Isolement des thylakoïdes physiologiquement actives et leur utilisation dans des essais de Transport protéine dépendant de l’énergie

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés concernant les mécanismes et l’énergie du transport des protéines à travers les membranes chloroplastiques, ainsi que l’emplacement des protéines dans les plastides. Le principal avantage de cette technique pour le ciblage des protéines thylakoid est qu’elle permet un contrôle complet de l’environnement du thylakoid pendant le transport, y compris la température, le pH, les conditions ioniques et les concentrations de précurseurs. Commencez par tremper environ 55 grammes de pois dans 400 millilitres d’eau distillée pendant trois heures.

Sèmez les pois trempés dans un plateau en plastique dans le sol, recouvert d’une fine couche de vermiculite, et cultivez pendant neuf à 15 jours comme décrit dans le protocole de texte. Le jour de l’isolement chloroplaste, préparez un gradient de densité continu en centrifugant un mélange de 15 millilitres de Percoll et de 15 millilitres de tampon de 2 x Go dans un tube de centrifugeuse à grande vitesse en polycarbonate de 15 millilitres à 30 900 g dans un rotor à angle fixe pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius avec le frein éteint. Récoltez ensuite environ 25 grammes de pousses de pois de neuf à 15 jours.

Ajoutez-les à 95 millilitres de tampon froid de 1 x Go dans un mélangeur réfrigéré, avec des lames aiguisées. Et homogénéiser. Filtrer ce mélange à travers un minimum de deux couches de tissu de fromage, placé dans un entonnoir sur un bécher réfrigéré.

Centrifugeuse le filtrate à l’aide d’un tube de centrifugeuse en polycarbonate de 15 millilitres dans un rotor balançant à 3000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le supernatant et utilisez un pinceau pour resuspendre doucement la pastille en un millilitre de 1xGb. Après cela, utilisez une pipette de posture en verre pour superposer soigneusement la suspension de l’écran sur le dessus du gradient Percoll.

Centrifugez-le dans un rotor balançant à 8000 gs pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius avec le frein éteint. À l’aide d’une pipette de posture, transférer soigneusement la bande verte inférieure contenant des chloroplastes intacts dans un tube de polycarbonate frais de 50 millilitres et ajouter 30 millilitres de tampon 1xIB. Centrifuger le tube dans un rotor balançant à 1800 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir jeté le supernatant, resuspendez doucement la pastille dans un millilitre de 1xIB avec un pinceau. Laver à nouveau 30 millilitres de 1xIB et de centrifugeuse dans les mêmes conditions. Resuspendez la pastille après la centrifugation finale en un millilitre de 1xIB.

Pour déterminer la concentration de chlorophylle, mélanger 10 microlitres de chloroplastes entièrement résuspendus avec cinq millilitres d’acétone à 80 %. Filtrer à travers un papier filtre de 180 micromètres d’épaisseur avec une taille de pore de 11 micromètres, puis déterminer la concentration de chlorophylle par spectrophotomètre. Diluer le mélange de chloroplaste à un milligramme par millilitre à l’aide de 1xIB froid.

Pour commencer à isoler les thylakoids quand l’extrait stromal n’est pas né cessaire, tel que le transport de cpTat, centrifugeuse les chloroplastes intacts dans des tubes de 1.5 millilitres dans un rotor balançant de seau à 1.000 gs à quatre degrés Celsius pendant six minutes. Après cela, jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans le tampon de lyse hypotonique pour atteindre un milligramme par millilitre avec une micropipette. Incuber sur la glace dans l’obscurité avec mélange occasionnel pendant 10 minutes.

Pour récupérer les thylokoïdes, centrifugeuse dans un rotor balançant à 3200 gs à quatre degrés Celsius pendant huit minutes. Lavez les thylokoïdes deux fois en réutilisant la pastille avec un à deux millilitres de tampon de lyse, puis en centrifugant dans les mêmes conditions. Après la centrifugation finale, resuspendez la pastille, dans un millilitre de tampon 1xIB et déterminez la concentration de chlorophylle chez les thylokoïdes isolés à l’aide d’un spectrophotomètre comme démontré précédemment.

Pour les voies qui nécessitent une récupération d’extrait stromal comme cpsec1 et CPSRP élit 600 microlitres de chloroplastes isolés dans un rotor de seau oscilleux et centrifugeuse à 1000 gs pendant six minutes à quatre degrés Celsius. Pour la lyse chloroplaste, nous suspendons la pastille avec 600 microlitres de tampon hypotonique de lyse. Incuber sur la glace dans l’obscurité pendant 10 minutes avec mélange occasionnel.

Puis centrifuger les tubes dans un rotor balançant seau à 3200 gs pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Pour sauver le stroma, transférez le vert clair sur le supernatant jaune dans un nouveau tube de micro centrifugeuse et ajoutez un volume égal de tampon stromal brut 2x. Pour laver les thylokoïdes, ajouter deux volumes de tampon de lyse et de centrifugeuse à 3 200 gs pendant huit minutes à quatre degrés Celsius.

Resuspendez la pastille en 1xIB pour atteindre une concentration de chlorophylle d’un milligramme par millilitre et mettez-la de côté sur la glace pour une utilisation ultérieure dans les analyses de transport. Retirez les membranes résiduelles du stroma brut en centrifugant le stroma brut dilué dans un rotor à angle fixe à 42 000 gs pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Puis recueillir 95% du volume de chaque tube en s’assurant de ne pas déranger la petite pastille verte jaune, tout en notant le volume pris à partir de chaque tube.

Pour préparer l’extrait stromal concentré, mettre en commun les supernatants collectés. Ensuite, utilisez un concentrateur de coupure de poids moléculaire de 30 millilitres de 30 millilitres pour concentrer l’extrait quintuple. Pour apaiser le transport du cpTat dans un tube de 1,5 millilitre sur glace, mélanger les thylokoïdes isolés à une concentration finale de chlorophylle de 0,33 milligramme par millilitre, cinq millimolaires ATP préparés en 1xIB, et huit millimolar DTT préparés en 1xIB.

Pour initier le transport, introduire des protéines de substrat dans le mélange de transport. Effectuer la réaction en éclairant la suspension avec 80 à 100 microintéraux par mètre carré par seconde de rayonnement photoynthetically actif pendant 10 minutes à température ambiante. Pour arrêter la réaction de transport, diluer la suspension huit fois avec de la glace froide 1xIB.

Centrifugeuse à 3200 gs dans une micro centrifugeuse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour récupérer les thylokoïdes. Après avoir jeté le supernatant, resuspendez la pastille dans 120 microlitres de glace froide 1xIB. Pour faire des analyses, les voies CPSec1 ou PSRP mélangent ce qui suit dans un tube de 1,5 millilitre sur la glace.

Thylakoids à une concentration finale de chlorophylle de 0.33 milligrammes par millilitre, 0.83 milligrammes par millilitre équivalents de chlorophylle de l’extrait stromal, et cinq millimolar ATP préparé dans 1xIB. Amener la réaction jusqu’au volume désiré avec du 1xIB glacé et incuber sur la glace pendant 10 minutes. Pour initier le transport introduire 10% de volume par volume de protéines de substrat à ce mélange de transport.

Illuminez avec 80 à 100 microeinsteins par mètre carré par seconde de rayonnement photoynthetically actif pendant 10 minutes à température ambiante. Pour arrêter la réaction, diluer la suspension huit fois avec du 1xIB glacé. Centrifugeuse à 3200 g dans une micro centrifugeuse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Après avoir jeté le supernatant, resuspendez la pastille dans 120 microlitres de glace froide 1xIB. Pour éliminer le substrat résiduel qui n’a pas été transporté, digérer les protéines externes en ajoutant six microlitres de deux milligrammes par thermolysine millilitre et 10 millimilliles de chlorure de calcium en 1xIB. Incuber cette réaction de protéase sur la glace pendant 40 minutes.

Étanchez la protéase en doublant le volume avec 25 millimolar EDTA en 1xIB. Centrifugeuse à 3200 gs dans une micro centrifugeuse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour récupérer les thylokoïdes. Après avoir enlevé le supernatant, resuspend récupéré thylokoids dans 120 microlitres de cinq milimolar EDTA en 1xIB, et le transfert à un nouveau tube de 1,5 millilitre.

Après avoir centrifugé à nouveau à 3 200 g dans une micro centrifugeuse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, jetez le supernatant et réutilisez la pastille dans un volume approprié de tampon d’échantillon de laemmli, complété par 10 millimolaires EDTA. Placer les échantillons dans un bain d’eau bouillante pendant 10 minutes. Procéder à l’analyse des échantillons par page SDS.

Le transport de la protéine iOE17 par la voie cpTat a entraîné un déplacement de taille de deux à trois kilodaltons entre le substrat introduit et la forme traitée mature. Ceci est dû au clivage du peptide de signal terminal n indiquant un transport réussi de cpTat. Le traitement à la thermolysine ne laisse que la bande mature transportée avec succès et donc résistante au protéus.

Le transport du précurseur OE33 par la voie CPSec1 a entraîné un changement de taille dans le substrat mature et une protection protéithée du substrat transporté. L’insertion du précurseur de LHCP dans la membrane thylokoid par la voie de cpSRP, évaluée par la digestion de thermolysine a mené à un décalage de taille de 1.5 à deux kilodaltons. Ceci a indiqué l’insertion réussie de membrane, car la membrane protège l’oncleaved du produit mature de dégradation de LHCP de la protéolyse complète.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les thylokoïdes et la tranportivité d’essai à travers les voies dépendantes de l’énergie cpTat, cpSec 1 et cpSRP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être effectuée en trois à quatre heures lorsqu’elle est effectuée correctement. Bien qu’ils ne soient pas illustrés dans cette vidéo, nous gardons généralement les lumières aériennes éteintes en laboratoire lorsque nous isolons et travaillons avec des chloroplastes et des thylakoïdes photosynthetically actifs.

Tout en essayant cette procédure, il est important de garder le chloroplaste et les thylakoids isolés à quatre degrés Celsius. N’oubliez pas de resuspendre les chloroplastes doucement au début. Évitez de perturber le gradient Procoll après la première étape de centrifucation.

En outre, l’échantillon d’entrée en pourcentage peut être préparé en parallèle avec les réactions de transport et fonctionner sur le même gel pour estimer le transport du substrat. N’oubliez pas que travailler avec des substrats radioactifs nécessite une manipulation consciencieuse et un PPE approprié. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine du ciblage protéique pour explorer l’énergie, la cinétique et les mécanismes uniques régissant le transport des protéines à travers les membranes thylakoid.