Oeufs fécondés de livraison assistée par laser des gènes gène aux souris
1 novembre 2018
Souris fécondés et les embryons au stade précoce sont protégés par la zone pellucide, une matrice de glycoprotéine qui forme une barrière contre la livraison de gène. Cet article décrit un protocole pour perforer le zona avec un laser à transduce des cellules embryonnaires avec vecteurs LENTIVIRAUX et à créer des souris transgéniques.
Il s’agit d’une méthode alternative et facile à utiliser pour délivrer des gènes d’intérêt aux oeufs de souris fécondés par perforation laser de la zona pellucida et la livraison du gène lentiviral. La perforation assistée au laser de la procédure de donneur de souris peut également s’appliquer aux ovules fécondés d’autres espèces pour faciliter l’entrée d’autres types de virus ou de réamen transfection. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite pas de compétences spécialisées pour la micromanipulation et la micro-injection des œufs de souris fécondés.
Page Myers, chercheur à la direction de la médecine comparée au NIEHS, fera la démonstration d’une procédure d’isolement des ovules de souris fécondés. 16 à 24 heures après l’accouplement, isoler les ovaires et les ovules des souris femelles avec des bouchons vaginaux, selon les protocoles standard. Lorsque tous les tissus ont été recueillis, déchirer l’ampulla de chaque ovaire, et libérer les ovules fécondés, entourés de cellules cumulées, et transférer les œufs dans des cellules cumulées à un plat de 35 millimètres contenant un x hyaluronidase dans le milieu M2 frais, pour une incubation de trois à cinq minutes à température ambiante.
Pipette les oeufs à quelques reprises pour libérer les cellules cumulées, et transférer les œufs dans un nouveau plat de 35 millimètres contenant M2 moyen, avec pipetting pour laver l’enzyme. Ensuite, transférez les œufs lavés dans un plat de 35 millimètres contenant du simplex de potassium optimisé moyen, ou KSOM, et pipette pour laver le reste M2 moyen et hyaluronidase. Ensuite, transférez les œufs dans des plaques traitées de culture tissulaire de 35 millimètres épépinées de 50 microlitres de KSOM et de deux millilitres de diméthylpolysiloxane pendant un équilibre de deux heures à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et d’oxygène et 90 % d’azote.
Pendant que les oeufs sont dans l’incubateur, installez et étalonnez le laser XYClone, selon les recommandations du fabricant. Lorsque les œufs sont prêts, placez la première plaque de chute sur le stade du microscope laser, et concentrez manuellement la zona pellucida. Après avoir confirmé que la lumière LED laser est visible à travers l’objectif, déplacer le stade microscope pour cibler la zona avec le laser LED, et utiliser le logiciel pour définir le laser XYClone à 250 microsecondes.
Réglez la taille de la lumière LED aux dimensions appropriées, et perforer la zona pellucida de chaque œuf trois fois avec le laser pour produire trois trous de 10 micromètres. Il est essentiel d’effectuer la perforation rapidement, mais avec soin, car les œufs fécondés ne peuvent pas rester à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de 15 minutes. Ensuite, retournez les œufs perforés à l’incubateur pendant encore deux heures.
À la fin de la deuxième incubation, traiter la baisse de 50 microlitres KSOM avec deux microlitres de lentivirus concentré sans mélange. Et retourner les œufs à l’incubateur pendant quatre jours. Lorsque les ovules se sont développés en blastocystes, utilisez un dispositif non chirurgical de transfert d’embryons, pour déposer environ 10-15 embryons dans environ deux microlitres de KSOM.
17 jours après le transfert de l’embryon, permettre à la souris enceinte d’accoucher naturellement ou de recueillir les nouveau-nés par césarienne si nécessaire. Ensuite, recueillir les tissus des chiots pour le génotypage, pour déterminer le taux de transgenèse. Le développement isolé et transduced d’oeuf fertilisé de souris peut être vérifié sous le microscope quotidiennement.
60 à 70 % des embryons sains et non traités se développent en blastocystes dans un délai de trois à quatre jours. Alors qu’environ 47% des embryons transforés au laser se développent en blastocystes, dont 85% expriment le gène transduced d’intérêt. Viser le laser pour amincir la zona, au lieu de créer un trou, permet aux embryons en développement de bénéficier d’une zona pellucida intacte et encapsulante tout en restant permissif à la transduction lentivirale.
La transduction avec un lentivirus recombinant, exprimant le GFP de copepod d’un promoteur de facteur d’allongement 1A induit des intégrations lentiviral multiples, et une expression élevée de GFP sous une lampe bleue de LED. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que, tandis que la capacité des lentivirus à s’intégrer dans le génome hôte en fait un outil puissant pour la livraison stable des gènes, mais l’intégration aléatoire peut également introduire des mutations insertionnelles. Cette technique pourrait permettre aux chercheurs dans le domaine de la génétique de développer rapidement des modèles animaux transgéniques pour l’étude des maladies pour la production de protéines in vivo, ou pour des études génétiques fonctionnelles.
Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’immunohistochimie peuvent être effectuées sur des échantillons de tissus isolés provenant de chiots transduced pour répondre à des questions supplémentaires sur l’emplacement et l’étendue de l’expression des gènes dans divers tissus d’intérêt. N’oubliez pas que travailler avec des lentivirus peut être extrêmement dangereux. Veuillez donc suivre vos directives institutionnelles pour travailler avec les lentivirus.
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Aperçu
Cette étude aborde la livraison de gènes dans des œufs fécondés de souris par perforation au laser de la zone pellucide, permettant ainsi la transduction par des vecteurs lentiviraux. Le protocole décrit une méthode pour générer des souris transgéniques en nécessitant des compétences spécialisées minimales, ce qui pourrait avoir des applications chez d'autres espèces.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Génétique
- Biologie du développement
- Méthodes de transfert de gènes
Contexte
- La zone pellucide comme barrière lors du développement embryonnaire précoce
- Difficultés liées à la livraison de gènes dans les cellules embryonnaires
- Importance du développement de modèles transgéniques pour la recherche
Méthodes utilisées
- Technique de perforation assistée par laser
- Embryons de souris comme modèle biologique
- Système de transfert génique par lentivirus
Résultats principaux
- 70 % des embryons sains se développent en blastocystes ; 47 % des embryons transduits atteignent le même stade
- 85 % des embryons transduits expriment le gène d'intérêt
- La technique permet le développement rapide de modèles animaux transgéniques
Conclusions
- La méthode facilite efficacement l'acheminement stable de gènes dans les embryons de souris
- Des implications importantes pour les études in vivo liées aux maladies génétiques
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La livraison assistée par laser de lentivirus à des œufs fécondés de souris résout un goulot d'étranglement majeur dans la génération de modèles transgéniques en éliminant le besoin d'expertise en micromanipulation. Cette approche améliore l'accès à la modification stable de la lignée germinale pour la validation ciblée et le criblage phénotypique en phase précoce de découverte. En permettant une transduction lentivirale efficace sans microinjection, la méthode soutient la création à grande échelle de systèmes pertinents pour les maladies, destinés à la détection préclinique des risques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet une livraison stable de gènes dans les cellules embryonnaires pour l'interrogation fonctionnelle de cibles thérapeutiques et la modulation de voies biologiques.
- Valeur opérationnelle : Réduit la dépendance vis-à-vis d'embryologistes hautement qualifiés, élargissant ainsi l'accès à la création de modèles transgéniques au sein des équipes de recherche.
- Valeur prédictive : Facilite la génération de modèles transmissibles par la lignée germinale pour l'évaluation du phénotype et du mécanisme ciblés, avec une forte confiance translationnelle.
Développement de criblage et de tests
- Valeur scientifique : Produit des embryons transduits par un lentivirus qui se développent en blastocystes, offrant un système évolutif pour des lectures phénotypiques en stade précoce.
- Valeur opérationnelle : Standardise la perforation de la zone pellucide au moyen de paramètres laser (250 microsecondes, trois trous de 10 micromètres), améliorant ainsi la reproductibilité entre laboratoires.
- Préparation des tests : Génère des embryons adaptés à des applications en aval telles que l'immunohistochimie, permettant d'évaluer les profils d'expression du transgène dans les tissus d'intérêt.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Les embryons transduits implantés chez des souris pseudogestantes donnent naissance à des souriceaux transgéniques, permettant une progression fluide de la découverte à la validation in vivo.
- Pertinence des modèles de maladie : Permet la création rapide d'animaux transgéniques pour l'étude de la fonction des gènes dans des modèles de maladies génétiques et dans des études de production de protéines.
- Atténuation des risques : L'intégration génomique stable du matériel viral lentiviral autorise des études d'expression à long terme, bien que le risque de mutagenèse par insertion doive être pris en compte dans la conception expérimentale.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, soutenant la validation ciblée guidée par des hypothèses grâce à la transduction d'embryons et permettant l'identification de candidats thérapeutiques par le biais de modèles transmissibles par voie germinale.
- Biologie de la découverte : Permet la détection précoce des risques biologiques en testant la fonction des gènes dans des systèmes embryonnaires intacts avant la génération d'animaux.
- Criblage : Les paramètres de perforation laser (250 microsecondes, perforation triple) assurent une modification constante de la zone pellucide, permettant un accès fiable au lentivirus.
- Analytique : Le taux de formation de blastocystes (47 % des embryons transduits) et le taux d'expression du transgène (85 % des blastocystes) fournissent des critères quantitatifs pour évaluer l'efficacité.
- Recherche translationnelle : Le transfert d'embryons chez des femelles pseudogestantes permet le développement in vivo de souriceaux transgéniques pour des études phénotypiques et mécanistiques.
- Réutilisation en milieu professionnel : L'adaptabilité du protocole à d'autres espèces ainsi qu'à différents types de virus ou réactifs en fait une plateforme réutilisable pour la génération de modèles transgéniques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : La transmission germinale stable et l'expression élevée du transgène (85 % des blastocystes) augmentent la confiance dans l'attribution du phénotype ciblé.
- Valeur opérationnelle : Supprime le besoin d'équipement de microinjection et de formation spécialisée, réduisant ainsi les obstacles techniques à la génération de modèles transgéniques.
- Valeur stratégique : Accélère les décisions d'aller ou de ne pas aller de l'avant lors de la validation ciblée en raccourcissant les délais de disponibilité des modèles in vivo.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles grâce à la génération rapide de systèmes pertinents pour les maladies en vue d'une évaluation préclinique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des embryons et dans les protocoles de biosécurité liés aux lentivirus, conformément aux directives institutionnelles.
- Dépend de l'étalonnage du système laser XYClone et des paramètres de perforation contrôlés par logiciel (250 microsecondes).
- Exige des conditions standardisées de culture des embryons (milieu KSOM, 37 °C, 5 % CO2) pour un développement embryonnaire régulier jusqu’au stade blastocyste.
- L’adaptation à d'autres espèces nécessite une optimisation des paramètres laser et de l'épaisseur de la zone pellucide.
- Limite pratique : la perforation doit être réalisée en moins de 15 minutes en dehors de l’incubateur afin de préserver la viabilité de l’embryon.
