Name: Inhibition de protéine inductible et réversible Dominant négatif (DN) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Découvrez une méthode d'inactivation protéique conditionnelle et réversible utilisant des mutants dominant négatif induisibles. Cette technique permet d'étudier les fonctions protéiques en préservant une activité endogène résiduelle.

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Le Bureau2 + CB-Myc6 vector est un cadeau de Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, é.-u.). Les cellules de HEI-OC1 ont été gracieusement fournis par Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, é.-u.). Support technique a été fourni par l’UNMC souris Genome Engineering Core (C.B. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) et la Creighton University intégré Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). Le génie du génome de souris UNMC a été soutenue par une bourse de développement institutionnel (IDea) de la NIH/NIGM, accorder le numéro P20 GM103471. La fonction intégrée Biomedical Imaging était soutenue par la Creighton University School of Medicine et subventions GM103427 et GM110768 de la NIH/NIGM. L’installation a été construite avec l’aide de subventions du National Center for Research Resources (RR016469) et la NIGM (GM103427). Les lignées de souris générées dans cette étude ont été maintenues à un centre de ressources de l’Université de Creighton Animal, dont l’infrastructure a été améliorée grâce à une subvention de NIH/RRRNC G20RR024001. Ce travail a reçu au-delà de prise en charge via un NIH/RRRNC 5P20RR018788-/ NIH/NIGM 8P20GM103471 COBRE accorder (à Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01 a 1 (s.-S.) et une subvention de recherche émergents de la fondation de santé auditive (à S. Normand). Le contenu de cette recherche est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

Génération de la souris transgénique de CBRb et tous les soins aux animaux et expériences liées à l’étude ont été approuvés par l’Université Creighton institutionnels, protection des animaux et utilisation Comité (IACUC) et effectué par des lignes directrices.
1. transgéniques CB-Myc6-Rb1 Construct
Remarque : Le clonage de CBRb dans un vecteur de pTet_Splice a été fait dans un processus en plusieurs étapes (Figure 1 a et 1 b).
<ol><li>
Effectuer le premier clonage d’étape dans le Bureau2 + vecteur CB-Myc6.
	<ol>
<li>Pour créer la construction du transgène CBRb, amplifier un fragment de cDNA de Rb1 1583-bp-long (528 acides aminés correspondant à la zone de l’acide aminé 369 – 896) de la protéine RB1 utilisant l’amorce suivante jeu : pour EcoRI +RB 1243F, utilisez GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTCet XbaI + EcoRV +RB 2826R, utilisez CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.</li>
		<li>Clone le fragment généré (bp 1546) entre les sites de restriction EcoR1 et XbaI du Bureau2 + vecteur CB-Myc6 comme décrit précédemment1,12. Remarque : La construction de la CB-Myc6 1012-bp-long (337 aminoacides) fusionnée au fragment Rb1 a donné lieu à une protéine d’environ 865 acides aminés (environ 108 kDa), qui est légèrement plus petite que la protéine RB1 endogène (~ 110 kDa) (Figure 1 Un), avec une étiquette de6 CB-Myc à l’extrémité N-terminale et Rb1 à l’extrémité C-terminale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Effectuer la deuxième étape subcloning dans le vecteur pTet-épissure.
	<ol>
<li>Pour amplifier le fragment de fusion CB-RB-Myc6 et d’acquérir le Tet-promoteur, amplifient la cassette, consistant en la CB-myc6-Rb1 en utilisant des amorces contenant les EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) et les sites de SalI : pour SalI +CBF, Utilisez CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.</li>
		<li>Subclone le fragment généré (2567 bp) dans le vecteur pTet épissure, entre les sites de restriction SalI et EcoRV , de telle manière que le transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 entière, y compris l’intron SV40 et la PolyA signal, peuvent être isolés par une simple digestion avec NotI (Figure 1B). Remarque : Le fragment de NotI a été utilisé pour générer les bailleurs de fonds transgéniques.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. in Vitro test du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1
<ol><li>
Dox-règlement : Lignée de cellules NIH3T3 Remarque : Sauf indication contraire, tous les volumes ont été ajustées pour une plaque 6 puits.<ol>
<li>La croissance de cellules NIH3T3 conformément aux spécifications du vendeur, en utilisant les milieux de culture de cellule recommandée contenant du sérum de veau fœtal de 10 % à 37 ° C, avec 10 % de CO2.</li>
		<li>Cotransfect les cellules avec épissure pTet et vecteurs cmvp-Tet3G (de l’étape 1) pendant 24 h. suivent les étapes mentionnées ci-dessous pour analyse.<ol>
<li>Mélanger 2 – 4 µL de réactif/puits transfection à base de lipides et 1 mL de Dulbecco incomplète (sans sérum) modifié Eagle (DMEM) pendant 5 min à température ambiante. Pour une plaque de 12 ou 24 puits, utiliser 250 ou 500 µL de milieux de culture, respectivement et régler le volume de réactif de transfection en conséquence.</li>
			<li>Ajouter 2 à 3 µg de plasmide ADN/puits dans le réactif de transfection-DMEM et incuber pendant 20 min à température ambiante.</li>
			<li>Ajoutez le mélange contenant l’ADN et le réactif de transfection dans DMEM dans chaque puits. Après 3 – 4 h d’incubation, ajouter 1 mL de médias complet (de sorte que le volume final est de 2 mL/puits). Gardez les aliquotes de Dox stock (1 mg/mL) et ajouter 2 µL dans chacun des puits (+ Dox). Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2. Remarque : Échantillons de contrôle doivent être composé de cellules cotransfectés non traités par Dox (-Dox), ainsi que les cellules NIH3T3 transfectées seulement avec le vecteur de cmvp-Tet3G transactivateur et traitement par Dox pendant une période de 24h. Pour cmvp-Tet3G, les concentrations de 0,1 et 1 µg/mL Dox devrait être suffisante pour induire l’expression du transgène.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tester la réversibilité de la construction à l’aide de la lignée de cellules HEK293.
	<ol>
<li>Pour tester la réversibilité du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , cellules HEK293 en culture dans la moyen essentiel d’aigle-Minimum (EMEM) conformément aux spécifications du vendeur et cotransfect avec les vecteurs d’épissure pTet tant cmvp-Tet3G pendant 24 h, tel que décrit (étape 2.1.2) ci-dessus.</li>
		<li>Pour l’inactivation du transgène, retirez le support contenant Dox après 24h, laver le cellules 2 de x x-3 avec du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS) et les incuber dans des milieux sans Dox pendant 24 h supplémentaires. Remarque : Lors du retrait-Dox, le transgène inactivation et l’expression de la protéine régulière devraient être repris dans ce délai de 24h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Afin d’évaluer les fonctionnalités de la construction de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 dans la promotion de la prolifération cellulaire non programmée, effectuer des analyses fonctionnelles, à l’aide d’une lignée de cellules de HEI-OC1, tel que décrit ci-dessous.
	<ol>
<li>Dans 10 % des cellules de culture HEI-OC1 DMEM sous permissive des conditions (33 ° C avec 10 % de CO2). Pour les études de prolifération cellulaire, compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et les cellules de HEI-OC1 plaque 10 000 sur une plaque à 96 puits en un volume de 200 µL. Incuber les cellules pendant la nuit.</li>
		<li>Le lendemain, effectuer une analyse transitoire des vecteurs pTet épissure et cmvp-Tet3G à l’aide d’un réactif à base de lipides transfection (voir étapes 2.1.2). Dans un endroit bien distinct, effectuer des pmR-ZsGreen1 transfection at2-µg en utilisant le réactif de transfection à base de lipides (étapes 2.1.2) pour calculer le taux de transfection. Utiliser les cellules non transfectées comme témoins.</li>
		<li>Détecter la présence d’une fluorescence verte sous un microscope à fluorescence (excitation = 485 nm ; émission = 530 nm) pour le transfectées cellules 24h après la transfection. Enregistrer la présence ou l’absence de fluorescence verte et calculer le taux de la transfection, le nombre total de cellules (cellules transfectées) de la GFP-positives sur les cellules marquées au DAPI (cellules totales). Remarque : Nous avons estimé un taux de transfection d’environ 70 %.</li>
		<li>Pour induire l’expression du transgène, ajouter 1 µg/mL Dox à un sous-ensemble de cellules transfectées tout en utilisant l’autre sous-ensemble comme contrôle (-Dox). Utiliser des cellules de HEI-OC1 non traitées comme des contrôles supplémentaires.</li>
		<li>Pour évaluer la prolifération des cellules, utilisez un kit de prolifération cellulaire selon le protocole du fabricant.<ol>
<li>En bref, 48 h après la transfection, enlevez le milieu de culture cellulaire et ajouter 100 µL de solution de colorant-liaison 1 x dans chaque puits de la microplaque. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.</li>
			<li>Par la suite, mesurer l’intensité de la fluorescence de l’échantillon à l’aide d’un lecteur de microplaques de fluorescence (excitation = 485 nm ; émission = 530 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pour évaluer plus précisément la prolifération des cellules à l’aide d’immunocytochimie, les cellules de HEI-OC1 sur une lamelle couvre-objet dans une plaque de 12 puits de la plaque et incuber une nuit à 37 ° C.<ol>
<li>Le lendemain, cotransfect avec le pTet épissure et cmvp-Tet3G et exécuter le traitement Dox (+ Dox). Utiliser les cellules celllulaire comme témoins. Cellules de HEI-OC1 process pour l’étiquetage de Ki-67.</li>
			<li>Fixer les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS, pH 7,4, pendant 10 min à température ambiante. Laver les cellules 3 x avec PBS glacée et incuber les cellules dans un détergent non ionique 0,25 % dans du PBS pendant 10 min.</li>
			<li>Laver les cellules encore une fois, 3 fois en PBS pendant 5 min et bloc à l’aide de 10 % de sérum dans une chambre humidifiée pendant 1 h à température ambiante.</li>
			<li>Incuber les cellules de 500 µL d’anticorps primaire de Ki-67 (dilution 1 : 200) pendant 3 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C.</li>
			<li>Laver les cellules 3 x pendant 5 min avec du PBS. Après cela, incuber les cellules avec l’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.</li>
			<li>Enlever la solution de l’anticorps secondaire et laver les cellules 3 x avec PBS de 5 min chacun, dans l’obscurité.</li>
			<li>Pour l’étiquetage de la phalloïdine, incuber les cellules HEI-OC1 au 1 : 200 phalloïdine pendant 30 min. Pour étiqueter les noyaux des cellules, incuber les cellules avec 5 µg/mL DAPI pendant 10 min à température ambiante. Remarque : Assurez-vous que le conjugué de colorant phalloïdine est différent que le conjugué d’anticorps secondaire.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. génération de CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) des souris transgéniques et In Vivo, essais de l’approche de DN-CBRb
<ol><li>Lors de la confirmation d’une réglementation effective du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Dox, purifier le fragment NotI et leur microinject en zygotes de souris, qui sont ensuite transférés dans les femelles pseudo-gestantes. Remarque : Ces procédures ont été menées à l’University of Nebraska Medical Center (UNMC) souris centre génomique de l’ingénierie Core.</li>
	<li>Après l’accouchement, les chiots utilisant une amorce la valeur spécifiques à la région de fusion CB-Rb1 le génotype : pour CBRb F, utilisez 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3′ et CBRB R, 5′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC 3′. Remarque : La taille du produit PCR sur gel d’agarose est 401 bp (région de CB 60-bp + région de Rb1 341-pb (tableau 1). Une dizaine de lignes fondateur indépendant ont été identifiés, basée sur la présence du transgène TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . Dans cinq de ces lignes, la progéniture a hérité du transgène, qui a confirmé la transmission de la lignée germinale du transgène. Une des lignées transgéniques a été finalement utilisée pour l’établir et de maintenir la ligne et de générer des animaux de laboratoire TetO-DN-CB-myc6-Rb1 pour poursuivre ses études.</li>
	<li>Se reproduisent des souris adultes de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 jusqu'à la ligne d’inducteur tétracycline ROSA-CAG-rtTA (Stock #006965) (alternativement, race à une ligne d’inducteur de tTA) pour générer des souris de DN-CBRb expérimentales. Génotype de la progéniture de cette croix à l’aide de l’ensemble suivant d’apprêt : usage rtTA-WT R, GGAGCGGGAGAAATGGATATG ; pour rtTA Mutant R, utiliser GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC ; et pour rtTA commun, utilisez AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Les tailles de produit PCR sont 340 bp (mutant), 340 bp et 650 bp (hétérozygote) et 650 bp (type sauvage).</li>
	<li>Générer une courbe dose-réponse de la protéine RB1 après le traitement de Dox pour déterminer l’heure et la durée du traitement Dox nécessaire pour obtenir une expression du transgène. Remarque : Dans cette expérience, la tache occidentale et qRT-PCR ont été utilisés pour évaluer l’activation spécifique aux tissus transgene et RB1 expression.</li>
	<li>Effectuer l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) pour confirmer l’insertion génomique du transgène. Remarque : Cela a été réalisée au Centre de génomique appliquée de l’Hospital for Sick Children (Toronto, Canada). ELISA ou western blot (à l’aide de protéines spécifiques anticorps) peut être utilisé pour évaluer l’activation du transgène, spécificité tissulaire et des changements dans les niveaux de l’IPE endogène. Pour la construction de DN-CB-myc6-Rb1 , nous avons utilisé un anticorps anti-RB1.</li>
</ol>

<ol><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Afin de contourner les limitations associées à des stratégies traditionnelles de transgéniques, nous avons cherché à créer un modèle de souris dans lequel un POI endogène peut être inactivé conditionnellement en surexprimant une forme mutante de DN de celui-ci d’une manière spatio-temporelle. Pour l’abolition de la fonction de POI endogène, plusieurs options ont été proposées15,16,17. Nous avons modifié une précédente stratégie ...

La plupart des approches visant à l’ablation des gènes et des protéines s’appuient sur des processus permanents, qui se traduisent généralement par l’élimination complète ou la troncation de la gène, de séquences d’ARN ou protéine d’intérêt (POI). L’objectif général de cette méthode est à l’ingénieur une protéine recombinante pour l’abolition de la fonction des protéines endogènes, sauvage. Nous avons revu et remanié une stratégie alternative1,2, qui permet l’ablation temporaire d’un POI par inhibition de la DN. Cette méthode fonctionne pour les multimères et peptides monomères mais est plus adaptée pour les protéines qui fonctionnent dans une assemblée de multimères.
La méthode consiste à fusionner la protéase lysosomale CB à une sous-unité d’un multimériques POI (complexe de fusion de CB). La résultante complexe de fusion CB peut interagir avec et clivage protéolytique digérer la protéine endogène ou détourner l’ensemble CB-POI pour le lysosome être dégradées3. En outre, une combinaison de la fusion de CB complexe avec le caractère inductible du système contrôlé par tétracycline l’activation transcriptionnelle (Fifi) permet une expression inductible et contrôlée du transgène dans un mode réversible2. Bien qu’utiles dans de nombreuses circonstances, la suppression complète des gènes ou des protéines in vivo peut entraîner la létalité4,5,6. De même, tissu-spécifique, conditionnelle délétion de certains gènes ou les protéines utilisant le système Cre-Lox ne peut pas être simple, comme elle, en fin de compte, entraînera la perte permanente des éléments critiques de génomique7. Par conséquent, selon le gène ou POI, aucune de ces approches seront efficaces en fournissant un modèle utile pour des études ultérieures, en particulier des gènes ou des protéines des études fonctionnelles chez les souris adultes et postnatals fin.
Pour contourner les problèmes liés à ces approches et fournir preuve de principe sur l’efficacité de la méthode proposée, nous avons choisi de tester la méthode présentée ici en générant une version DN conditionnelle de la protéine du rétinoblastome 1 (RB1). Plusieurs options ont été proposées8,9,10 à abolir la fonction de RB1 endogène ; Cependant, chacun d’eux fait face à certaines limitations mêmes discutées plus haut : suppression de cellules germinales permanente de RB1 est mortelle embryonnaire et, conforme à son rôle de suppresseur de tumeur, permanente RB1 suppression conditionnelle mène à une variété de tumeurs11. Même si une version DN de RB1 ne semble pas se produire naturellement, une meilleure alternative pour les stratégies actuellement disponibles devrait permettre une inactivation temporellement contrôlée de la RB1 endogène et prévoient un autre mécanisme pour finalement restaurer sa fonction. La base d’une telle construction a été décrite il y a plus de vingt ans1. Toutefois, en raison des limitations technologiques, il lui manquait un mécanisme d’activation de transgène de contrôle, d’intervention et spécificité tissulaire. Cette étude est le premier à combiner l’élégance de la doxycycline (Dox)-système transcriptionnelle dépendant par une ingénierie construction transgénique de protéines de CB et Rb1 protéases lysosomales. Le modèle de souris CBRb qui en résulte permet une RB1 temporairement réglementée de Dox-mediated règle2. L’avantage d’utiliser une approche axée sur le protéome pour étudier la fonction du gène est qu’il peut être adopté pour n’importe quel gène d’intérêt, avec un minimum d’informations sur son activité.
La stratégie proposée du transgène DN offre de nombreux avantages par rapport aux approches traditionnelles. Tout d’abord, l’inhibition de protéine DN mène à seulement une ablation partielle en activité de la protéine, préservant ainsi une expression endogène résiduelle. Un tel résultat est hautement souhaitable dans des situations où une élimination complète de l’activité de la protéine entraîne une létalité embryonnaire, limitant grandement toute enquête pour étudier la fonction des gènes dans une souris vivante. En second lieu, la présence du système TetO permet l’activation du transgène qu’en présence d’un antibiotique, ce qui permet un contrôle efficace et réversible de l’activité du transgène. Ainsi, en cessant l’administration d’antibiotiques, le système transgénique peut être désactivé, et une expression normale de la RB1 est remis en place. En troisième lieu, la spécificité de l’expression de transgènes peut varier selon le promoteur de choix. Alors que nous avons choisi le promoteur omniprésent de ROSA-CAG pour preuve de principe, plaçant le transgène sous un promoteur spécifique aux tissus est susceptible de restreindre l’expression transgénique non désirées et de faciliter les études sur l’application thérapeutique de ce transgène méthodologie.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM</td><td>GIBCO-BRL</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle, MEME&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>M8042</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>F2442&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine&nbsp ;</td><td>DharmaFECT</td><td>T-2010-03</td><td></td></tr><tr><td>Sal I</td><td>Roche</td><td>11745622</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>Roche</td><td>13090730</td><td></td></tr><tr><td>CaspaTag&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>APT523</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant NF kit de prolifération cellulaire</td><td>Invitrogen</td><td>C35007</td><td></td></tr><tr><td>Rétinoblastome 1 anticorps</td><td>Abcam</td><td>Ab6075</td><td></td></tr><tr><td>c-Myc Anticorps</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>M5546</td><td></td></tr><tr><td>b-actine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67&nbsp ;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Phallodin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques à fluorescence</td><td>FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence&nbsp ;</td><td>NikonEclipse80i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>La gamme de souris TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) est disponible auprès du Jackson Laboratory sous le nom de JAX#032011.&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inhibition de protéine inductible et réversible dominant négatif (dn)

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Inhibition de protéine dominant négatif (DN) est une méthode puissante pour manipuler la fonction des protéines et offre plusieurs avantages par rapport aux autres approches axées sur la génomique. Par exemple, bien que chimérique et Cre-LoxP stratégies de ciblage ont été largement utilisés, les limitations intrinsèques de ces stratégies (activité du promoteur qui fuit, expression de Cre de mosaïque, etc.) ont considérablement restreint leurs demande. En outre, un effacement complet de nombreux gènes endogènes est une létalité embryonnaire, rendant impossible d’étudier la fonction du gène dans la vie postnatale. Pour relever ces défis, nous avons apporté des changements importants à un protocole de génie génétique précoce et combiné (transgénique) version courte du gène Rb1 avec une protéase lysosomale B procathepsin (CB), générer un modèle de souris DN de Rb1 (CBRb). En raison de la présence d’une protéase lysosomale, la protéine de fusion CB-RB1 entière et son interaction complexe sont acheminés pour dégradation induite par le protéasome. En outre, la présence d’un élément inducteur (rtTA) de tétracycline dans la construction transgénique permet une régulation inductible et réversible de la protéine RB1. La présence d’un promoteur de ROSA-CAG omniprésent dans le modèle de souris CBRb rend un outil utile pour procéder à l’ablation de gène Rb1 transitoire et réversible et de fournir aux chercheurs une ressource pour comprendre son activité dans pratiquement n’importe quel type de cellules où la RB1 est exprimé.

En règle générale, concevoir une mutation DN nécessite une quantité considérable d’informations sur la structure et la fonction du POI. En revanche, la stratégie de DN présentée ici est particulièrement utile lorsque les informations structurales et fonctionnelles pour le POI sont limitées. Si le pi est une protéine de multimères, une fusion d’une sous-unité d’une protéase lysosomale peut inhiber principalement les multimères assemblé et, éventuellement, d’autres ligands grâce à une combi...

Nous présentons ici un protocole visant à développer un système inductible dominant négatif, dans lequel toute protéine peut être inactivée conditionnellement par réversiblement surexprimant une version mutante dominant négatif de celui-ci.

Inhibition de protéine inductible et réversible Dominant négatif (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans une grande variété de domaines nécessitant l’inactivation conditionnelle et transitoire d’un gène d’intérêt en exprimant de façon réversible une version négative dominante de celui-ci. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne permet qu’une ablation partielle de l’activité protéique, préservant ainsi une expression endogène résiduelle. Bien que, ici nous décrivons l’inactivation de condition de la protéine de RB, qui fonctionne dans un assemblage multimérique, cette méthodologie peut également être appliquée aux protéines monmériques.Umesh Pyakurel, notre technicien de laboratoire et coauteur du manuscrit, démontrera les procédures. Pour commencer, cultivez des cellules NIH3T3, selon les spécifications du vendeur, à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2, en utilisant le milieu de culture cellulaire recommandé contenant 10% de sérum bovin fœtal. Pour cotransfecter les cellules à l’aide de vecteurs pTet-Splice et pCMV-Tet3G, mélangez d’abord deux à quatre microlitres du réagent de transfection à base de lipides par puits, et un millilitre de DMEM incomplet par puits dans un tube de 15 millilitres, et incuber pendant cinq minutes à température ambiante.Ajoutez deux à trois microgrammes d’ADN plasmatique par puits au mélange DMEM de ce réagrence transfection. Mélanger et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Ajouter un millilitre du mélange contenant de l’ADN et le réaccente de transfection dans le DMEM à chaque puits de plaque de six puits avec des cellules NIH3T3.Après trois à quatre heures d’incubation à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2, ajouter un millilitre de milieu complet. Ensuite, ajouter 2 microlitres de bouillon de doxycycline à chaque puits et marquer l’assiette comme plus-doxycycline. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2.Pour évaluer la fonctionnalité de la construction TetO-DN-CB-myc6-Rb1 dans la promotion de la prolifération cellulaire non reportée, la culture des cellules HEI-OC1 dans le DMEM contenant 10% de FBS, dans des conditions permissives. Pour les études sur la prolifération cellulaire, comptez les cellules HEI-OC1 à l’aide d’un compteur cellulaire. Plaque 10 000 cellules HEI-OC1 par puits sur une plaque de 96 puits en 200 microlitres de volume chacune.Incuber les cellules pendant la nuit à 33 degrés Celsius avec 5% de CO2. Pour induire l’expression transgénique, ajoutez un microgramme par millilitre de doxycycline à un sous-ensemble de cellules HEI-OC1 transfectées. Utilisez l’autre sous-ensemble étiqueté comme moins-doxycycline et les cellules HEI-OC1 non transfectées comme témoins, et incuber les cellules comme 33 degrés Celsius avec 10% de CO2.Pour évaluer la prolifération cellulaire, 48 heures après la transfection, retirez le milieu de culture cellulaire et ajoutez 100 microlitres de solution de liaison de colorant 1x d’un kit de prolifération cellulaire à chaque puits de la micro-plaque. Suivez le protocole du fabricant et incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius. Utilisez un lecteur de microplaque de fluorescence pour mesurer l’intensité de fluorescence de chaque échantillon.Pour évaluer davantage la prolifération cellulaire à l’aide de l’immunocytochimie, plaquez les cellules HEI-OC1 sur un verre de couverture placé dans chaque puits d’une plaque de 12 puits dans le DMEM. Incuber les cellules pendant la nuit à 33 degrés Celsius. Le lendemain, cotransfecter les cellules dans deux puits avec le pTet-Splice et les vecteurs pCMV-Tet3G, puis effectuer le traitement à la doxycycline sur un bon ainsi que fait avec les cellules NIH3T3.Utilisez-en un non transmis ainsi qu’un contrôle. Pour traiter les cellules pour l’étiquetage Ki-67, fixez-les avec 4% de paraformaldéhyde dans PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Après cela, lavez-les trois fois avec du PBS glacé pendant cinq minutes chacun.Ajouter 0,25% de détergent non ionique dans PBS, et incuber pendant 10 minutes. Répétez le lavage trois fois dans PBS pendant cinq minutes chacun. Utilisez 10% sérum pour bloquer les cellules.Dans une chambre humidifiée pendant une heure à température ambiante. Ajouter 500 microlitres d’anticorps primaires Ki-67 et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Lavez les cellules à nouveau trois fois dans PBS pendant cinq minutes chacun.Ajouter un millilitre de l’anticorps secondaire et incuber les cellules pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité. Après avoir enlevé la solution d’anticorps secondaire, lavez les cellules à nouveau trois fois pendant cinq minutes dans PBS dans l’obscurité. Pour étiqueter les cellules HEI-OC1 avec de la phalloidine, incubez-les en 1:200 phalloidin pendant 30 minutes à température ambiante.Pour étiqueter les noyaux cellulaires, incuber les cellules avec cinq microgrammes par millilitre de DAPI pendant 10 minutes à température ambiante. Après la livraison des souris transgéniques, génotyper les chiots à l’aide d’un amorce spécifique à la région de fusion CBRb1 tel que décrit dans le manuscrit. Élever des souris adultes TetO-DN-CB-myc6-Rb1 à la ligne d’inducteur ROSA-CAG-rtTA et tetrecycline pour générer des souris expérimentales DN-CBRb, et génotyper leur progéniture comme décrit dans le manuscrit.NIH3T3 n’exprime pas la protéine RB1 endogène, de sorte que l’expression RB1 robuste observée ici est due à l’induction transgénique en présence de Dox, mais pas en son absence, confirmant l’activation efficace de la construction TetO-DN-CB-myc6-Rb1 mix RB1. En revanche, les cellules HEK293 ont l’expression endogène rb1. L’ajout de doxycycline a conduit à l’activation de TetO-DN-CB-myc6-Rb1 et à une régulation à la baisse de la RB1.L’expression rb1 a été reprise 21 heures après que la doxycycline ait été enlevée des médias. Les cellules HEI-OC1 cotransfectées avec les mêmes vecteurs, ont montré une augmentation modeste mais significative du nombre de cellules suivent le traitement de doxycycline comparé aux cellules transfected non traitées avec la doxycycline, et aux cellules nontransfected. L’hybridation in situ fluorescente a confirmé l’insertion génomique du transgène TetO-DN-CB-myc6-RB1 chez la souris.Il y avait une augmentation initiale de l’expression totale de protéine RB1 dans la cochlée des souris transgéniques traitées avec la doxycycline pendant trois jours comparée au groupe témoin. Cependant, dans les groupes traités avec la doxocycline pendant sept et 10 jours, une réduction significative de l’expression de RB1 a été observée. Indépendamment du tissu analysé, une réduction significative de la protéine RB1 a été observée chez les souris transgéniques traitées avec de la doxocycline, mais pas dans le groupe témoin, confirmant l’efficacité de la construction TetO-DN-CB-myc6-RB1.Tout en essayant cette procédure, il est important de vérifier que chacun des éléments de codage du transgène sont en cadre les uns avec les autres. Si les régions codantes de cathepsine B et de rétinoblastome décrites dans ce rapport étaient, par hasard, reliées hors cadre, elles ne donneraient pas la protéine de fusion prévue. Ainsi, la vérification de la séquence d’ADN doit être effectuée avant d’injecter le transgène dans des embryons de souris unicellulaires.Suivant cette procédure, le promoteur omniprésent de CAG peut être remplacé par des promoteurs spécifiques afin d’étudier la fonction génétique de la manière spécifique d’une cellule.

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Génétique

Un moyen simple et rapide pour générer des lignées de cellules humaines avec inductible et réversible surexpression d'ADNc ou shRNA médiée par le knock-down du gène d'intérêt. Cette méthode permet aux chercheurs de lignées cellulaires de manière fiable et reproductible de manipuler très difficiles à modifier, par des méthodes classiques de transfection transitoire ou knock-down / KO stratégies.

Génération de lignées stables de cellules humaines avec inductible par la tétracycline (Tet-on) shRNA ou expression d&#39;ADNc

La méthode décrite ici est utilisée pour induire la cascade de signalisation apoptotique à des étapes définies afin de disséquer l’activité d’une protéine effectrice bactérienne anti-apoptotique. Cette méthode peut également être utilisée pour l’expression inductible de protéines pro-apoptotiques ou toxiques, ou pour disséquer l’interférence avec d’autres voies de signalisation.

L&#39;application d&#39;un système d&#39;expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire

Nous décrivons ici un système utilisant un bloc protéique in vivo réversible spécifique au site pour bloquer et effondrer les fourches de réplication chez Escherichia coli. L’établissement du bloc de réplication est évalué par microscopie à fluorescence et l’électrophorèse sur gel d’agarose neutre-neutre est utilisée pour visualiser les intermédiaires de réplication.

Induire un blocage du site de réplication spécifique dans<i&gt; E. coli</i&gt; Utilisation d&#39;un système fluorescent répresseur opérateur

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Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral

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Inhibition de protéine inductible et réversible Dominant négatif (DN)

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