberculose. Ce qui est important, latence spontanée et réactivation ainsi que des réponses immunitaires adaptatives dans le cadre des infections à mycobactéries peuvent être étudiées dans ce modèle. Dans cet article, nous décrivons des méthodes pour l’infection expérimentale de poisson-zèbre adulte, la collection des organes internes pour l’extraction des acides nucléiques pour la mesure des charges mycobactériennes et réponses immunitaires hôte par PCR quantitative. L’in-house-développé, M. marinum -essai de qPCR spécifique est plus sensible que les méthodes traditionnelles de placage car il détecte également les ADN des mycobactéries non-divisant, dormants ou morts récemment. Comme l’ADN et l’ARN sont extraites de la même personne, il est possible d’étudier les relations entre l’état du malade et l’expression génique hôte et du pathogène. Le modèle de poisson-zèbre adulte pour la tuberculose se présente donc comme un système hautement applicable non mammifères in vivo pour étudier les interactions hôte-pathogène.

L’agent pathogène du poisson naturel Mycobacterium marinum infecte les organes internes du poisson-zèbre et produit une infection systémique avec granulomes visibles sur le plan histologique,19. Poisson zèbre adulte sont infectés par M. marinum par injection intrapéritonéale. L’ADN et l’ARN sont extraits, et la charge mycobactérienne est mesurée par quantitative polymerase chain reaction (qPCR) en utilisant l’ADN comme modèle. Les grandes lignes d...

Nous présentons ici un protocole à la tuberculose humaine de modèle dans un poisson-zèbre adulte à l’aide de son naturel pathogène Mycobacterium marinum. Extraits ADN et l’ARN des organes internes du poisson-zèbre infecté peuvent servir à révéler que le total mycobactériens charge dans le poisson et les réponses immunitaires de l’hôte avec le qPCR.

Modélisation de la tuberculose chez Mycobacterium marinum adultes infectés poisson zèbre

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la tuberculose telles que le rôle des réponses immunitaires adaptatives et la pathogénie de cette maladie multifactorielle. Le principal avantage de cette méthode de base de l’acide nucléique est que les charges bactériennes et les niveaux d’expression des gènes peuvent être mesurés à partir du même individu. Pour commencer cette procédure, culture M.marinum sur une plaque 7H10 tel que décrit dans le protocole texte.Transférez 10 millilitres de milieu 7H9 contenant l’enrichissement d’ADC, le polysorbate 80, et le glycérol à un flacon de culture cellulaire. Ensuite, utilisez une boucle stérile d’inoculation microliter pour transférer aseptiquement une boucle de la masse bactérienne M.marinum dans le flacon. Laissez le bouchon lâche ou utilisez un bouchon de filtre pour permettre un échange de gaz et une culture suffisants à 29 degrés Celsius dans l’obscurité sans trembler pendant trois à quatre jours jusqu’à ce que l’OD600 atteigne environ 0,7.Diluer et continuer à culturer les bactéries comme décrit dans le texte. Pour commencer à préparer la solution bactérienne pour l’infection, transférer un millilitre de la culture dans un tube frais. Centrifugeuse à 10 000 g pendant trois minutes.Retirez le supernatant et réutilisez la pastille en un millilitre de PBS stérile. À l’aide d’un PBS stérile avec un millilitre de 0,3 milligramme par millilitre de rouge phénol comme traceur, diluer la suspension pour atteindre la concentration bactérienne désirée. Après cela, utilisez une seringue d’un millilitre pour tirer lentement la suspension à travers une aiguille de calibre 27 trois fois.Effectuez cette étape juste avant l’utilisation pour chaque aliquot. Tout d’abord, pipette une gouttelette de cinq microlitres de la solution bactérienne diluée sur un morceau de film de paraffine. Ensuite, tirez la gouttelette dans une aiguille d’insuline de calibre 30.Utilisez un poisson de cinq à huit mois pour cette expérience avec l’un étant un poisson de type sauvage et l’autre étant un poisson mutant chiffon. Placez ces poissons côté ventral vers le haut dans les fentes d’un morceau de plastique mousseux humide. Injecter l’aiguille d’insuline entre les nageoires pelviennes à un angle de 45 degrés.Gardez l’aiguille ouverte vers le haut pour vous assurer que toute l’ouverture est à l’intérieur de la cavité abdominale. Ensuite, injectez lentement la solution bactérienne. Après cela, retirez soigneusement l’aiguille et transférez immédiatement le poisson dans un réservoir de récupération rempli d’eau de réservoir frais.Prélevez des échantillons de l’aliquot bactérien utilisé toutes les 15 minutes sur des plaques de 7H10. Incuber ces échantillons à 29 degrés Celsius pendant cinq jours pour vérifier la dose d’infection. Vérifiez régulièrement le bien-être des poissons, en vous assurant d’euthanasier tous les poissons présentant des symptômes d’infection en les incubant dans l’eau avec plus de 0,02 % de l’ester éthylique à 3 acides aminobenzoïques.Après avoir euthanasié le poisson, insérez une épingle postérieure aux rayons branchiostegal. Insérez une deuxième broche à travers la queue pour clouer le poisson sur la plate-forme. À l’aide d’un scalpel, ouvrir toute la cavité abdominale.Ensuite, utilisez une petite cuillère et des pinces à épiler pointues pour recueillir les organes internes à partir du cœur et de travailler le long de la colonne vertébrale vers la queue pour détacher tous les organes internes en un seul bloc. Utilisez des pinces à épiler pour détacher le filet d’intestin du cloaque et transférer les organes dans un tube d’homogénéisation de 1,5 millilitre contenant une demi-douzaine de perles de céramique de 2,8 millimètres. Placez immédiatement le tube sur de la glace sèche pour congeler l’échantillon.Conserver l’échantillon à 80 degrés Celsius négatif jusqu’à ce qu’il soit prêt à homogénéiser. Après avoir extrait l’ADN et l’ARN, mesurez les charges mycobactériennes par PCR quantitatif tel que décrit dans le protocole de texte. Dans cette étude, le poisson zèbre adulte est infecté par M.marinum par injection intraperitoneal.Une dose élevée d’infection est considérée comme conduire à une maladie progressive dans laquelle la charge mycobactérienne continue d’augmenter jusqu’à ce que la charge moyenne atteint environ cinq millions de bactéries finalement tuer le poisson. Une faible dose d’autre part conduit au développement d’un spectre de la maladie similaire à celui observé dans la tuberculose humaine avec des infections progressives, latentes, réactivées et stérilisées. Dans ce cas, la charge continue d’augmenter pendant quatre semaines, après quoi la maladie atteint un état stable dans la majorité des poissons.Ces données révèlent que le nombre initial de mycobactéries utilisées pour infecter les poissons est un déterminant essentiel pour l’issue de l’infection. On voit que le poisson zèbre mutant du chiffon est incapable de limiter suffisamment la croissance des mycobactéries, ce qui entraîne des charges bactériennes plus élevées et une morbidité accrue. Ceci démontre clairement l’importance de l’immunité adaptative en contrôlant l’infection mycobactérienne.Les niveaux d’interleukine-4 sont significativement plus élevés dans le groupe sauvage de type révélant que la réponse adaptative est exigée pour l’introduction efficace de l’interleukin-4, mais dispensable pour l’introduction du gamma d’interféron après infection mycobactérienne. Ce protocole permet la collecte de l’ADN et de l’ARN à partir du même échantillon, ce qui permet de combiner la charge mycobactérienne de l’échantillon avec les données d’expression génétique de l’hôte et des bactéries. Cette technique peut être combinée avec l’administration de médicaments ou de vaccins candidats pour évaluer leur effet sur les charges mycobactériennes et les réponses immunitaires.Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de suivre les directives locales pour la sécurité personnelle et l’élimination des déchets lorsque vous travaillez avec un agent pathogène de niveau de biosécurité deux. Cette technique permet d’étudier à la fois la tuberculose active et latente avec des mycobactéries dormantes chez le poisson zèbre qui est un modèle in vivo non mammifère éthique.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Embryons de poisson zèbre transparent ont prouvé hôtes modèle utile pour visualiser et les interactions entre l'étude fonctionnellement les cellules immunitaires innées et bactéries pathogènes intracellulaires, tels...

L&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

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Imagerie en direct de la mort cellulaire des macrophages lors d’une infection mycobactérienne chez les embryons de poisson-zèbre

Source : Bernut, A., et al. Déchiffrer et imager la pathogenèse et le cordon de Mycobacterium abscessus chez les embryons de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo démontre un protocole utilisant des embryons transgéniques de poisson-zèbre exprimant des macrophages fluorescents et infectés par la souche rugueuse fluorescente Mycobacterium abscessus pour visualiser les interactions hôte-pathogène. Elle révèle comment le cordon extracellulaire permet l’évasion immunitaire, favorisant la...

Imagerie en direct des interactions hôte-pathogène chez des embryons de poisson-zèbre infectés par Mycobacterium abcessus

Source : Luukinen, H., et al. Modéliser la tuberculose chez le poisson-zèbre adulte infecté par Mycobacterium marinum .  J. Vis. Exp. (2018).

Évaluation du rôle de l’immunité de l’hôte dans l’infection mycobactérienne à l’aide d’un modèle de poisson-zèbre

Source : Flores, E., et al. Utilisation du protozoaire Paramecium caudatum comme véhicule pour les infections alimentaires chez les larves de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2019).Cette vidéo démontre la méthode pour établir un modèle d’infection intestinale bactérienne d’origine alimentaire chez les larves de poisson-zèbre en les nourrissant avec des paramecia infectées par E. coli fluorescent.

Modéliser l’infection intestinale chez les larves de poisson-zèbre à l’aide de bactéries d’origine alimentaire

Cet article décrit la vidéo pipeline à haut débit qui a été mis en place avec succès pour infecter et d'analyser un grand nombre d'embryons de poisson zèbre qui fournissent un nouvel outil puissant pour les essais en enclos et la découverte de médicaments à l'aide d'un organisme entier de animaux vertébrés.

Création et optimisation d&#39;une installation à haut débit pour l&#39;étude<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Et<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infection comme un modèle pour la découverte de médicaments

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Décrypter et de l&#39;imagerie et la pathogenèse de Cording<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Dans embryons de poissons zèbres

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Visualisation de la mort des cellules lytiques de Macrophage pendant l'infection mycobactérienne dans les embryons de poisson zèbre par l'intermédiaire de la microscopie intravitale

Il existe actuellement un manque de modèles in vivo permettant le dépistage de médicaments contre les infections bactériennes chroniques. Ici, nous décrivons un protocole d’infection de la plaie par un isolat clinique de Pseudomonas aeruginosa pour générer une infection persistante chez les larves de poisson-zèbre.

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Découvrez la modélisation de la tuberculose chez le poisson zèbre adulte infecté par Mycobacterium marinum. Cette méthode permet d'extraire l'ADN et l'ARN pour quantifier les charges bactériennes et les réponses immunitaires par qPCR.

Modélisation de la tuberculose chez Mycobacterium marinum adultes infectés poisson zèbre

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