Système de Culture cellulaire 3D pour étudier l’Invasion et l’évaluation thérapeutique dans le Cancer de la vessie

Les processus d’invasion du cancer de la vessie représentent des occasions de biomarqueurs et de développement thérapeutique. Ici, nous présentons un modèle d’invasion de cancer de la vessie qui intègre la culture 3D des sphéroïdes de tumeur, Time-lapse imagerie et microscopie confocale. Cette technique est utile pour définir les caractéristiques du processus invasif et pour le dépistage des agents thérapeutiques.

La progression invasive est un déterminant crucial de l’issue clinique chez les patients atteints d’un cancer de la vessie. Ici, nous décrirons une méthode in vitro simple, qui utilise des sphéroïdes tumoraux générés à l’aide de lignées cellulaires ou de tumeurs primaires pour étudier l’invasion. Le principal avantage de cette technique est que nous sommes en mesure de surveiller le processus d’invasion du cancer en temps réel, et également d’utiliser la coloration immunofluorescente pour interroger les échantillons à la fin de l’expérience.

Cette technique peut être adaptée pour incorporer d’autres types de cellules, telles que les cellules fibroblastiques ou immunitaires. Il peut également être utilisé pour tester des composés qui pourraient être utiles pour bloquer l’invasion. Les facteurs critiques de succès comprennent l’optimisation de la formation des sphéroïdes tumoraux et l’intégration dans le collagène, l’utilisation d’une microscopie appropriée avec une distance de travail correcte et des procédures d’immunocoloration appropriées.

Pour commencer à générer des sphéroïdes à partir de lignées cellulaires, cultivez des cellules cancéreuses de la vessie humaine dans des conditions de culture cellulaire d’adhérence conventionnelles. Un jour avant l’expérience, essayez de tester les cellules et distribuez 1 000 000 cellules dans trois millilitres de milieu de culture cellulaire dans chaque puits d’une plaque à six puits. Ensuite, incubez les cellules dans des conditions de faible fixation à 37 degrés Celsius pendant au moins 16 heures.

Pour générer des sphéroïdes à partir de tumeurs primaires, collectez et lavez des morceaux de tumeur cubiques de 0,5 millimètre dans cinq millilitres de PBS glacé. Centrifugez les morceaux de tumeur à 200 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après cela, collectez les morceaux de tumeur par centrifugation à 200 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Retirez ensuite le surnageant et ajoutez cinq millilitres de DMEM complété par 10 % de FBS. Transférez le mélange de média sphéroïde tumoral dans une plaque d’attache ultra basse à six puits. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant au moins 16 heures.

Tout d’abord, diluez le collagène de type 1 dans du DMEM complété par 10 % de FBS pour obtenir un mélange de deux milligrammes par millilitre. Ensuite, enduisez rapidement les puits d’une lame de chambre avec le mélange. Gardez la lame de chambre immobile à température ambiante pendant 15 minutes.

Ensuite, pipetez doucement 500 microlitres de média sphéroïde de la plaque de fixation ultra-basse dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre. Laissez ensuite les sphéroïdes se déposer au fond du tube pendant deux minutes. Retirez délicatement le surnageant du tube.

Ajoutez ensuite rapidement 500 millilitres de mélange de collagène DMEM frais aux sphéroïdes. Pipetez de haut en bas pour mélanger délicatement les sphéroïdes et le collagène. Ensuite, ajoutez 250 microlitres du mélange de collagène sphéroïde dans les puits de la lame de chambre recouverte de collagène.

Laissez la matrice de collagène contenant le sphéroïde se solidifier complètement. Une fois que la matrice de collagène s’est solidifiée, ajoutez un millilitre de DMEM complété par FBS dans chaque puits des lames de la chambre. Ensuite, incubez la lame de chambre à 37 degrés Celsius avec 5 % de CO2.

Préparez le microscope confocal selon les instructions du fabricant et assurez-vous que la chambre climatique atteint 37 degrés Celsius et qu’elle est alimentée à 5 % de CO2. Ensuite, transférez la lame de chambre sur l’adaptateur de lame de microscope. À l’aide d’un objectif de faible puissance, localisez les sphéroïdes d’intérêt, puis commencez l’imagerie avec un objectif de haute puissance et effectuez une imagerie en accéléré pendant 24 à 72 heures.

Tout d’abord, utilisez de petites pinces pour soulever le bloc de gel de collagène et les sphéroïdes de la lame de chambre. Placez ensuite le bloc de gel de collagène dans un moule d’histologie en plastique. Rincez brièvement le bloc de gel de collagène avec 1x PBS.

Et fixez-le avec 4 % de PFA et de PBS pendant 30 minutes à température ambiante. Après cela, lavez le bloc de gel de collagène avec 1,5 millilitres de 1x PBS sur un shaker pendant 15 minutes. Appliquez une fine couche de composé OTC au fond d’un nouveau moule d’histologie en plastique.

Placez ensuite le bloc de gel de collagène fixé et lavé sur le composé OTC avant de remplir soigneusement le reste du moule avec du composé OTC. Conservez le moule à quatre degrés Celsius pendant une heure. Après cela, congelez le moule sur une boîte de Pétri de 100 millimètres flottant sur de l’azote liquide et stockez les échantillons à moins 80 degrés Celsius.

Transférez le bloc d’échantillon congelé dans la chambre à moins 20 degrés Celsius d’un cryostat. Effectuez ensuite un sectionnement congelé conventionnel avec un intervalle de section de sept micromètres. Après cela, faites sécher les lames à l’air libre pendant une heure à température ambiante.

Perméabilisez ensuite les échantillons pendant 15 minutes avec du PBS contenant 0,5 % de Triton X-100. Ensuite, lavez les échantillons avec du PBS trois fois pendant 10 minutes chacune. Encerclez ensuite les échantillons avec un stylo-barrière hydrophobe.

Traitez les échantillons avec une solution bloquante pendant une heure à température ambiante. Appliquez ensuite 40 microlitres de solution contenant des anticorps primaires sur chaque échantillon. Incuber les lames pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Après cela, lavez l’échantillon trois fois avec du PBS pendant 15 minutes par lavage. Ensuite, appliquez 40 microlitres de solution contenant des anticorps secondaires sur chaque échantillon. Ensuite, lavez les échantillons trois fois avec du PBS pendant 15 minutes par lavage.

Colorer l’échantillon avec la solution Hoechst 33342 à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, lavez les échantillons avec du PBS pendant cinq minutes. Montez les échantillons avec un support de montage et couvrez-les avec des lamelles.

Enfin, laissez les lames dans l’obscurité à température ambiante pendant 24 heures avant d’effectuer une microscopie confocale. Dans ce protocole, des sphéroïdes tumoraux invasifs du cancer de la vessie ont été formés à partir de lignées cellulaires et de tumeurs primaires. Une vidéo représentative en accéléré démontre l’invasion sphéroïde de la tumeur du cancer de la vessie dans la matrice de collagène.

vidéo représentative en accéléré démontre le comportement invasif des sphéroïdes tumoraux du cancer de la vessie marqués à la GFP seuls ou co-cultivés avec des fibroblastes marqués à la RFP. Pour démontrer la faisabilité de l’utilisation de la coloration immunofluorescente des marqueurs protéiques, les sphéroïdes ont été fixés, sectionnés et colorés à 24 ou 72 heures. La vue à plus haut grossissement des sphéroïdes UM-UC-14 montre une coloration filamenteuse pour la protéine associée au groupe D de l’ataxie télangiectasie.

Les cellules hautement invasives disséminées à partir des sphéroïdes UM-UC-18 après 24 heures d’invasion, expriment un niveau élevé de Vimentine, un marqueur de la transition épithéliale à mésenchymateuse. Ce test est utile pour les dépistages limités d’inhibiteurs pharmacologiques de l’invasion du cancer de la vessie. La cytochalasine D est utilisée ici pour représenter l’inhibition pharmacologique de l’invasion.

Nous décrivons ici un modèle qui permet d’observer en temps réel l’invasion du cancer de la vessie. Ce système se prête à l’incorporation de divers composants stromaux et cellulaires, ce qui permet aux chercheurs de mieux récapituler le microenvironnement tissulaire où se produit l’invasion du cancer de la vessie. Ce système fournit non seulement un outil utile pour étudier l’invasion dans un environnement 3D, mais convient également au criblage limité de composés pharmaceutiques qui ont le potentiel de bloquer l’invasion des cellules cancéreuses.