Une méthode automatisée pour déterminer la Performance de la drosophile en réponse aux changements de température dans l’espace et le temps
12 octobre 2018
Nous présentons ici un protocole pour déterminer automatiquement la performance locomotrice de la drosophile aux changements de température à l’aide d’une arène programmable à température contrôlée qui produit des changements de température rapide et précis dans le temps et l’espace.
Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés sur la réponse des mouches aux changements de température, tels que les différences entre génotypes, l’interaction avec d’autres indices sensoriels, ou la fonction des différents récepteurs de température. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de multiples changements de température rapides et précis contrôlant le temps et l’espace et de manière automatisée. Commencez par placer 20 mouches mâles et 20 mouches femelles dans une bouteille d’élevage contenant 45 millilitres de nourriture volante moyenne, et en plaçant la bouteille à l’intérieur d’un incubateur de 25 degrés Celsius sous la lumière de 12 heures, cycles sombres de 12 heures.
Après 10 jours, anesthésier les mouches nouvellement fermées sur des tampons de dioxyde de carbone pendant un maximum de quatre minutes. Et utilisez un pinceau pour recueillir les mouches vierges dans 2,5 par 9,5 centimètres de mouches d’élevage flacons contenant 6,5 millilitres de milieu de nourriture de mouche fraîche, séparés par sexe en groupes de 20 mouches par flacon. Ensuite, retournez les fioles à l’incubateur pendant cinq à sept jours.
Pour configurer une arène à température contrôlée, allumez l’arène et ouvrez le script des phases de température dans l’ordinateur de contrôle. Vérifiez que la séquence de température est correctement définie et vérifiez que la durée de chaque phase expérimentale est réglée à 60 secondes. Dans la section de bloc expérimentale de démarrage, confirmez ces paramètres : le nombre désiré de phases, la configuration itérative sur/off des diodes électroluminescentes rouges indicatives, l’augmentation de la température de deux degrés Celsius par phase et 16 degrés Celsius comme température de départ.
Ensuite, exécutez le script des phases de température. Le logiciel sera para paraize pendant cinq secondes, puis s’arrêter. Pour les expériences comportementales de température, placez un brin de ruban conductrice blanc sur le dessus des tuiles de cuivre de l’arène, en veillant à ce que tous les bords soient couverts.
Placez un anneau d’aluminium chauffé autour des tuiles de cuivre et utilisez un tissu propre pour essuyer le couvercle en verre. Placez le couvercle sur le dessus de l’anneau d’aluminium, laissant un espace à travers lequel une mouche peut être soufflée et appuyez deux fois sur un flacon de mouche acclimaté pour forcer les mouches au fond du flacon. À l’aide d’un aspirateur bucco-buccl, piéger une mouche et fermer le flacon avant de le remettre dans l’incubateur.
Soufflez la mouche dans l’arène à travers l’espace entre le couvercle en verre et l’anneau d’aluminium et poussez immédiatement le trèfle de verre pour combler l’écart. Placez un cadre de lumières autour de l’arène pour assurer l’éclairage symétrique et commencer à enregistrer avec le programme d’enregistrement vidéo. Appuyez ensuite sur la barre d’espace de l’ordinateur de contrôle pour commencer à exécuter les phases expérimentales.
Pour suivre les vidéos, ouvrez le logiciel de suivi des étapes de vol et ouvrez le fichier de configuration à l’intérieur du dossier fly tracker. Définissez l’emplacement des vidéos dans le dossier vidéo, et les noms des vidéos dans les fichiers vidéo. Spécifiez les bordures de l’arène volante dans les paramètres de l’arène en fonction des coordonnées x/y pixel de plusieurs points au bord de l’arène.
Spécifiquez l’emplacement des LED rouges inactives dans les paramètres LED, en fonction des coordonnées x/y pixel de l’emplacement du centre des LED. Pour vérifier l’emplacement des bordures de l’arène de vol, définissez le débogage pour vrai dans les paramètres de l’arène, cliquez sur enregistrer et exécutez le script dans le terminal. Une capture d’écran de la vidéo apparaîtra avec un carré bleu formé par les coordonnées saisies dans les paramètres de l’arène.
Ensuite, changez de débogage dans les paramètres de l’arène en faux. Cliquez sur enregistrer et exécutez à nouveau l’écran dans le terminal pour commencer le processus de suivi. Dans une expérience comportementale typique de température, les mouches simples exposées à 16, 20 ou 24 degrés Celsius présentent une locomotion plus élevée au début de l’expérience qu’après cinq minutes.
L’arène à température contrôlée peut également être utilisée pour comparer les réactions comportementales des mouches de différents milieux génétiques aux changements dynamiques de température. Par exemple, dans cette expérience, la vitesse de toutes les espèces testées a augmenté en fonction de leurs propres courbes de réponse à mesure que la température augmentait, jusqu’à atteindre un point de performance maximale, après quoi leurs vitesses se sont détériorées et les mouches ont péri. Lorsque les mouches individuelles ont été exposées à 40 degrés Celsius au milieu et à une tuile latérale, avec l’autre tuile latérale à un confortable 22 degrés Celsius, les mouches de type Wild ont rapidement cessé de se déplacer le long de l’aréna et de rester à l’endroit confortable.
En revanche, la mémoire classique mutant Dunce mouches continuer à explorer l’arène et passer moins de temps que les contrôles dans l’emplacement confortable. En outre, les combinaisons d’essai de la température et de l’emplacement sont également utiles pour comprendre la fonction des différents récepteurs de température pendant les changements dynamiques de température. Comme l’illustre cette expérience dans laquelle les mutants individuels d melanogaster ont été exposés à des températures croissantes tandis qu’un emplacement confortable changeant à 22 degrés Celsius a également été fourni.
Lors de l’exécution de ces procédures, n’oubliez pas d’effectuer les étapes dans l’ordre et rapidement afin que vous puissiez capturer autant de comportement des mouches que possible. À côté de cette procédure, d’autres méthodes comme les géotaxis négatifs ou les tests d’étouffement thermique peuvent être utilisés pour répondre à d’autres questions telles que l’endroit où les mouches se déplacent normalement ou ont une résistance normale à la chaleur. Les implications de cette technique s’étendent à nous comprenant des désordres neurologiques ou des mutations dans lesquelles la perception de température ou la douleur jouent un rôle.
En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal parce que chaque étape est simple en soi, mais ils sont tenus d’être parfaitement coordonnés de sorte que la technique doit être pratiquée.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente un protocole permettant d'évaluer la performance locomotrice de Drosophila en réponse à des variations de température à l'aide d'une arène programmable sous contrôle thermique. La méthode permet des changements de température rapides et précis, facilitant l'étude des réponses des mouches aux variations environnementales.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie du comportement
- Sensibilité à la température
Contexte
- Drosophila sert d'organisme modèle pour l'étude des interactions génétiques et environnementales.
- Les changements de température peuvent fortement influencer l'activité locomotrice et le comportement.
- Comprendre ces réponses permet d'obtenir des informations sur le traitement sensoriel et l'adaptation.
- Les méthodes automatisées améliorent la précision des conditions expérimentales.
Objectif de l'étude
- Étudier la performance locomotrice de Drosophila à différentes températures.
- Explorer les différences de réponse entre divers génotypes.
- Analyser les interactions avec d'autres indices sensoriels.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'une arène programmable à température contrôlée.
- Placement des mouches mâles et femelles dans des environnements contrôlés.
- Surveillance de l'activité locomotrice dans des conditions de température variables.
- Collecte automatisée des données pour une analyse précise.
Résultats principaux
- Démontré la capacité de modifier rapidement les températures et d'évaluer le comportement des mouches.
- Identifié des différences significatives dans la performance locomotrice entre les génotypes.
- Mis en évidence des interactions entre les réponses à la température et les indices sensoriels.
Conclusions
- Cette méthode fournit un cadre solide pour l'étude de la sensibilité à la température chez Drosophila.
- Les résultats contribuent à la compréhension des influences génétiques et environnementales sur le comportement.
- Des études futures pourront exploiter cette technique pour des applications plus larges en neurosciences.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une évaluation automatisée à haut débit des performances locomotrices dépendantes de la température chez Drosophila, fournissant des données phénotypiques quantitatives pour la validation de cibles dans les études neurogénétiques. En capturant les réponses comportementales dynamiques à des stimuli thermiques contrôlés spatialement et temporellement, elle contribue à l'analyse mécanistique et à la réduction des risques associés aux voies de détection de la température, pertinentes pour les modèles de douleur et de troubles sensoriels. Le suivi automatisé et le contrôle reproductible de l'environnement renforcent la fiabilité prédictive des flux de travail en phase précoce de découverte impliquant l'étude de la fonction génique et des interactions avec l'environnement.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des contributions génétiques aux phénotypes de réponse thermique, soutenant la validation fonctionnelle des gènes et des voies neuronales impliqués dans la détection de la température.
- Valeur opérationnelle : Facilite la comparaison directe de souches mutantes et de type sauvage dans des conditions environnementales identiques et programmables, afin d'isoler les effets spécifiques au génotype.
- Valeur prédictive : Génère des courbes de performance analogues à des courbes dose-réponse selon des gradients de température, aidant à identifier les seuils fonctionnels et les gradients de sévérité phénotypique pour la priorisation des cibles.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Produit des sorties locomotrices quantifiables (vitesse, préférence d'emplacement) qui servent de lectures phénotypiques robustes et riches en contenu pour le criblage de bibliothèques génétiques ou de modulateurs pharmacologiques de la sensibilité thermique.
- Valeur opérationnelle : Le suivi vidéo automatisé et la standardisation de l'arène réduisent la variabilité entre expériences, permettant des tests évolutifs et reproductibles, adaptés à des campagnes de criblage allant du moyen au haut débit.
- Préparation du test : Génère des métriques comportementales normalisées pouvant être étalonnées entre génotypes et lots expérimentaux, soutenant ainsi la validation des tests et la reproductibilité inter-laboratoires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence translationnelle : Modélise les mécanismes d'adaptation thermique des ectothermes, offrant des aperçus sur les voies conservées de thermosensation neuronale, avec une pertinence potentielle pour les cibles de la douleur et de la thermorégulation chez les mammifères.
- Continuité préclinique : Permet l'évaluation longitudinale des courbes de performance thermique, soutenant les décisions d'avancement ajustées au risque dans les filières de validation ciblée, en établissant des relations génotype-phénotype-environnement.
- Dérisquage mécanistique : Permet l'analyse fonctionnelle des récepteurs thermiques par profilage thermique spatial et temporel, réduisant l'ambiguïté dans l'association entre lésions génétiques et déficits de traitement sensoriel.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la continuité de la découverte précoce, reliant une perturbation génétique à une sortie comportementale quantifiable dans un contexte environnemental contrôlé, soutenant ainsi les efforts de validation ciblée fondés sur des hypothèses et d'identification de composés candidats dans la recherche neurocomportementale.
- Biologie de la découverte : Permet l'interrogation systématique de la fonction des gènes impliqués dans la détection de la température en corrélant le fond génétique aux réponses locomotrices dynamiques à des stimuli thermiques contrôlés.
- Criblage : Fournit des lectures comportementales quantitatives normalisées (par exemple, vitesse, préférence spatiale) permettant un criblage fiable de composés ou de génotypes dans les voies sensibles à la température.
- Analyse : Génère des jeux de données comportementales résolus en fonction du temps et de la température, adaptés à la comparaison statistique des courbes de performance, des seuils thermiques analogues à la CE50 et des métriques basées sur la surface sous la courbe entre différents groupes expérimentaux.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les phénotypes de réponse thermique chez Drosophila et les mécanismes conservés de transduction sensorielle, contribuant ainsi à la validation croisée d'objectifs thérapeutiques dans les recherches sur la thermosensation et la douleur.
- Réutilisation en milieu professionnel : L'arène automatisée et le pipeline de suivi constituent une plateforme réutilisable pour l'étude des interactions gène-environnement dans plusieurs modalités sensorielles allant au-delà de la thermosensation.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une clarté mécanistique sur les circuits neuronaux de détection de la température en permettant un défi thermique spatiotemporel précis et une quantification automatisée du comportement.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité grâce à un contrôle standardisé de l'environnement, à l'acquisition automatisée des données et à une manipulation manuelle réduite, minimisant ainsi la variabilité dépendant de l'opérateur.
- Valeur stratégique : Améliore la confiance dans les décisions d'aller ou de ne pas aller en fournissant des données phénotypiques objectives et quantitatives, réduisant ainsi la dépendance à l'égard de l'évaluation comportementale subjective dans les criblages neurogénétiques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation des cibles stratifiée par risque en associant des lésions génétiques à des déficits mesurables dans la performance thermique, facilitant ainsi l'identification précoce de cibles thérapeutiques à haute confiance.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation de Drosophila, la conception de tests comportementaux et la configuration de logiciels de suivi basés sur la vidéo.
- Dépend d'un équipement d'arène à température contrôlée, d'un éclairage synchronisé et de systèmes d'enregistrement vidéo pour une acquisition précise des données environnementales et comportementales.
- Exige une standardisation inter-équipes de l'étalonnage de l'arène, des paramètres de suivi et des définitions des protocoles thermiques afin d'assurer la reproductibilité entre différents sites ou utilisateurs.
- L'adaptation à d'autres modèles d'insectes ou à d'autres stimuli sensoriels peut nécessiter un réétalonnage des dimensions de l'arène, des seuils de suivi et des taux de rampe thermique, selon la taille spécifique de l'espèce et la cinétique de sa réponse.
- Les limites pratiques incluent les contraintes de débit de l'arène (un insecte par essai) et la nécessité d'une coordination procédurale rigoureuse pour maintenir l'alignement temporel entre les changements thermiques et l'enregistrement du comportement.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Fly and Temperature-Controlled Arena Preparation
2:02
Temperature Behavioral Experiments
3:13
Video Tracking and Data Analysis
4:31
Results: Representative Drosophila Performance Analyses in Response to Temperature Changes in Space and Time
6:08
Conclusion
