Name: Label-Free Imaging d’unique protéines sécrétée par les cellules vivant via iSCAT microscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Découvrez la détection en temps réel de protéines individuelles sécrétées par des cellules vivantes grâce à la microscopie iSCAT sans marquage. Cette méthode permet d'observer les processus biologiques au niveau moléculaire.

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Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck, un poste de professeur Alexander-von-Humboldt et la Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1181). Nous remercions Stefanie Schaffer Universitätsklinikum Erlangen pour fournir les cellules Laz388 et des discussions fructueuses. Nous remercions Simone Ihloff et Maksim Schwab à MPL pour le support technique.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un des aspects plus cruciaux pour obtenir des données iSCAT utile est la possibilité de trouver la bonne position focale à la surface de la lamelle couvre-objet et, en outre, à occuper ce poste pendant de longues périodes de temps. Faute de quoi se traduira par PSF élargie, signaux faibles iSCAT et artefacts associés à la dérive dans les analyses de la dynamique. Il s’avère que trouver le plan focal sur un lamelle couvre-objet propre et surface n’est pas une tâche facile comme caractéristiques de la surface ne sont pas visibles sur l’arrière-plan de faisceau de référence importante (voir Figure 4 d).
Images RAW iSCAT sont souvent masqués par des signaux de fond qui découlent de front d’onde impuretés dans la source d’excitation et peuvent nuire à sa capacité à trouver le bon plan d’imagerie. Soustraction de front d’onde active est un moyen utile pour contourner ce problème et par la suite surveiller l’accent iSCAT pendant une mesure16. Une façon d’y parvenir est par le biais de modulation spatiale échantillon. En bref, un générateur de fonctions s’applique une onde carrée de 50 Hz pour le port de contrôle externe de la scène de piezo, résultant en une modulation de l’échantillonnage spatial à la fréquence appliquée (amplitude de 290 nm). Acquisitions de caméra synchrone découlent de la même source et, lorsqu’il est combiné par le biais de lock-in principes, aboutir à une compensation de wavefront image14,16. L’image résultante indique généralement la rugosité de la lamelle (Figure 4e). Petits éléments restant sur le verre après que nettoyage peuvent être utilisés pour donner le focus au microscope. Paramètres utilisés pour cette étape de soustraction de fond peuvent être changés selon la cadence, durée d’exposition ou matériels.
Comme mentionné ci-dessus, l’utilisation d’un séparateur de faisceau de haute qualité dans les paramètres iSCAT (étape 1.2.1.) est recommandée, comme l’imagerie d’objets comme les images fantômes ou interférence résultant de séparateurs de faisceau planaire mince influencera l’image et perturber la mesure. La figure 7 montre une comparaison entre un séparateur de faisceau de faible qualité et de haute qualité. Les deux images raw iSCAT montrent la même zone sur la lamelle couvre-objet contenant des particules résiduelles. La même configuration iSCAT a été utilisée pour capturer les deux images, le séparateur de faisceau seulement ont été échangé. Figure 7 a montre l’image formée sur la caméra par l’utilisation d’une plus épaisse (5 mm), séparateur de faisceau revêtement antireflet et coincé. Grâce à la conception coincée, le faisceau réfléchi de la surface arrière de la séparateur de faisceau est antiparallèle à la réflexion résultant de la surface frontale et ne pénètre pas dans l’objectif. Sans artefacts interférences se produisent. Figure 7 b montre le même champ de vision sur l’échantillon, mais cette fois un séparateur de faisceau planaire (1 mm) plus mince a été utilisé. Les deux réflexions des surfaces avant et arrière entre le séparateur de faisceau sont parallèles et se propagent à la caméra. Objets d’interférence sont clairement visibles.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> Figure 7 : comparaison d’images iSCAT produites avec séparateurs de faisceau haute et basse-qualité. (a) résultant iSCAT raw image par l’utilisation d’un séparateur de faisceau épais revêtement antireflet et coincé de 5 mm. (b) résultant iSCAT raw image de la même région par l’utilisation d’un séparateur de faisceau planaire épaisse de 1 mm. Les deux séparateurs de faisceau ont le même rapport de fractionnement (réflexion de 50 %, 50 % de transmission). Objets d’interférence dus aux réflexions de Fresnel sont clairement observés dans l’image produite avec le séparateur de faisceau planaire épaisse de 1 mm. Barreaux de l’échelle : 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Dans ce protocole, nous décrivons un schéma d’éclairage grand-angulaire pour iSCAT car il est rapide, facile à réaliser et permet de détection parallèles sur une vaste zone14. Une autre approche courante consiste à utiliser des déflecteurs acousto-optique (ces OD) et balayez un faisceau confocal sur l’échantillon12,17. Cette approche évite la nécessité d’une réentrée de haute qualité, mais est plus expérimentalement complexe que l’imagerie grand champ conventionnel. En outre, la vitesse d’éclairement confocal est limitée par celle de ces OD. Selon les paramètres expérimentaux souhaités, soit régimes d’éclairement confocale ou grand champ peuvent, en principe, être utilisés pour détecter les protéines simples sécrétées par les cellules vivantes.
Tel que discuté dans tout le protocole, il est impératif de réduire au minimum les fluctuations mécaniques latérales dans le stade de l’échantillon du microscope. Même nanomètre déviations dans la position de l’échantillon peuvent conduisent à des variations dans les trames consécutives caméra et provoquer des bruits significatifs dans l’image différentielle. Il est donc recommandé d’utiliser une platine du microscope mécaniquement stable et une amorti table optique (étape 1.1.1.) et pour couvrir l’installation avec des panneaux ou rideaux optique pendant une expérience (étape 3.5.).
Un régime de stabilisation du foyer actif sont également envisageables pour les mesures à long terme. Dans cette approche, un deuxième laser est incorporé dans le microscope dans un arrangement de réflexion totale interne (TIR) et ensuite projeté sur une photodiode quadrant. Changements dans focus du système se traduisent les déplacements latéraux du laser TIR spot sur la diode de quadrant, qui peut ensuite servir dans une boucle de rétroaction active pour contrôler l’axe z du piezo étape26. Les effets de la dérive verticale à long terme sont ainsi éliminées.
Plusieurs modifications et extensions peuvent être appliquées à la technique présentée pour répondre aux besoins spécifiques expérimentales. Par exemple, les incubateurs de stade commercial microscope sont disponibles qui pourraient facilement être incorporées dans le microscope iSCAT pour l’imagerie à long terme des cellules. Autres techniques peuvent également être implémentées pour compléter iSCAT d’imagerie, telles que confocale ou TIR fluorescence microscopies17. Pour adapter le système à l’étude, la sécrétion iSCAT mesures peuvent être effectuées sur d’autres supports de cellules comme DMEM ou SPD, toutefois, le rouge de phénol indicateur pH il faut éviter car elle peut perturber l’expérience due à l’absorption de la lumière laser. En outre, suppléments comme sérum de veau foetal (FCS) ou humain lysat de plaquettes (hPL) contiennent des protéines qui peuvent interférer avec la détection iSCAT. Fonction de la sensibilité désirée de l’expérience, ces suppléments devraient être exclues de la moyen de la microscopie.
iSCAT s’appuie sur la capacité de l’analyte à la lumière de nuages de points XY — une propriété qui fait partie intégrante de toutes les protéines — et n’est donc par nature non spécifique. Néanmoins, une certaine spécificité est possible comme échelle de signaux iSCAT linéairement avec la protéine masse14,27,28. Cela permet l’étalonnage d’un système d’iSCAT en utilisant des échantillons de protéine standard, tels que l’albumine sérique bovine (BSA) et fibrinogène14,27,28. En effet, très récemment, Young et al. 28 ont étendu sur les travaux de Piliarik &amp; Sandoghdar14 et ont montré qu’iSCAT peut être utilisé pour déterminer le poids moléculaire des protéines aussi petits que streptavidine (53 kDa) avec une résolution massive de 19 kDa et une précision d’environ 5 kDa. Plusieurs approches conventionnelles peuvent compléter encore iSCAT en fournissant un niveau supplémentaire de spécificité. Comme un exemple, dosages immuno-enzymatiques (ELISA), et/ou autres modifications de surface, restreignent protéine liant les événements afin que seule la protéine-cible est détecté16.
Dans ce protocole, nous décrit comment les iSCAT microscopie peut être utilisée pour étudier des sécrétions cellulaires au niveau de la seule protéine avec résolution temporelle de subsecond16. La technique est générale et peut être exécutée sur n’importe quel microscope commercial ou maison construite. Contrairement aux approches de la fluorescence des molécules simples, la méthode ne souffre pas de photoblanchiment ou clignotement des effets, mais il atteint sensibilité unique-protéine. Ces caractéristiques font d’iSCAT un outil puissant dans le domaine des biocapteurs et microscopie. Les applications futures porteront sur élucider les interactions cellulaires complexes tels que la réponse immunologique à un stimulus ou de la communication cellulaire.

Protéines sécrétées jouent un rôle important dans divers processus physiologiques1. Pour cette raison, ils sont systématiquement étudiés comme un ensemble collectif (protéomique) ou comme des entités individuelles2,3. Protéomique étudie traditionnellement l’ensemble des protéines présentes dans un système biologique particulier par p. ex., les dosages immuno-enzymatique (ELISA), cytométrie de flux ou spectrométrie de masse4,5, 6. Protéines simples, en revanche, sont détectés en général en utilisant une variété de techniques qui reposent sur la fluorescence7,8, plasmonique9,10ou électrons cryogéniques11 microscopies. Toutes ces techniques utilisent des instruments complexes, étiquetage ou les deux et manquent souvent d’informations dynamique car ils offrent uniquement des informations à long terme sur le système à l’étude.
Ici, nous utilisons iSCAT12,13 microscopie à protéines sécrétoires individuelles de sens avec la seconde résolution temporelle14. Ce qui est important, la technique détecte le signal épars faiblesse intrinsèque à chaque protéine12,14. La quantité de lumière qui disperse un bioparticle petite échelles avec sa polarisabilité. En supposant que la forme d’une protéine peut être approchée par une dispersion efficace sphère14,15,16et que différente protéines ont des indices de réfraction très similaires, le signal mesuré peut être directement connecté à la masse moléculaire (mm) de la protéine. L’étalonnage empirique d’iSCAT contraste par rapport à la masse moléculaire de mesures de référence permet de distinguer les protéines de différentes tailles. iSCAT expériences peuvent facilement être complétés par microscopie de fluorescence17,18, immuno réactifs, ainsi que les étiquettes fluorescentes ou diffusion pour permettre une détection spécifique d’une protéine d’intérêt14 , 17 , 19.
En principe, iSCAT fonctionne en amplifiant la faible lumière de la protéine via interférométrique de mélange avec une vague référence secondaire. L’intensité détectée (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">) dans un iSCAT microscope est décrite par
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
où <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg"> est l’intensité incidente, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg"> est un coefficient pour la contribution de l’onde de référence, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg"> signifie la force de diffusion de la nano-objet à l’étude, et <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg"> est le déphasage entre l’épars et de référence 14de vagues. Soit la transmise ou réfléchie arrière lumière incidente est généralement utilisée comme une onde de référence, où, dans chaque cas <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg"> représente la transmissivité ou la réflectivité de la chambre de l’échantillon, respectivement. Le terme <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg"> est proportionnelle à la section transversale de diffusion de la protéine et peut être négligé par rapport à l’expression de croix. Ainsi, <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg"> pour interférence destructive complète, la lumière détectée est donnée par <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg"> où <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg"> est l’intensité de référence et <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg"> est l’intensité de l’interférence.
la microscopie iSCAT offre une excellente méthode pour l’étude des processus biologiques à l’échelle de la molécule unique. À titre d’exemple, nous étudions les cellules Laz388 — un virus Epstein - Barr (EBV) transformé lymphocyte B cell line20,21 — comme ils sécrètent des protéines telles que les IgG anticorps16. Toutefois, la méthode est générale et peut être appliquée à une variété d’autres systèmes biologiques. iSCAT est intrinsèquement imprécis et peut détecter n’importe quelle protéine ou nanoparticules ou il peut être étendu avec les méthodes courantes de fonctionnalisation de surface pour la détection spécifique ou multiplexée. Sa simplicité et sa capacité à combiner avec d’autres techniques optiques, telles que la microscopie de fluorescence, faire un outil complémentaire précieux iSCAT en biologie cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Item/Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x / 1.46 Objectif NA</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td>alpha Plan Apochromat immersion dans l’huile</td></tr><tr><td>20x / 0.4 Objectif NA</td><td>Leica</td><td>566049</td><td>N Plan</td></tr><tr><td>Piezo Stage</td><td>PI</td><td>P-517k020</td><td>Platine 3 axes avec 100x100x10&micro ; Gamme m</td></tr><tr><td>Laser à diode (445 nm)</td><td>Lasertack</td><td>-01236</td><td></td></tr><tr><td>Optique/Optomécanique</td><td>Thorlabs/Newport-lentilles</td><td></td><td>, miroirs, poteaux, montures</td></tr><tr><td>Sténopé</td><td>Thorlabs</td><td>P30H</td><td></td></tr><tr><td>Source lumineuse LED</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL5</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-court (580 nm)</td><td>Omega Optical</td><td>580SP</td><td>pour modifier le spectre de la LED pour Excitation de fluorescence</td></tr><tr><td>Filtre passe-long (500 nm)</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0500</td><td>pour modifier le spectre de la LED pour l’excitation de fluorescence</td></tr><tr><td>Séparateur de faisceau 70R/30T</td><td>Newport</td><td>20Q20BS.1</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur de faisceau économique</td><td>Thorlabs</td><td>EBS1</td><td>utilisé pour la comparaison des effets de frange</td></tr><tr><td>Séparateur de faisceau à plaque coincée</td><td>Thorlabs</td><td>BSW26</td><td>utilisé pour la comparaison de effets de franges</td></tr><tr><td>Miroir dichroïque passe-court (550 nm)</td><td>Edmund Optics</td><td>66249</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur de faisceau 8R/92T</td> Caméra CMOS <td>Thorlabs</td><td>BP108</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Photonfocus</td><td>MV1-D1024E-160-CL</td><td>pour acquisition iSCAT</td></tr><tr><td>Caméras CMOS</td><td>Mightex</td><td>SCE-B013-U</td><td>pour acquisition en fond clair / fluorescence</td></tr><tr><td>Filtre passe-long (600 nm)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td>FELH0600</tr><tr><td>Ordinateur</td><td>Fujitsu Siemens&nbsp ;</td><td>-</td><td>Processeur Core i7, 16 Go de RAM, logiciel</td></tr><tr><td>d’acquisition</td><td>SSD LabVIEW-LabVIEW</td><td></td> <td>2016 Suite</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse</td><td>Matlab-Matlab</td><td></td> <td>2014</td></tr><tr><td>Suite Nettoyeur</td><td>plasma Diener</td><td>Diener pico</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Binder</td><td>Modèle CB</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Réactif/Matériel</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 moyen</td><td>Gibco</td><td>11835063</td><td>sans rouge de phénol</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59205C</td><td></td></tr><tr><td>Lames de couverture</td><td>Marienfeld</td><td>107052</td><td></td></tr><tr><td>Plats de culture à fond de verre</td><td>ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Microsphères fluorescentes</td><td>Invitrogen</td><td>F8821</td><td>utilisé pour l’étalonnage</td></tr><tr><td>Huile d’immersion Immersol</td><td>Zeiss</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>Colorant à l’iodure de propidium</td><td>Invitrogen</td><td>R37108</td><td></td></tr><tr><td>Petites pointes de pipette</td><td>Eppendorf</td><td>30075005</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette flexibles</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, 99,8</td> %<td>Fisher Scientific</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium, pastilles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465</td><td>pour la préparation d’une solution de NaOH 0,2 M</td></tr></tbody></table>

label-free imaging d’unique protéines sécrétée par les cellules vivant via iscat microscopie

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Nous démontrons microscope interférométrique diffusion (iSCAT), une méthode permettant de détecter des protéines sans étiquette unique sécrétées par les cellules de vie individuel en temps réel. Dans ce protocole, nous couvrons les étapes fondamentales pour réaliser un microscope iSCAT et le compléter avec des chaînes supplémentaires d’imagerie pour surveiller la viabilité d’une cellule à l’étude. Suite à cela, nous utilisons la méthode de détection en temps réel des protéines simples car elles sont sécrétées par une cellule vivante qui nous démontrent avec une lignée de B-cellules immortalisée (Laz388). Les auteurs discutent des mesures nécessaires concernant la préparation du microscope et l’échantillon ainsi que l’analyse des données enregistrées. Le protocole vidéo montre que la microscopie iSCAT offre une méthode simple pour étudier la sécrétion à l’échelle de la molécule unique.

Une représentation schématique d’un microscope iSCAT est montrée dans la Figure 4 a. Lumineux-zone représentative, de fluorescence et images brutes iSCAT sont indiquées dans la Figure 4 b, 4Cet 4D, respectivement16. Figure 4e et 4f montrent les résultats de la suppression de l’arrière-plan et post-traitement différentiel ; deux protéines adsorbés sont visibles sous forme de taches de diffraction-limited dans Figure 4f. La figure 6 montre un histogramme des protéines détectées au cours des 125 s. Ces données ont été obtenues en appliquant un algorithme de recherche de pointe sur les images saisies à compter des liaison des événements et leur contraste16de catalogue. Le nombre total de 503 protéines ont été détecté.
Ensuite, sécrétées espèces sont identifiées par comparaison avec des mesures de référence effectuées sur les solutions de la protéine purifiée, ou par le biais de mesures supplémentaires avec verre fonctionnalisés surfaces14,16. Ainsi, les données iSCAT, visualiser directement entre dynamique de sécrétion cellulaire sur une échelle de subsecond16. À titre d’exemple, nous avons constaté précédemment que les anticorps IgG sont une fraction importante de la secretome Laz388 et sont libérés par la cellule à un taux d’environ 100 molécules par seconde16. En outre, les autres particules qui couvrent un éventail de 100 kDa - 1000 kDa sont sécrétées par les cellules16. La méthode décrite peut être encore employé par exemple, pour enquêter sur le gradient de concentration spatial des sécrétions qui entoure une cellule16, ou de déterminer la dynamique temporelle de lyse cellulaire16.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> Figure 6 : Quantification des protéines sécrétées par une seule cellule de Laz388. L’histogramme montre protéines détectées pendant une période de temps de 125 contraste s. valeurs sont cumulées dans 1 x 10-4 bacs de contraste (barres bleues). Un total de 503 protéines individuelles ont été dénombrées au cours de cette mesure. L’expérience a été répétée 10 fois avec des résultats similaires. Ce chiffre a été adapté de McDonald, M.P. et al. 16. copyright 2018 American Chemical Society. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons un protocole pour la détection optique en temps réel des protéines sans étiquette simples car elles sont sécrétées par les cellules vivantes. Celle-ci repose sur la microscopie interférométrique diffusion (iSCAT), qui peut être appliquée à une variété de configurations et différents systèmes biologiques.

Label-Free Imaging d’unique protéines sécrétée par les cellules vivant via iSCAT microscopie

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Nous avons présenté iSCAT pour la première fois en 2004 dans le cadre de la détection et de la spectroscopie des nanoparticules d’or. Au cours des 10 années qui ont suivi, nous avons développé cette technique pour la détection et le suivi des nanoparticules biologiques comme les virus et les petites protéines. L’essence de la technique est que tout objet matériel, aussi petit soit-il, a une section transversale d’extinction finie.Le principal avantage de cette technique est la détection sans étiquette. Cela signifie que si nous sommes assez sensibles, nous pouvons détecter à peu près n’importe quoi, comme des protéines ou des exosomes sécrétés à partir de cellules individuelles. La question que l’on doit faire attention est de savoir comment traiter l’arrière-plan de diffusion.Un grand avantage d’un microscope iSCAT est qu’il peut être entièrement construit à la maison et il peut être ajouté à un microscope commercial existant. Cela signifie qu’il peut être facilement combiné avec d’autres techniques optiques, telles que la fluorescence, et c’est l’une des raisons pour lesquelles de nombreux groupes utilisent également maintenant iSCAT et les techniques connexes. Ici, nous utilisons les cellules LUZ comme un système modèle pour montrer la détection des protéines individuelles et sécrétaires.Cependant, cette méthode peut également être appliquée pour sonder presque n’importe quel processus biologique au niveau moléculaire. Pour obtenir un microscope stable, commencez par une table optique amortie et un bloc massif rigide pour l’étape de l’échantillon. Construisez une étape d’échantillon de microscope qui incorpore un objectif d’ouverture numérique élevé et une unité de traduction qui permet la traduction latérale d’échantillon aussi bien que le changement de position de foyer pour l’objectif.Utilisez un miroir de couplage vertical de 45 degrés et une lentille singlet de longueur focale de 50 centimètres pour concentrer la lumière d’un laser à diodes à longueur d’onde 445 nanomètres sur le plan focal arrière de l’objectif. Cette lentille de champ large crée un faisceau collimated à la mise au point vers l’avant de l’objectif, qui deviendra la source d’éclairage iSCAT. Appliquez une gouttelette d’huile d’immersion sur l’objectif et placez un couvercle en verre dans le plan d’échantillon de l’étape du microscope.Il en résultera un faisceau qui se reflète vers le bas à travers l’objectif d’imagerie. Pour mettre en place la trajectoire d’imagerie, introduisez un beamsplitter enduit anti-reflet à un angle de 45 degrés par rapport au faisceau incident et d’environ 10 centimètres après la lentille de champ large. Assurez-vous que le revêtement anti-reflet pointe vers la source laser.Faites attention car un beamsplitter épais introduira le déplacement significatif de faisceau de sorte que le laser pourrait ne pas entrer dans l’objectif droit plus. Si nécessaire, réalignez la trajectoire du faisceau laser devant le beamsplitter pour assurer la propagation correcte à travers l’objectif. Pour s’assurer que le plan de l’échantillon et la caméra sont parfocals, commencez par placer une lentille concave avec une longueur focale négative de 45 centimètres à une position cinq centimètres après la lentille de champ large dans la trajectoire du faisceau incident.Il en résultera un faisceau collimé entrant dans l’ouverture arrière de l’objectif. Avec l’écran placé dans le bras réfléchissant de l’interféromètre, déplacez l’objectif dans la direction verticale pour trouver la position focale grossière. L’objectif est au point lorsque le faisceau frappant l’écran est rassemblé.Retirez à la fois l’objectif négatif de la longueur focale et l’écran lorsque la mise au point grossière est terminée. Ajoutez une deuxième lentille monocette de 50 centimètres de longueur focale pour concentrer la lumière éparse et pour collimate la lumière réfléchie. Assurez-vous que la lentille est placée à 50 centimètres du plan focal arrière de l’objectif de sorte que le faisceau laser transmis soit de nouveau rassemblé.Pour compléter l’assemblage de configuration iSCAT, placez la caméra CMOS à 50 centimètres de l’objectif focal de 50 centimètres et placez le faisceau directement sur le milieu de la puce. Pour mettre en place des canaux d’imagerie supplémentaires, couplez la sortie d’une source lumineuse LED en un objectif à longue distance de travail. Installez des composants mécaniques au-dessus de la chambre d’échantillonnage qui permettent de concentrer et de positionner latéralement la sortie LED sur l’échantillon.Déplacez l’objectif supérieur latéralement de sorte que l’objectif supérieur de champ large et l’objectif inférieur d’iSCAT soient colinear. Ceci est déterminé en plaçant un écran sous l’objectif inférieur et en maximisant l’intensité de la lumière LED transmise sur l’écran. Maintenant, placez un miroir dichroïque de passage court de 550 nanomètres pour diviser la lumière transmise de LED de la trajectoire laser d’iSCAT.Divisez ce faisceau en deux canaux avec un beamsplitter réfléchissant de huit pour cent, 92 pour cent transmissif. Le chemin de 92 pour cent est le canal de fluorescence, et le chemin de huit pour cent est utilisé pour l’imagerie brightfield. Image du canal brightfield sur une caméra CMOS à l’aide d’un objectif doublet achromatique de longueur focale de cinq centimètres.Imagez le canal de fluorescence sur une caméra CMOS séparée à l’aide d’une lentille achromatique à doublette de longueur focale de cinq centimètres. En outre, utilisez un filtre longpass de 600 nanomètres pour bloquer la lumière d’excitation. Pour configurer l’ordinateur et le logiciel, connectez toutes les caméras à un ordinateur.Sur la configuration entièrement assemblée, observez l’image iSCAT sur la caméra CMOS et assurez-vous qu’elle est au point en trouvant une poussière résiduelle ou une particule de saleté sur le couvercle en verre. Vérifiez que l’image de la particule est une fonction de propagation circulairement symétrique du point. La fonction de propagation de point n’aura pas une forme circulaire si le faisceau laser entre dans l’objectif du microscope à un léger angle.Ceci peut être corrigé par un léger ajustement du miroir de 45 degrés pour assurer un couplage droit dans l’objectif. Comparez les images de la caméra du champ lumineux et des canaux de fluorescence. Assurez-vous que les deux sont au point, et afficher la même zone en imagerie d’une perle fluorescente ou un échantillon de cellule.Vérifiez que la position du laser iSCAT est approximativement au centre de l’image, et prenez note de sa position pour référence ultérieure. Pour changer la position et le champ de vision du champ lumineux et du canal de fluorescence, déplacez les caméras sur la table en ce qui concerne les lentilles de mise au point. Préparez-vous à l’expérience tel que détaillé dans le protocole texte.Cela comprend la préparation des cellules et du milieu de microscopie, ainsi que la cuvette échantillon microscope. Assurez-vous que le faisceau laser est bloqué pour empêcher les cellules d’être directement exposées à la lumière laser iSCAT. Injecter environ trois microlitres de l’échantillon de cellules préparées légèrement hors du centre dans la cuvette de l’échantillon.Touchez doucement la pointe pipette à la fiche de couverture et injectez lentement la solution cellulaire. Laissez les cellules s’installer sur le coverslip. Vérifiez le nombre de cellules proches du laser iSCAT.Si le nombre de cellules est trop faible, répétez cette étape jusqu’à ce qu’un nombre suffisant soit disponible. Si la couverture des cellules est trop dense, utilisez une injection d’environ 20 microlitres de microscopie supplémentaire pour disperser les cellules à travers le coverslip. À l’aide de l’étape de traduction piezoélectrique, déplacez l’échantillon latéralement pour positionner une cellule près du champ de vision iSCAT.Assurez-vous que la cellule n’entre pas dans le champ de vision de l’iSCAT, car l’exposition directe à la lumière laser de 445 nanomètres pourrait être nocive pour la cellule. Débloquez le faisceau laser iSCAT et assurez-vous que la surface du coverslip est toujours au point. Enfermez la table d’isolement pour minimiser la dérive et le couplage acoustique de l’environnement ambiant.Commencez la mesure en acquérant des images des caméras iSCAT, brightfield et fluorescence. Vérifiez périodiquement la viabilité de la cellule et l’orientation du système. Ici, un logiciel de microscope auto-écrit est utilisé pour afficher les images de la caméra.Ici, l’imagerie différentielle est effectuée en temps réel par soustraction de cadres consécutifs pour rendre visibles les liaisons protéiques. Il en résulte une image filtrée qui est visible sur l’écran avec l’image brute de la caméra. Les résultats représentatifs d’une expérience de sécrétion cellulaire réalisée avec iSCAT sont présentés ici.La vidéo montre les sécrétions d’une cellule LAZ sur une période de deux minutes. Les images iSCAT différentielle sur la gauche visualisent l’absorption de protéines simples sur le verre de couverture. Les images brillantes et le canal de fluorescence sur la droite sont utilisés pour surveiller la viabilité des cellules.Cet histogramme montre les protéines détectées et leur plage de contraste dans cette période de deux minutes. Les données ont été recueillies en analysant les événements de liaison individuels dans chaque image des données vidéo iSCAT à l’aide d’un algorithme de recherche de pic personnalisé. La microscopie ISCAT n’est pas seulement un outil puissant en biocaptation, mais aussi en microscopie, car elle permet la détection sans étiquette de nano-objets en temps réel.En particulier, il peut être appliqué à une variété de processus tels que la diffusion et le transport des protéines. En raison de sa sensibilité exquise à la diffusion de la lumière, iSCAT peut détecter n’importe quelle protéine ou entité dans le champ de vision. Bien sûr, cela signifie également que la technique n’a pas la spécificité que la fluorescence apporte le long, mais pour contourner ce problème, on peut appliquer des méthodes supplémentaires comme la fonctionnalisation de surface pour détecter des protéines spécifiques d’intérêt.N’oubliez pas que travailler avec des lasers peut être dangereux, et une protection oculaire appropriée doit toujours être porté lors de l’assemblage et l’ajustement du microscope. La détection en temps réel des sécréomes est très excitante et un grand saut dans le diagnostic médical, qui nécessite actuellement beaucoup plus de temps et est très loin de la sensibilité aux protéines. Il y a encore beaucoup de place pour améliorer les performances de la méthode et étendre ses applications.Nous espérons donc que cette vidéo aidera d’autres groupes à se joindre à cet effort passionnant.

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