Name: Isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de Transport protéine dépendant de l’énergie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Découvrez l'isolement de thylakoïdes physiologiquement actifs et les essais de transport protéique dépendant de l'énergie dans les chloroplastes. Cette méthode permet un contrôle complet des conditions expérimentales pour étudier les mécanismes de transport.

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Ce manuscrit a été préparé avec le financement par la Division des Sciences chimiques, sciences de la terre et Biosciences, bureau 408 énergie des Sciences de base de l’US Department of Energy par Grant DE-SC0017035

1 les premiers matériaux
<ol><li>Faire tremper environ 55 g de petits pois pendant 3 heures dans 400 mL d’eau distillée et ensuite semer dans un bac en plastique (35 cm x 20 cm x 6 cm) dans le sol recouvert d’une fine couche de vermiculite.</li>
	<li>Pousser le plateau de pois à 20 ° C sous cycle lumière/obscurité (50 µE/m2s) 12/12 h pendant 9 à 15 jours.</li>
	<li>Préparer le substrat protéique selon une méthode de choix. Remarque : Nous avons préparé les substrats protéiques en utilisant une variété de méthodes, dont 1) transcription in vitro à partir des plasmides purifiés suivie de la traduction à l’aide d’extraits de germe de blé ou de lysats de réticulocytes de lapin en présence de la [3H]-leucine ou [35S]-méthionine, 2) in vitro traduction, utiliser un kit de transcription/traduction couplé comme la TnT kits de Promega, avec radiomarquage comme ci-dessus et 3) purification de protéine surexprimée dans e. coli. Radioactive in vitro les produits de la traduction sont généralement trempées avec 50 mM acide aminé froide avant de les utiliser dans des réactions de transport. Chacune de ces méthodes nécessite généralement une optimisation pour chaque nouveau substrat protéique. Pour obtenir un exemple d’un système couplé en vitro , voir Ling et Jarvis (2016)9.</li>
</ol>2. quantification et l’isolement des chloroplastes
Remarque : La première étape dans la préparation des thylakoïdes est l’isolement des chloroplastes intacts10. Tout le matériel doit être conservé au froid pendant la préparation. Remise en suspension des chloroplastes doit être manipulé délicatement, comme rupture à cette étape peut limiter sévèrement rendement subséquent thylakoïdes.
<ol><li>Préparer la suite de solutions au préalable.<ol>
<li>2 x tampon de polissage (2xGB) : 100 mM K-HEPES de pH 7,3, sorbitol de 660 mM, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, 0,2 % de BSA.</li>
		<li>2 x Import tampon (2xIB) : 100 mM K-Tricine ou K-HEPES pH 8,0, sorbitol de 660 mM, 8 mM MgCl2. Remarque : Les Concentrations de MgCl2 allant de 3 mM à 10 mM ont été utilisées sans différences observables.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer un gradient de densité continue par centrifugation d’un mélange de 15 mL de Percoll et 15 mL de 2xGB à 30 900 g dans un rotor à angle fixe pendant 30 min à 4 ° C avec le frein au large.</li>
	<li>Récolter environ 25 g de petits pois 9-15 jour vieux et homogénéiser dans 95 mL de 1xGB. Un mixeur avec lames affûtés ou un Polytron ont été utilisées avec succès. Filtrer ce mélange à travers au moins 2 couches de Miracloth dans un entonnoir. Remarque : Limite la quantité de tissus de la tige n’est pas nécessaire mais peut faciliter le processus d’homogénéisation, réduisant ainsi les bris de chloroplaste qui peuvent survenir avec mélange prolongée.</li>
	<li>Pellet à 3 000 g dans un rotor oscillant de seau pendant 5 min à 4 ° C et doucement resuspendre dans 1 mL de 1xGB. Un pinceau peut être la technique plus douce de remise en suspension.</li>
	<li>Soigneusement la couche la suspension verte sur le dessus du gradient de Percoll et centrifuger à 8 000 g dans un rotor oscillant de seau pendant 10 min à 4 ° C avec le frein au large.</li>
	<li>Soigneusement la récolte la plus faible bande verte contenant des chloroplastes intacts dans un nouveau tube. Filer les chloroplastes intacts récupérés à 1 800 g dans un rotor oscillant de seau pendant 5 min à 4 ° C, éliminer le surnageant et doucement Resuspendre le culot dans 1xIB. Répétez cette étape de lavage une fois de plus, resuspendant dans 30 mL de 1xIB chaque fois, avec la finale remise en suspension dans 1 mL de 1xIB.</li>
	<li>Afin de quantifier la teneur en chlorophylle (Chl), mélanger 10 µL de chloroplastes entièrement remises en suspension avec 5 mL d’acétone de 80 % et filtrer sur papier filtre de Whatman 1 (épaisseur nominale 180 µm). Mesurer l’absorbance à 720 nm, 663 nm et 645 nm dans un spectrophotomètre et calculer la concentration de Chl en utilisant la formule suivante11: [Chl] mg/mL = [40.2* (un663 –720) + 101.4* (un645 –720)] * 0,1</li>
	<li>Ajuster des chloroplastes à 1 mg/mL Chl équivalents avec 1xIB.</li>
</ol>3. isolement des thylakoïdes
Remarque : Les thylakoïdes sont préparés par lyse hypotonique des chloroplastes intacts. Ceci est réalisé en exposant les chloroplastes dans un tampon hypotonique sans sorbitol. Les thylakoïdes isolés peuvent être utilisés pour doser une des voies de la translocation, mais extrait stromal (SE) doit également être isolée au cours de cette préparation si soit cpSec1 soit cpSRP voies doivent être analysés.
<ol><li>Préparer avance les solutions suivantes.<ol>
<li>Tampon de lyse hypotonique : 50 mM Tricine-K ou K-HEPES pH 8,0, 8 mM MgCl2.</li>
		<li>2 x brut Stroma tampon (pour la concentration du SE) : 100 mM K-HEPES de pH 8,0, sorbitol de 660 mM, 8 mM MgCl2.</li>
		<li>Tampon de Laemmli échantillon (par SDS-PAGE, complété avec de l’EDTA) : 125 mM Tris pH 6,8, SDS de 10 %, 20 % de glycérol, 0,05 mg/mL de bleu de bromophénol, 10 % de β-mercaptoéthanol, 10 mM EDTA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si la récupération SE n’est pas nécessaire, centrifuger les chloroplastes intacts à 1 000 g dans un rotor oscillant de seau pendant 6 min à 4 ° C.<ol>
<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension à 1 mg/mL dans le tampon de lyse hypotonique. Incuber sur glace dans l’obscurité pendant 10 min, avec mixage occasionnels.</li>
		<li>Récupérer les thylakoïdes par centrifugation à 3 200 g en balançant le seau du rotor pendant 8 min à 4 ° C. Laver les thylakoïdes deux fois, resuspendant avec 1 à 2 mL de tampon de lyse chaque fois. Remettre en suspension avec 1 mL de 1xIB et requantify Chl comme ci-dessus dans le protocole d’isolement de chloroplastes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. concentration et récupération extrait stromales
<ol><li>Si la récupération SE est nécessaire, divisez les chloroplastes intacts en 600 µL d’extraits en tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et centrifuger chaque tube à 1 000 g en balançant le seau du rotor pendant 6 min à 4 ° C. Remarque : Ce volume est pratique lorsque vous utilisez des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL, qui contribue à prévenir les perturbations de la pastille éventuelle pour les membranes résiduelles.<ol>
<li>Remettre en suspension à 1 mg/mL Chl dans le tampon de lyse hypotonique et incuber sur glace dans l’obscurité pendant 10 min, comme au point 3.2.1.</li>
		<li>Centrifuger chaque tube à 3 200 g en balançant le seau du rotor pendant 8 min à 4 ° C et la lumière verte ou jaune surnageant suivant chloroplastique lyse de transfert dans un nouveau tube de microcentrifuge avec un volume égal de 2 x brut Stroma tampon.</li>
		<li>Laver les thylakoïdes et 2 volumes de tampon de lyse (se rapprochant de 0,5 mg/mL) et de recueillir par centrifugation à 3 200 g en balançant le seau du rotor pendant 8 min à 4 ° C. Remettre en suspension à 1 mg/mL Chl en 1xIB sur la glace.</li>
		<li>Centrifuger le stroma brut à 42 000 g dans un rotor à angle fixe pendant 30 min à 4 ° C pour enlever les membranes résiduelles. Immunoblotting pour les protéines de l’enveloppe extérieure et intérieure peut être utilisé pour vérifier la pureté du liquide surnageant.</li>
		<li>Recueillir les 95 % du volume de chaque éprouvette sans déranger la petite pastille jaune-vert. Noter le volume prélevé chaque tube.</li>
		<li>Pour préparer l’extrait concentré stromal (SE), réunir les fractions surnageantes collectées et concentrer cinq fois à l’aide d’un concentrateur MWCO 4 mL 30 kDa. Remarque : SE préparé de cette manière est équivalent à stroma dérivé des chloroplastes à 2,5 mg/mL LCH. Si nécessaire, SE peut être dix fois concentré à 5 mg/mL Chl équivalents. SE sera la couleur dorée et visqueux. En centrifugeuse Legend RT du laboratoire avec godet rotor d’oscillation cela nécessite environ 10 min par mL concentré.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. le transport par la voie de cpTat
Remarque : Contrairement aux cpSec1 ou cpSRP, la voie de cpTat ne nécessite pas de composants solubles ou exogène ajouté des sources d’énergie ; seule la force motrice de proton axée sur la lumière est nécessaire3. Par conséquent, seulement isolé thylakoïdes et substrat protéique sont nécessaires pour le dosage. Substrats typiques sont des formes intermédiaires de la 17 kDa (comme on le voit à la Figure 1) et 23 kDa sous-unités de l’oxygène en évolution complexe, iOE17 et iOE23, respectivement, mais les formes de précurseur, prOE17 et prOE23, peuvent aussi être transportées d’avec succès. Formes de précurseurs ont la bipartite N-terminaux ciblant séquence entière, tandis que des formes intermédiaires ont seulement les thylakoïdes ciblant la séquence.
<ol><li>Préparer cpTat transport mix avec 0,33 mg/mL Chl thylakoïdes, 5 mM ATP d’un stock en 1xIB et en 8 mM le dithiothréitol (DTT) provenant d’un stock établi en 1xIB, sur la glace. ATP n’est pas strictement requise pour cette réaction si effectuée en vertu de l’illumination.</li>
	<li>Transport initié par l’introduction de 01:30 volume par volume mélanger protéine substrat dans le transport. Si la protéine substrat n’est pas disposé à 1xIB, préparer un 1:1 dilution avec 2xIB tout d’abord, puis utilisez 01:30 volume par volume du substrat dilué dans le mélange de transport. Remarque : Les Concentrations de substrat variera selon la méthode de préparation. En général, en vitro préparations permettra nanomolaires micromolaires montants, tandis que la surexpression permettront pour micromolaire aux montants millimolaires. Méthodes de détection doivent aussi être considérées, autoradiographie et fluorographie étant plus sensibles qu’immunoblotting.</li>
	<li>Illuminer la suspension en 80-100 µE/m2s du rayonnement photosynthétiquement actif (PAR) pendant 10 min à température ambiante. Si cinétique du transport est nécessaire, équilibrer les mix les thylakoïdes et réaction à température ambiante et illuminer jusqu'à 30 min.</li>
	<li>Arrêter la réaction de transport avec une dilution 8 fois de 1xIB glacé et récupérer les thylakoïdes par centrifugation à 3 200 g dans Micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Enlever le substrat résiduelle qui n’a pas été transporté, resuspendre le culot de thylakoïdes dans 120 µL de 1xIB et digérer les protéines externes par l’addition de 6 µL de 2 mg/mL thermolysine et 10 mM CaCl2 en 1xIB.</li>
	<li>Incubez la réaction de protéase sur glace pendant 40 min et puis étancher la protéase en doublant le volume avec 25 mM EDTA préparé en 1xIB.</li>
	<li>Récupérer les thylakoïdes par centrifugation à 3 200 g dans une micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C. Laver les thylakoïdes récupérés dans 120 μL de 5 mM EDTA dans 1xIB et le transfert dans un nouveau tube.</li>
	<li>Centrifuger à 3 200 g dans une micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension dans un volume suffisant de tampon de Laemmli additionné de 10 mM EDTA. Un volume de 40 µL est généralement suffisant pour détecter le substrat sur un gel SDS-PAGE et conserve l’échantillon pour répéter gelées lorsque cela est nécessaire.</li>
	<li>Placer les échantillons dans un bain d’eau bouillante pendant 10 min et analyser par SDS-PAGE. Autoradiographie, fluorographie ou éponger occidental de protéines non indigènes ou épitope marqués ont été utilisées avec succès pour la détection des protéines transportées.</li>
</ol>6. transports par la voie cpSec1
Remarque : Transport par le translocon cpSec1 nécessite la protéine stromal cpSecA112,13, qui peuvent être achetés par l’intermédiaire de surexpression dans e. coli14,15 ou récupérés en concentrant le stroma lors de l’isolation des thylakoïdes. Un substrat typique est la sous-unité de 33 kDa de l’oxygène en évolution complexe (prOE33), comme on le voit à la Figure 2.
<ol><li>Préparer le mélange de transport cpSec1 avec 0,33 mg/mL Chl thylakoïdes, 0,83 mg/mL Chl équivalent SE ou 1,5 μg de recombinaison cpSecA1 et ATP sur la glace, de 5 mM et incuber pendant 10 min. Un mélange réactionnel transport typique ici provient de 72 μL, jusqu'à 60 μL en raison de l’ajout de SE.<ol>
<li>Si cpSecA1 recombinante est utilisé au lieu de SE, ajuster cpSecA1 purifié avec un volume égal de 2xIB, puis dilué à une concentration commode d’ajouter les réactions de transport (p. ex., 0,75 µg/µL). Remarque : Pour le stockage à long terme, cpSecA1 se trouve sur la glace dans une chambre réfrigérée, contrôlée après purification comme gel abolit l’activité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transport initier en introduisant 01:10 volume par volume mélanger protéine substrat pour le transport. Si la protéine substrat n’est pas disposé à 1xIB, préparer une dilution de 1:1 avec 2xIB et ajouter 01:10 volume par volume de la protéine diluée à la combinaison de transport.</li>
	<li>Incubez la réaction à la température ambiante pendant 10 min, avec 80 à 100 µE/m2s PAR. Encore une fois, plus longs peuvent être nécessaires à cinétique ou certains substrats.</li>
	<li>Après traitement par la lumière, diluer 8 fois avec glacee réactions 1xIB et centrifuger à 3200 g dans Micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C.</li>
	<li>Traiter avec la thermolysine et étancher avec EDTA comme ci-dessus en étapes 5.5 à 5.7.</li>
	<li>Centrifuger à 3 200 g dans Micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C et Resuspendre le culot dans un volume suffisant de tampon de Laemmli additionné de 10 mM EDTA. Placez au bain-marie bouillant pendant 10 min avant leur chargement sur gel SDS-PAGE.</li>
</ol>7. insertion par le biais de la voie de cpSRP
Remarque : L’intégration induite par le cpSRP de la lumière des protéines complexes (LHCP) vus à la Figure 3 la récolte nécessite cpSRP54, cpSRP43 et cpFtsY16. Ces composants sont fournis à la réaction de transport grâce à l’extrait concentré de stroma, comme pour le protocole de transport de cpSec1.
<ol><li>Préparer le cpSRP transport mix avec 0,33 mg/mL Chl thylakoïdes et 0,83 mg/mL Chl SE équivalent 5 mM ATP sur la glace et incuber pendant 10 min.</li>
	<li>Transport initier en introduisant 01:10 volume par volume mélanger protéine substrat pour le transport. Si la protéine substrat n’est pas disposé à 1xIB, préparer une dilution de 1:1 avec 2xIB et ajouter 01:10 volume par volume de la protéine diluée à la combinaison de transport.</li>
	<li>Incubez la réaction à température ambiante pendant 10 min à 80 – 100 µE/m2s PAR.</li>
	<li>Après traitement par la lumière, diluer 8 fois avec glacee réactions 1xIB et centrifuger à 3 200 g dans Micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 120 µL de 1xIB.</li>
	<li>Traiter avec la thermolysine comme ci-dessus dans les sections 5.5 à 5.7. Digestion de la thermolysine est nécessaire ici d’évaluer l’intégration réussie de membrane. Laver les thylakoïdes récupérés dans 120 μL de 5 mM EDTA dans 1xIB et le transfert dans un nouveau tube.</li>
	<li>Centrifuger à 3 200 g dans Micro-centrifugeuse pendant 5 min à 4 ° C et Resuspendre le culot à nouveau dans un volume approprié de 2 x Laemmli tampon additionné de 10 mM EDTA. Placez au bain-marie bouillant pendant 10 min avant l’analyse par SDS-PAGE. Remarque : Intégration des mature LHCP (mLHCP) est évaluée par l’apparition d’un produit de dégradation de protéase protégé (mLHCP-D) plus petit que le mLHCP clivés17d’environ 1,5 à 2 kDa.</li>
</ol>

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<li>Kirchhoff, H., Borinski, M., Lenhert, S., Chi, L., Büchel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transversal+and+lateral+exciton+energy+transfer+in+grana+thylakoids+of+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Transversal and lateral exciton energy transfer in grana thylakoids of spinach.</a> Biochemistry. 43 (45), 14508-14516 (2004).</li>
<li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li>
<li>Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+FtsY%2C+chloroplast+signal+recognition+particle%2C+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Isolement des chloroplastes et des thylakoïdes
Rupture d’excessive peut entraîner dans les chloroplastes pauvres isolement et donc pauvre thylakoïdes rendement après la séparation du gradient. Il est préférable d’homogénéiser les tissus récoltés délicatement en veillant à ce que tout le matériel est immergé avant de mélanger et pulsé dans 15 s cycles jusqu'à ce que complètement homogénéisée. Si nécessaire, utilisez plusieurs tours plus courtes de mélanger avec moins de tissu à chaque tour.
<p...

La quasi-totalité de la machinerie protéique responsable fonction chloroplastes appropriée doit être transloquée dans le cytosol1. L’enveloppe de chloroplaste, substrats protéiques sont importés par le translocon de la membrane externe (TOC) et le translocon de la membrane interne (TIC)2. Ciblage plus loin pour les thylakoïdes membrane et lumen se fait par les jumeaux arginine translocation (cpTat)3, la sécrétion (cpSec1)4, le signal reconnaissance particule (cpSRP)5et les voies d’insertion spontanée6 . Une méthode pour l’isolation de haut rendement des chloroplastes physiologiquement actives et les membranes thylakoïdes est nécessaire de mesurer le bilan énergétique et cinétique d’un événement de translocation, de comprendre les mécanismes de transport diversifié dans chaque voie et à localiser un substrat protéique particulière d’intérêt à l’un des six compartiments distincts du chloroplaste.
L’isolement des membranes des chloroplastes offre mieux expérimentale maîtrise des facteurs environnementaux (tels que les concentrations de sel et de substrat, la présence d’ATP/GTP et des conditions de pH) qui influent sur la mesure de l’énergétique du transport et cinétique. Cet environnement in vitro se prête à l’exploration des détails mécaniques de translocation pour les mêmes raisons. En outre, logiciel prédictif pour la localisation des protéines de chloroplastes s’est améliorée7,8, essais in vitro de transport prévoient une méthode plus rapide pour la confirmation sur la microscopie fluorescentes analyses que besoin d’une balise fluorescente génétiquement encodée, la transformation des plantes et/ou des anticorps spécifiques. Nous présentons ici les protocoles pour l’isolement des chloroplastes et des thylakoïdes des pois (Pisum sativum), ainsi que pour des essais de transport optimisés pour chacune des voies translocation thylakoïdes dépendant de l’énergie.

<table><tbody><tr><td>Pisum sativum graines</td><td>Seedway LLC, Hall, NY</td><td>8686 - Little Marvel</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td><td>475855-1</td><td></td></tr><tr><td>80 % Acetone</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur à lames aiguisées</td><td>Waring Commercial</td><td>BB155S</td><td></td></tr><tr><td>Polytron 10-35</td><td>Fischer Sci</td><td>13-874-617</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Beckman J2-MC avec rotor JA 20</td><td>Beckman-Coulter</td><td>8043-30-1180</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-5B avec rotor HB-4</td><td>Sorvall</td><td>8327-30-1016</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dithiothreitol (DTT) en 1xIB</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>12/3/83</td><td>Peut être congelé dans des aliquotes pour une utilisation future</td></tr><tr><td>200 mM MgATP en 1xIB</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>74804-12-9</td><td>Peut être congelé dans des aliquotes pour une utilisation future</td></tr><tr><td>Thermolysin en 1xIB (2mg/mL)</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>9073-78-3</td><td>Peut être congelé dans des aliquotes pour une utilisation future</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K-Tricine</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de manganèse</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>13446-34-9</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Bromophénol Blue</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>B-Mercaptoethanol</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>60-24-2</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de transport protéine dépendant de l’énergie

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Les chloroplastes sont les organites en plantes vertes chargées d’effectuer de nombreuses voies métaboliques essentielles, notamment de la photosynthèse. Dans les chloroplastes, le système de membrane de thylakoid abrite tous les pigments photosynthétiques, complexes de centre de réaction et la plupart des transporteurs d’électrons et est responsable de la synthèse d’ATP dépendante de la lumière. Plus de 90 % des protéines de chloroplastes sont codées dans le noyau, traduit dans le cytosol et ensuite importé dans le chloroplaste. Transport des protéines supplémentaire dans ou à travers la membrane des thylakoïdes utilise une des quatre voies de translocation. Nous décrivons ici une méthode de rendement élevé pour l’isolement des thylakoïdes transport-compétente de pois (Pisum sativum), ainsi que des essais de transport à travers les trois dépendant de l’énergie cpTat et cpSec1 cpSRP par l’intermédiaire des voies. Ces méthodes permettent des expériences relatives à la localisation des protéines thylakoïdes, transport énergétique et les mécanismes de la translocation de la protéine à travers les membranes biologiques.

Pour mesurer la quantité de substrat transporté avec succès, il est utile d’inclure une ou plusieurs voies « pourcentage d’entrée ». Pour les données présentées ci-dessous, 10 % de la réaction de transport final sans thylakoïdes a été utilisé. Cette « entrée pourcentage » permet également de visualiser la taille du substrat précurseur. Le pourcentage représente une quantité connue, définie de substrat avec laquelle au substrat de comparer transportée contre et peut évoluer vers le haut ou...

Nous présentons des protocoles ci-après pour l’isolement de haut rendement de thylakoïdes physiologiquement actives et essais de transport de protéine pour la translocation de chloroplastes twin arginine (cpTat), sécrétoire (cpSec1) et particules (cpSRP) voies de reconnaissance des signaux.

Isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de Transport protéine dépendant de l’énergie

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés concernant les mécanismes et l’énergie du transport des protéines à travers les membranes chloroplastiques, ainsi que l’emplacement des protéines dans les plastides. Le principal avantage de cette technique pour le ciblage des protéines thylakoid est qu’elle permet un contrôle complet de l’environnement du thylakoid pendant le transport, y compris la température, le pH, les conditions ioniques et les concentrations de précurseurs. Commencez par tremper environ 55 grammes de pois dans 400 millilitres d’eau distillée pendant trois heures.Sèmez les pois trempés dans un plateau en plastique dans le sol, recouvert d’une fine couche de vermiculite, et cultivez pendant neuf à 15 jours comme décrit dans le protocole de texte. Le jour de l’isolement chloroplaste, préparez un gradient de densité continu en centrifugant un mélange de 15 millilitres de Percoll et de 15 millilitres de tampon de 2 x Go dans un tube de centrifugeuse à grande vitesse en polycarbonate de 15 millilitres à 30 900 g dans un rotor à angle fixe pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avec le frein éteint. Récoltez ensuite environ 25 grammes de pousses de pois de neuf à 15 jours.Ajoutez-les à 95 millilitres de tampon froid de 1 x Go dans un mélangeur réfrigéré, avec des lames aiguisées. Et homogénéiser. Filtrer ce mélange à travers un minimum de deux couches de tissu de fromage, placé dans un entonnoir sur un bécher réfrigéré.Centrifugeuse le filtrate à l’aide d’un tube de centrifugeuse en polycarbonate de 15 millilitres dans un rotor balançant à 3000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant et utilisez un pinceau pour resuspendre doucement la pastille en un millilitre de 1xGb. Après cela, utilisez une pipette de posture en verre pour superposer soigneusement la suspension de l’écran sur le dessus du gradient Percoll.Centrifugez-le dans un rotor balançant à 8000 gs pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius avec le frein éteint. À l’aide d’une pipette de posture, transférer soigneusement la bande verte inférieure contenant des chloroplastes intacts dans un tube de polycarbonate frais de 50 millilitres et ajouter 30 millilitres de tampon 1xIB. Centrifuger le tube dans un rotor balançant à 1800 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après avoir jeté le supernatant, resuspendez doucement la pastille dans un millilitre de 1xIB avec un pinceau. Laver à nouveau 30 millilitres de 1xIB et de centrifugeuse dans les mêmes conditions. Resuspendez la pastille après la centrifugation finale en un millilitre de 1xIB.Pour déterminer la concentration de chlorophylle, mélanger 10 microlitres de chloroplastes entièrement résuspendus avec cinq millilitres d’acétone à 80 %. Filtrer à travers un papier filtre de 180 micromètres d’épaisseur avec une taille de pore de 11 micromètres, puis déterminer la concentration de chlorophylle par spectrophotomètre. Diluer le mélange de chloroplaste à un milligramme par millilitre à l’aide de 1xIB froid.Pour commencer à isoler les thylakoids quand l’extrait stromal n’est pas né cessaire, tel que le transport de cpTat, centrifugeuse les chloroplastes intacts dans des tubes de 1.5 millilitres dans un rotor balançant de seau à 1.000 gs à quatre degrés Celsius pendant six minutes. Après cela, jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans le tampon de lyse hypotonique pour atteindre un milligramme par millilitre avec une micropipette. Incuber sur la glace dans l’obscurité avec mélange occasionnel pendant 10 minutes.Pour récupérer les thylokoïdes, centrifugeuse dans un rotor balançant à 3200 gs à quatre degrés Celsius pendant huit minutes. Lavez les thylokoïdes deux fois en réutilisant la pastille avec un à deux millilitres de tampon de lyse, puis en centrifugant dans les mêmes conditions. Après la centrifugation finale, resuspendez la pastille, dans un millilitre de tampon 1xIB et déterminez la concentration de chlorophylle chez les thylokoïdes isolés à l’aide d’un spectrophotomètre comme démontré précédemment.Pour les voies qui nécessitent une récupération d’extrait stromal comme cpsec1 et CPSRP élit 600 microlitres de chloroplastes isolés dans un rotor de seau oscilleux et centrifugeuse à 1000 gs pendant six minutes à quatre degrés Celsius. Pour la lyse chloroplaste, nous suspendons la pastille avec 600 microlitres de tampon hypotonique de lyse. Incuber sur la glace dans l’obscurité pendant 10 minutes avec mélange occasionnel.Puis centrifuger les tubes dans un rotor balançant seau à 3200 gs pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Pour sauver le stroma, transférez le vert clair sur le supernatant jaune dans un nouveau tube de micro centrifugeuse et ajoutez un volume égal de tampon stromal brut 2x. Pour laver les thylokoïdes, ajouter deux volumes de tampon de lyse et de centrifugeuse à 3 200 gs pendant huit minutes à quatre degrés Celsius.Resuspendez la pastille en 1xIB pour atteindre une concentration de chlorophylle d’un milligramme par millilitre et mettez-la de côté sur la glace pour une utilisation ultérieure dans les analyses de transport. Retirez les membranes résiduelles du stroma brut en centrifugant le stroma brut dilué dans un rotor à angle fixe à 42 000 gs pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Puis recueillir 95% du volume de chaque tube en s’assurant de ne pas déranger la petite pastille verte jaune, tout en notant le volume pris à partir de chaque tube.Pour préparer l’extrait stromal concentré, mettre en commun les supernatants collectés. Ensuite, utilisez un concentrateur de coupure de poids moléculaire de 30 millilitres de 30 millilitres pour concentrer l’extrait quintuple. Pour apaiser le transport du cpTat dans un tube de 1,5 millilitre sur glace, mélanger les thylokoïdes isolés à une concentration finale de chlorophylle de 0,33 milligramme par millilitre, cinq millimolaires ATP préparés en 1xIB, et huit millimolar DTT préparés en 1xIB.Pour initier le transport, introduire des protéines de substrat dans le mélange de transport. Effectuer la réaction en éclairant la suspension avec 80 à 100 microintéraux par mètre carré par seconde de rayonnement photoynthetically actif pendant 10 minutes à température ambiante. Pour arrêter la réaction de transport, diluer la suspension huit fois avec de la glace froide 1xIB.Centrifugeuse à 3200 gs dans une micro centrifugeuse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour récupérer les thylokoïdes. Après avoir jeté le supernatant, resuspendez la pastille dans 120 microlitres de glace froide 1xIB. Pour faire des analyses, les voies CPSec1 ou PSRP mélangent ce qui suit dans un tube de 1,5 millilitre sur la glace.Thylakoids à une concentration finale de chlorophylle de 0.33 milligrammes par millilitre, 0.83 milligrammes par millilitre équivalents de chlorophylle de l’extrait stromal, et cinq millimolar ATP préparé dans 1xIB. Amener la réaction jusqu’au volume désiré avec du 1xIB glacé et incuber sur la glace pendant 10 minutes. Pour initier le transport introduire 10% de volume par volume de protéines de substrat à ce mélange de transport.Illuminez avec 80 à 100 microeinsteins par mètre carré par seconde de rayonnement photoynthetically actif pendant 10 minutes à température ambiante. Pour arrêter la réaction, diluer la suspension huit fois avec du 1xIB glacé. Centrifugeuse à 3200 g dans une micro centrifugeuse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Après avoir jeté le supernatant, resuspendez la pastille dans 120 microlitres de glace froide 1xIB. Pour éliminer le substrat résiduel qui n’a pas été transporté, digérer les protéines externes en ajoutant six microlitres de deux milligrammes par thermolysine millilitre et 10 millimilliles de chlorure de calcium en 1xIB. Incuber cette réaction de protéase sur la glace pendant 40 minutes.Étanchez la protéase en doublant le volume avec 25 millimolar EDTA en 1xIB. Centrifugeuse à 3200 gs dans une micro centrifugeuse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour récupérer les thylokoïdes. Après avoir enlevé le supernatant, resuspend récupéré thylokoids dans 120 microlitres de cinq milimolar EDTA en 1xIB, et le transfert à un nouveau tube de 1,5 millilitre.Après avoir centrifugé à nouveau à 3 200 g dans une micro centrifugeuse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, jetez le supernatant et réutilisez la pastille dans un volume approprié de tampon d’échantillon de laemmli, complété par 10 millimolaires EDTA. Placer les échantillons dans un bain d’eau bouillante pendant 10 minutes. Procéder à l’analyse des échantillons par page SDS.Le transport de la protéine iOE17 par la voie cpTat a entraîné un déplacement de taille de deux à trois kilodaltons entre le substrat introduit et la forme traitée mature. Ceci est dû au clivage du peptide de signal terminal n indiquant un transport réussi de cpTat. Le traitement à la thermolysine ne laisse que la bande mature transportée avec succès et donc résistante au protéus.Le transport du précurseur OE33 par la voie CPSec1 a entraîné un changement de taille dans le substrat mature et une protection protéithée du substrat transporté. L’insertion du précurseur de LHCP dans la membrane thylokoid par la voie de cpSRP, évaluée par la digestion de thermolysine a mené à un décalage de taille de 1.5 à deux kilodaltons. Ceci a indiqué l’insertion réussie de membrane, car la membrane protège l’oncleaved du produit mature de dégradation de LHCP de la protéolyse complète.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les thylokoïdes et la tranportivité d’essai à travers les voies dépendantes de l’énergie cpTat, cpSec 1 et cpSRP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être effectuée en trois à quatre heures lorsqu’elle est effectuée correctement. Bien qu’ils ne soient pas illustrés dans cette vidéo, nous gardons généralement les lumières aériennes éteintes en laboratoire lorsque nous isolons et travaillons avec des chloroplastes et des thylakoïdes photosynthetically actifs.Tout en essayant cette procédure, il est important de garder le chloroplaste et les thylakoids isolés à quatre degrés Celsius. N’oubliez pas de resuspendre les chloroplastes doucement au début. Évitez de perturber le gradient Procoll après la première étape de centrifucation.En outre, l’échantillon d’entrée en pourcentage peut être préparé en parallèle avec les réactions de transport et fonctionner sur le même gel pour estimer le transport du substrat. N’oubliez pas que travailler avec des substrats radioactifs nécessite une manipulation consciencieuse et un PPE approprié. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine du ciblage protéique pour explorer l’énergie, la cinétique et les mécanismes uniques régissant le transport des protéines à travers les membranes thylakoid.

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Isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de Transport protéine dépendant de l’énergie (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de Transport protéine dépendant de l’énergie

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