Name: Démêlé les acteurs clés de l’immunité humorale : avancé et optimisé protocole d’isolement de Lymphocyte de patchs murin de Peyer (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Découvrez un protocole optimisé d'isolement de lymphocytes des plaques de Peyer murines sans digestion par collagénase. Cette méthode améliore la qualité cellulaire pour l'étude des lymphocytes T folliculaires et des cellules B des centres germinatifs.

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Nous tenons à remercier Laura Strauss et Peter Sage pour discussions utiles et appuyer avec les analyses de cytométrie de flux.

Toutes les études et les expériences décrites dans le présent protocole ont été effectuées en vertu des lignes directrices selon Institutional Animal Care et utilisation Comité (IACUC) de Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. conception de montage expérimental et des groupes de souris
<ol><li>(Facultatif) La maison conjointement les souris expérimentales afin de faciliter la transmission horizontale du microbiote intestinal entre souris expérimentales et à réduire la variabilité non spécifiques au sein des lymphocytes PP. En outre, utiliser des contrôles de la même portée du même sexe afin de minimiser la variabilité.</li>
</ol>2. chirurgicale Excision et étapes de préparation de tissus :
<ol><li>Ablation chirurgicale de l’intestin grêle (is)<ol>
<li>Euthanasier la souris à l’aide de CO2 asphyxie ou toute autre méthode équivalente approuvée par le Comité institutionnel d’éthique animale.</li>
		<li>Transférer la souris dans un espace dédié pour excision chirurgicale. Placer le dos vers le bas et assainir l’abdomen avec l’éthanol à 70 %. Effectuer une laparotomie en coupant la peau abdominale et le péritoine le long de la ligne médiane du pubis à la cage thoracique, ouvrant ainsi la cavité péritonéale. Remarque : Effectuez la première incision sur une zone relativement petite de la peau afin d’éviter de pénétrer dans la cavité péritonéale et endommager les tissus intestinaux. Continuer l’excision jusqu'à la frontière anatomique désirée.</li>
		<li>Identifier le caecum, qui est un point de repère idéal pour la détection de l’iléon terminal, ce qui constitue le segment distal de l’intestin grêle. NOTE : Caecum se trouve habituellement sur le côté inférieur gauche de l’abdomen de la souris.</li>
		<li>Localiser la jonction iléo-caecale et faites une coupe à ce niveau aussi distale que possible de séparer l’intestin grêle du caecum. Dans l’ensemble les prochaines étapes, évitez un contact physique excessif avec la paroi intestinale car PPs fragiles s’effondrer facilement au toucher.</li>
		<li>Retirez délicatement l’intestin entier jusqu'à ce que le sphincter pylorique en coupant le mésentère à l’aide de ciseaux. Identifier la jonction entre le pylore et du duodénum, et découper le duodénum à ce niveau, ce qui conduira à compléter le détachement de l’intestin grêle de la cavité abdominale. NOTE : (i) éviter hyperextension car cela pourrait provoquer la rupture de la paroi intestinale. (ii) si isolement lymphocytaire LP est souhaitée en plus de lymphocytes PP, le retrait complet de la graisse mésentérique est nécessaire. Toutefois, pour l’isolement de PP seulement, restant la graisse mésentérique pourrait fournir certains avantages pendant les nouvelles mesures d’isolement ; par conséquent, il devrait être préservé.</li>
		<li>Intestin grêle place détaché dans une plaque 6 puits remplis de RPMI froid + 10 % sérum fœtal (SVF) et agiter délicatement les tissus manuellement jusqu'à ce que tous les segments intestinaux sont immergés dans les médias froids. Maintenir les tissus sur la glace tout au long des prochaines étapes.</li>
		<li>Après dissection le nombre désiré de souris petits intestins, procéder à l’excision de PP de collectées petit intestin.</li>
	</ol></li>
	<li>Excision chirurgicale des PPs et préparation de la Suspension cellulaire unique :<ol>
<li>Doucement, l’intestin grêle de transfert sur une serviette en papier, en la saisissant la graisse mésentérique avec une pincette et placer le côté mésentérique vers la serviette en papier. Humidifier l’ensemble du segment intestinal avec froid RPMI + 10 % FBS pour éviter la déshydratation des tissus et rigidité. NOTE : Restant de graisse mésentérique peut être utile à ce stade parce que les segments de tissu graisseux sur le site mésentérique de SI seront en tiendra à la serviette de papier gardant le site anti-mésentérique vers le haut.</li>
		<li>Identifier le PPs, qui apparaissent comme blancs agrégats sphériques multiples dans une forme « chou-fleur » sur le côté anti-mésentérique de la paroi intestinale. Remarque : Débusquer le contenu luminal est déconseillé jusqu'à ce que tous les PPs sont excisés. Vider le contenu luminal pourrait entraîner l’effondrement du PPs et empêchera le contraste de couleur entre les PPs et la paroi intestinale, ce qui est très utile pour l’identification visuelle des PPs.</li>
		<li>Après avoir identifié les PPs sur le côté anti-mésentérique, placez le ciseaux bout courbé chirurgicale sur PPs (courbe devrait faire face vers le haut) interdisant la PP de sa bordure distale et proximale. Facultatif : Poussez le PP doucement vers les lames des ciseaux bout du doigt. Cette manœuvre entraînera l’exclusion mieux des non-PP tissus environnants. L’accise le PPs doucement, à l’exclusion de tissu intestinal environnant. NOTE : (i) cette étape est fondamentale obtenir le rendement maximal des cellules PP tout en réduisant au minimum la contamination de la cellule des voisins compartiments intestinaux tels que LP et l’épithélium intestinal, qui sont aussi riches en lymphocytes T. (ii) d’un SI excisé de souris C57BL/6, 5-10 PPs (de taille moyenne, multiples sphériques) peuvent être collectées. En visant une encore plus petites PPs (pas multiples sphériques), collection de jusqu'à 12-13 PPs par souris (C57BL/6) est possible en utilisant ce protocole.</li>
		<li>Transfert le PPs excisé à une plaque de culture de tissu de 12 puits remplis de glacee RPMI + 10 % FBS et entretenues sur glace à l’aide de forceps ou ciseaux chirurgicaux incurvé. NOTE : (i) immédiatement après l’excision de PPs, mucus et contenu intestinal sur la surface PP peuvent être nettoyés en frottant le tissu délicatement sur du papier absorbant. Cette étape permettra d’améliorer la viabilité des lymphocytes PP. (ii) au lieu de transférer le PPs sur une plaque, transférant à séparés des tubes peut également considérer selon le nombre total de l’échantillon.</li>
		<li>Facultatif : Lorsque l’excision PP et placement ultérieur dans le puits de la plaque sont terminées, le nombre et la taille des PPs prélevés dans des groupes différents expérimental/souris peuvent être documentées en prenant une photo de la plaque de culture tissulaire contenant du PPs.</li>
		<li>Préparer une série de tubes coniques de 50 mL contenant 25 mL de RPMI + 10 % SVF (préchauffé à 37 ° C). À l’aide d’une paire de ciseaux, couper le bord d’une pointe µL 1 000 de la distance qui permettra à l’aspiration du PPs avec pipette 1 mL. Aspirer le PPs avec pipette 1 mL et transférer de la plaque de culture de tissu de 12 puits sur les tubes coniques de prêt de 50 mL. Remarque : Utiliser un nouvel embout pour chaque échantillon de souris pour éviter la contamination croisée entre les échantillons.</li>
		<li>Fixer le couvercle et placer les tubes verticalement dans un agitateur orbital à 37 ° C, sous agitation continue à 125 à 150 tr/min pendant 10 min. Pendant ce temps, préparer une nouvelle série de tubes de 50 mL et placer une crépine de cellule de 40 µm sur le dessus de chaque tube, à travers lequel suspension monocellulaire sera préparée. NOTE : (i) l’étape agitation supprimera les débris contenus, de mucus et de cellules intestinales restants, qui diminue la viabilité des cellules et la récupération des lymphocytes PP si il n’est pas supprimé. (ii) ne s’appliquent pas n’importe quel type d’enzymes digestives sur tissu PP parce que le processus de digestion entraîne une perte dramatique d’expression CXCR5 de la surface cellulaire.</li>
		<li>Après l’agitation, transférer le PPs à la crépine de cellule de 40 µm sur le dessus les tubes nouvellement préparé conique de 50 mL. En utilisant le côté arrondi d’un piston de seringue de 10 mL, perturber doucement le PPs à travers le tamis cellulaire pour générer suspension monocellulaire. Rincer la crépine avec 15 à 20 mL de froid RPMI + 10 % FBS. NOTE : (i) avant de filtrer, secouer les tubes contenant le PPs horizontalement. Cette secousse brève facilitera le transfert des PPs dans les crépines de cellule. (ii) en utilisant une passoire de cellule de 70 µm pour isoler des cellules immunitaires non lymphoïdes (e.g., monocytes, macrophages, DCs) est recommandé.</li>
		<li>Centrifuger les suspensions unicellulaires à 350 – 400 g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
		<li>Soigneusement, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules à une concentration de 10 x 106 cellules/mL. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. NOTE : (i) avant de comptage de cellules, le nombre total de cellules pour chaque groupe de souris PP peut être environ estimée selon la formule suivante : « à 0,5 ou 1 x 106 cellules (nombre de PPs) x = nombre total de cellules ». Autres dilutions avec trypan blue pour le comptage des cellules peuvent être nécessaires. (ii) comme alternative au comptage manuel, compteurs de cellules automatisées peuvent être utilisés.</li>
		<li>2-2. 5 x 106 cellules en volume approprié de transférer (e.g., 200 µL) dans une plaque 96 puits fond rond. Remarque : Pour les unicolores et des échantillons de contrôle négatif, 0,5 à 1 x 106 cellules pourraient suffire.</li>
		<li>Centrifuger la plaque à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Mettez la plaque.</li>
		<li>Laver les cellules dans 200 µL de tampon de coloration.</li>
	</ol></li>
</ol>3. surface anticorps
<ol><li>Viabilité de coloration :<ol>
<li>Après le lavage final, remettre en suspension les cellules de 100 μL de viabilité fixable colorant dilué dans du PBS (1:1, 000). Incuber pendant 30 minutes sur la glace ou à 4 ° C dans l’obscurité. NOTE : (i) intracellulaire de coloration pour la détection des clés transcription facteurs comme Foxp3 ou Bcl-6 exige la fixation des cellules. Dans ce cas, non réparable viabilité colorants (par exemple., 7-AAD, DAPI) ne peut pas être utilisé. (ii) afin de diluer le colorant de viabilité réparable, n’utilisez pas n’importe quel tampon coloration qui contient des protéines. Les médias utilisés dans cette étape doivent être exempt de protéines. (iii) l’exclusion des cellules mortes à l’aide de coloration de la viabilité est cruciale car les cellules mortes peuvent causer de graves difficultés techniques d’analyse en cytométrie en flux en émettant l’autofluorescence et par des anticorps de surface de liaison non spécifique, qui pourrait conduire à fausses résultats positifs.</li>
		<li>Laver les cellules deux fois avec le tampon de coloration. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Mettez la plaque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloc de FC et Surface - couche I:<ol>
<li>Préparer la solution de Fc-bloc en diluant les anticorps anti-CD16/32 (1 : 200) dans la mémoire tampon de coloration.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules de 20 μL de solution préparée de Fc-bloc. Incuber pendant 15 minutes sur la glace.</li>
		<li>Sans laver, ajouter 80 μL de surface anticorps cocktail (voir le tableau 1 pour la synthèse d’anticorps) préparés à des dilutions appropriées. Incuber sur glace pendant au moins 30 min.</li>
		<li>Laver deux fois en ajoutant tampon coloration excessive. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Mettez la plaque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Surface - couche II :<ol>
<li>Préparer la solution colorante streptavidine en diluant fluorochrome conjugué streptavidine dans le tampon de coloration.</li>
		<li>Après le lavage final, remettre en suspension les cellules avec 100 μL de streptavidine préalablement diluée (1/100) solution de coloration. Incuber pendant au moins 15 minutes sur la glace dans l’obscurité.</li>
		<li>Laver deux fois avec le tampon de coloration. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4° C. Mettez la plaque. Facultatif : Si coloration intracellulaire pour T réglementaires folliculaires détection n’est pas souhaitée, après le dernier lavage, remettre en suspension les cellules dans 200 μl de tampon et le transfert dans les tubes appropriés en vue d’acquérir des données dans le cytomètre en flux de coloration. Lorsque les échantillons ne sont pas fixes, acquisition de données par cytométrie en flux doit être effectuée dans les 3 à 4 h afin d’obtenir des résultats précis.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cellule Fixation
<ol><li>Préparer la solution de travail de fixation/perméabilisation (Fix/Perm) en utilisant les réactifs de Foxp3/Transcription Factor coloration Set de tampon. Mélanger une partie de fixation/perméabilisation concentré avec trois pièces de fixation/perméabilisation diluant jusqu’au volume final souhaité.</li>
	<li>Après le lavage final, remettre en suspension les cellules dans 200 μl de solution de travail Fix/Perm.</li>
	<li>Incuber les plaques sur la glace ou à 4 ° C pendant 20 min. Ne dépassez pas 20 min pour cette étape. Temps d’incubation plus long pourraient diminuer fortement la récupération de la cellule.</li>
	<li>Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à 4 ° C. Mettez la plaque. (Facultatif) Après cette étape, les cellules fixes peuvent être stockés pendant plusieurs jours à 4 ° C dans un tampon contenant de l’albumine sérique bovine (BSA) la coloration ou FBS jusqu'à intracellulaire coloration ou écoulement cytometry acquisition ultérieure.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules dans 200 μl de perméabilisation tampon (x1) fraîchement préalablement dilué dans l’eau désionisée purifiée.</li>
	<li>Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Laver une fois avec 200 μl de tampon de perméabilisation et centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
</ol>5. intracellulaire de coloration
<ol><li>Préparer la solution de Fc-bloc en diluant les anticorps anti-CD16/32 (1 : 200) dans un tampon perméabilisation. Remarque : Après l’étape de fixation, les cellules doivent être maintenues dans un tampon perméabilisation jusqu'à la fin du processus de coloration intracellulaire.</li>
	<li>Après le lavage final, remettre en suspension les cellules de 20 μL de solution Fc-bloc. Incuber pendant 10 à 15 min à ta dans l’obscurité.</li>
	<li>Sans laver, ajouter 80 μL de cocktail intracellulaire anticorps (volume final de 100 μL) préalablement dilué dans un tampon perméabilisation. Incuber 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de tampon de Perm et centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Laver une fois avec 200 μL de tampon de perméabilisation, centrifuger à 350 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Après le lavage final, remettre en suspension les cellules dans 200 μl de tampon de coloration et transférer les cellules dans les tubes appropriés (volume final de 400 ml dans le tampon de marquage) et acquisition de données par cytométrie en flux. Les échantillons colorés en plaque 96 puits peuvent également être exécutés sans transférer dans des tubes si un cytomètre en flux avec option de lecteur de plaque est disponible. Cette étape minimise la perte de cellules pendant le transfert de cellule.</li>
	<li>Acquérir un minimum de 5 x 105 cellules total sur le cytomètre en flux pour pouvoir effectuer une analyse reproductible de TFH, ISF ainsi que GC B des cellules.</li>
</ol>

<ol><li>van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+%E2%80%98self%E2%80%99+recognition%3A+a+role+for+CD47-SIRP%CE%B1+interactions+in+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation.</a> Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).</li>
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</ol>

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Nous décrivons ici un protocole optimisé pour la caractérisation de cytométrie en flux des cellules TFH et GC B. Un des principaux avantages de notre protocole est qu’il permet l’isolement de jusqu'à 10 cellules PP totales7 (en moyenne 4 à 5 x 106 cellules) d’une seule souris (souche C57BL/6) sans n’importe quel processus de digestion. Nous avons observé que le rendement total de cellules est positivement corrélé avec le nombre de PPs et pouvait être estimé à partir de l’équation simple suivante ce ...

Le tube digestif entier dès le début à la fin est paré avec un vaste réseau lymphoïde qui contient des cellules immunitaires plus que tout autre organe chez l’homme et la souris1. Peyer de patchs (PPs) constituent une composante majeure de la branche intestinale de cet organisme immunitaire cellulaire, ce qu’on appelle tissu lymphoïde associé au tube digestif (GALT)2,3. Au sein de PPs, des milliers de millions d’antigènes provenant des matières alimentaires, agents pathogènes et le microbiote commensal sont échantillonnés en permanence et quand nécessaire les réponses immunitaires appropriées à leur égard sont monté immunitaire intestinal donc maintenant homéostasie. En ce sens, PPs peuvent être nommés comme « les amygdales de l’intestin grêle ». PPs sont constitués de grands compartiments secondaires : dôme sous-épithéliaux (SED), grandes zones de follicule de B-cellule ; l’épithélium de follicule associée sus-jacente (EAF) et interfolliculaire région (aux instruments IFR) où les cellules T sont situé au4. Ce cloisonnement unique des sous-ensembles de cellules effectrices différents PPs permet de coopérer, confère ainsi, immunocompétence dans le tube digestif.
PPs manquent de vaisseaux lymphatiques afférents, et pour cette raison, antigènes transportés à PPs d’intestin grêle ne sont pas en cours par l’intermédiaire des vaisseaux lymphatiques contrairement à la plupart des autres organes lymphoïdes. Au lieu de cela, les cellules épithéliales spécialisées situés dans EAF, appelées cellules M, sont responsables pour le transfert des antigènes luminaux dans le PPs5. Par la suite, les antigènes transportés sont captés par les cellules dendritiques (CD) et les phagocytes qui sont trouvent dans la région de dôme sous-épithéliaux (SED) sous les EAF6,7. Ce processus de tri antigène par DCs dans le PP est crucial pour initier la réponse immunitaire adaptative8 et la génération ultérieure d’IgA sécréteur cellules9.
En raison du lourd fardeau antigénique de la flore commensale et matériel alimentaire, PPs hôte endogène activé effecteur T et cellules B sous-ensembles en grande abondance par exemple TFH et IgA+ GC B cellules10, suggérant que le PPs représentent un site d’immunitaire active réponse11. Détection jusqu'à 20-25 % cellules CD4 total FOH+ T cell compartiment et jusqu'à 10 à 15 % GC B cellules au sein des cellules B totales est possible en PPA prélevés non immunisés de souris C57BL/6 jeunes12. Contrairement à d’autres types de cellule auxiliaire T (i.e., Th1, Th2, cellules Th17), TFH cellules présentent tropisme unique follicule lymphocytes B, principalement en raison de l’expression CXCR5, qui promeut le homing cellule TFH le long du gradient CXCL1313. Dans les zones de follicule de lymphocytes B du PPs, cellules TFH induisent la recombinaison de commutateur de classe IgA et le hypermutation somatique dans les lymphocytes B activés d'où haute affinité IgA produisant des cellules différencient le14. Par la suite, ces plasmocytes sécrétant des anticorps migrent vers la lamina propria (LP) et réguler l’homéostasie immunitaire dans le tube digestif10.
Identification et caractérisation des populations de cellules TFH et GC B dans PPs pourraient permettre aux chercheurs étudier la dynamique de la réponse immunitaire humorale dans des conditions d’équilibre sans avoir besoin de modèles de vaccination chronophage utilisé traditionnellement en TFH-GC B cellule études15,16,17,18. Analysant les cellules TFH dans PPs n’est pas aussi simple que les autres sous-ensembles de cellules. Défis techniques comprennent l’identification des conditions de préparation de tissu idéal, combinaison anticorps-marqueur de surface, mais aussi de sélectionner des contrôles positifs et négatifs appropriés. Champs de recherche tant TFH et PP pièce grande variabilité en termes de procédures expérimentales et sont loin de conférer un consensus afin d’établir des protocoles standardisés pour différentes raisons. Tout d’abord, chaque sous-ensemble de cellules au sein du PPs tend à être affectées différemment par les conditions de préparation des tissus nécessitant des modifications supplémentaires dans une manière de sous-ensemble spécifique de cellule. Deuxièmement, il y a un écart important entre les méthodes signalées concernant les détails de la préparation de cellules de PPS. Troisièmement, le nombre d’études comparatives basées sur le protocole étudie les techniques de préparation des tissus idéal et conditions expérimentales pour PP et TFH recherche est plutôt limité.
Les études actuelles basées sur le protocole suggérés pour PP cellule préparation19,20,21,22 n’étaient pas TFH - ou GC axée sur les lymphocytes B. En outre, certaines conditions de préparation de tissus recommandées pour PPs19,20 comme la digestion de collagénase base trouvées d’affecter le résultat de l’identification de TFH par cytométrie18. Sur cette base, nous avons pensé qu’un protocole optimisé, standardisé et reproductible qui peut être utilisé pour étudier la dynamique de cellules TFH et GC B dans PPs pourrait se révéler utile aux enquêteurs travaillant sur le sujet. Ce besoin nous a donné l’élan nécessaire pour générer un protocole amélioré et à jour pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes PP finement optimisée pour la récupération de cellulaire, la viabilité et l’efficacité pour la caractérisation de cytométrie en flux de plusieurs T et B sous-ensembles de cellules. Nous visait également à exclure plusieurs étapes de préparation laborieuse suggérés dans les protocoles antérieurs, ainsi, réduire les manipulations nécessaires et le temps de préparation de tissus et de cellules de PPs.

<table><tbody><tr><td>anticorps anti-souris CD4</td><td>eBioscience, Biolegend*</td><td>17-0041-81 ,10054*</td><td>Pour plus d’informations, voir le Tableau 1</td></tr><tr><td>anticorps anti-souris CD19</td><td>eBioscience</td><td>MA5-16536</td><td>Pour plus d’informations, voir le Tableau 1</td></tr><tr><td>anticorps anti-souris-1</td><td>eBioscience</td><td>61-9985-82</td><td>Pour plus d’informations, voir le Tableau 1</td></tr><tr><td>anticorps anti-souris ICOS</td><td>eBioscience</td><td>12-9942-82</td><td>Pour des informations détaillées, voir le Tableau 1</td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris GL7</td><td>Biolegend</td><td>144610</td><td>Pour des informations détaillées, voir le Tableau 1</td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris CXCR5</td><td>Biolegend*, BD Bioscience</td><td>145512*, 551960</td><td>Pour des informations détaillées, voir le Tableau 1</td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris BCL-6</td><td>Biolegend</td><td>358512</td><td>Pour des informations détaillées, voir Tableau 1</td></tr><tr><td>Foxp3 anti-souris anticorps</td><td>eBioscience</td><td>17-5773-82</td><td>Pour plus d’informations, voir le Tableau 1</td></tr><tr><td>Streptavidin-BV421</td><td>BD Bioscience</td><td>563259</td><td>Pour plus d’informations, voir le Tableau 1</td></tr><tr><td>FixableViability Dye</td><td>eBioscience</td><td>L34957</td><td>Pour plus d’informations, voir le Tableau 1</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Biolegend</td><td>420404</td><td>Pour des informations détaillées, voir le Tableau 1</td></tr><tr><td>FcBlock (CD16/32)</td><td>BD Bioscience</td><td>553141</td><td>Pour plus d’informations, voir le Tableau 1</td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Worthington</td><td>LS004188</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 6 puits, 12 puits et 96 puits</td><td>Falcon/Corning</td><td>353046,353043/3596</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>40 & micro ; Filtre à cellules m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>10 mL seringue-piston</td><td>Exel INT</td><td>26265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>VWR</td><td>Modèle 200</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td></td> à extrémité incurvée<td></td><td></td></tr><tr>Pince <td></td><td></td><td></td><td>dentelée fine</td></tr><tr><td>Petit ciseau</td><td></td><td></td><td></td> courbé</tr></tbody></table>

démêlé les acteurs clés de l’immunité humorale : avancé et optimisé protocole d’isolement de lymphocyte de patchs murin de peyer

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

Dans la muqueuse de l’intestin, cellules immunitaires constituent une entité unique immunologique, ce qui favorise la tolérance immunitaire tout en conférant simultanément des défenses immunitaires contre les agents pathogènes. Il est bien établi que de Peyer (PPs) ont un rôle essentiel dans le réseau de système immunitaire muqueux en accueillant plusieurs effecteur T et cellules B sous-ensembles. Une certaine fraction de ces cellules effectrices, les folliculaire T helper (TFH) et les cellules de B de centre germinatif (GC) sont professionnalisé dans la régulation de l’immunité humorale. Par conséquent, la caractérisation de ces sous-ensembles de cellules au sein du PPs quant à leur programme de différenciation et les propriétés fonctionnelles peut fournir des informations importantes concernant l’immunité des muqueuses. À cette fin, une méthode facilement applicable, efficace et reproductible d’isolement de lymphocyte de PPs serait utile aux chercheurs. Dans cette étude, nous avons cherché pour générer une méthode efficace pour isoler des lymphocytes de souris PPs avec rendement élevé cellulaire. Notre approche a révélé qu’évoluées telles que l’utilisation de réactifs digestifs et agitation de tissu, le tissu initial ainsi que cell coloration de conditions et de sélection des panneaux d’anticorps, ont une grande influence sur la qualité et l’identité des lymphocytes isolés et sur résultats expérimentaux.
Nous décrivons ici un protocole permettant aux chercheurs d’isoler efficacement les populations de lymphocytes de PPs permettant l’évaluation reproductible écoulement cytometry des sous-ensembles de T et les lymphocytes B se concentrant principalement sur des sous-ensembles de cellules TFH et GC B.

Contrairement à un précédent protocole20, nous avons observé que le PPs ne sont pas répartis uniformément sur le SI mais sont localisées plus dense vers les extrémités proximales et distales de l’is, comme le montre Figure 1 a. Analyse en cytométrie en flux a montré que, si suivies correctement, notre protocole donne une population de lymphocytes PP illustrant la distribution de diffusion vers l’avant...

Dans cette étude, nous présentons un roman et un protocole efficace pour isoler des lymphocytes de plaques de Peyer (PPs), qui peuvent être utilisés ultérieurement pour des essais fonctionnels in vivo et in vitro , mais aussi des études cytométrie en flux de T folliculaire d’assistance et des cellules germinales Centre B.

Démêlé les acteurs clés de l’immunité humorale : avancé et optimisé protocole d’isolement de Lymphocyte de patchs murin de Peyer

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Cette méthode peut répondre à des questions clés sur le phénotype du patch de souris Peyer isolé sous-ensembles de cellules T et B. En particulier, l’aide folliculaire T et les populations de cellules B du centre germinal. Le principal avantage de cette technique est qu’elle dispense de plusieurs étapes laborieuses de préparation telles que la digestion basée sur le collagène qui compromettent la qualité et l’identité des lymphocytes isolés.Commencez par placer une souris dans la position supine et stériliser l’abdomen avec 70% d’éthanol. Faire une incision abdominale de midline à travers la peau et le péritoine du pubis à la cage thoracique pour ouvrir la cavité péritineal et localiser le cécu et la jonction ileocecal. Faire aussi distal que possible couper à la jonction pour séparer l’intestin grêle de la ccum.Couper la mesenterie avec des ciseaux pour enlever soigneusement l’intestin grêle entier jusqu’au sphincter pylorique. Couper la jonction entre le pylorus et le dudénome pour détacher complètement l’intestin grêle de la cavité abdominale et placer l’intestin grêle isolé dans un puits d’une plaque de 6 puits contenant le milieu froid de RPMI complété avec le sérum bovin foet

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Peptide: CMH tétramère basée sur l&#39;enrichissement des cellules T spécifiques d&#39;épitopes

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Isolement de lymphocytes à partir d'un patch de Peyer de souris

Il ya un intérêt croissant pour la compréhension des fonctions immunologiques des sous-populations spécifiques de cellules dans les plaques de Peyer (PP), les sites principaux inducteurs de tissus lymphoïdes associés à l'intestin. Ici, nous décrivons les protocoles parallèles pour la préparation PP préparations cellulaires simples pour l'analyse par cytométrie en flux et cryosections PP immunomarquage.

Et isoler immunocoloration des lymphocytes et des cellules dendritiques à partir des plaques de Peyer murin de

Avec des fonctions effectrices distinctes des autres sous-ensembles de cellules T, les cellules Th17 ont été impliqués dans l'auto-immunité centre inflammatoire. Cette vitro Th17 protocole de différenciation fournit un moyen de déterminer si les lymphocytes T CD4 + naïfs peuvent se différencier en cellules Th17, et d'examiner leur rôle dans l'auto-immunité et réponse de l'hôte.

L&#39;isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Ce protocole décrit en détail une méthode pour isoler des cellules présentant l'antigène à partir de thymus humain par l'intermédiaire de différentes étapes de digestion enzymatique du tissu suivie d'une centrifugation de densité de la suspension de cellules individuelles et enfin le tri magnétique et / ou FACS des populations de cellules d'intérêt.

Isolement des cellules dendritiques myéloïdes et les cellules épithéliales du thymus humain

Les lymphocytes sont les principaux acteurs des réponses immunitaires adaptatives. Ici, nous présentons un protocole de purification des lymphocytes pour déterminer les fonctions physiologiques des molécules souhaitées dans l’activation des lymphocytes in vitro et in vivo. Les procédures expérimentales décrites conviennent pour comparer les capacités fonctionnelles entre les lymphocytes témoins et les lymphocytes génétiquement modifiés.

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Visualisation de l&#39;IL-22 exprimant Lymphocytes en utilisant des souris Reporter

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolement des lymphocytes des sites inductives y compris les plaques de Peyer tissu lymphoïde associé au tube digestif et les ganglions lymphatiques mésentériques drainants et les sites d’effecteur notamment la lamina propria et de la épithélium intestinal du petit système immunitaire intestinal.

Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit

La méthode BSelex pour identifier et récupérer les anticorps individuels spécifiques à l'antigène des cellules mononucléaires périphériques humaines combine la cytométrie du flux avec pcR à cellule unique et le clonage.

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Présenté ici est un essai pour quantifier l’hypermutation somatique dans le locus de gène de chaîne lourde d’immunoglobuline utilisant les cellules b germinales de centre des corrections de Peyer de souris.

Analyse de l’hypermutation somatique dans l’intron JH4 des cellules B du Centre Germinal à partir des patchs de Mouse Peyer

Découvrez un protocole optimisé d'isolement de lymphocytes des plaques de Peyer murines sans digestion par collagénase. Cette méthode améliore la qualité cellulaire pour l'étude des lymphocytes T folliculaires et des cellules B des centres germinatifs.

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Démêlé les acteurs clés de l’immunité humorale : avancé et optimisé protocole d’isolement de Lymphocyte de patchs murin de Peyer

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