Name: Un modèle de lymphome de B-cellule souris syngénique pour évaluation préclinique des cellules de T de voiture CD19 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Découvrez la production de cellules CAR-T murines CD19 par transduction rétrovirale pour traiter le lymphome B syngénique A20 chez la souris BALB/c. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité thérapeutique selon le conditionnement lymphodéplétique.

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Nous tenons à remercier Bloodwise pour le financement de cette recherche (subvention 13031) et les installations CRUK Manchester de ressource biologique unité, imagerie et cytométrie en flux et biologie moléculaire de base pour soutenir ce travail.

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</ol>

David Gilham travaille pour Celyad qui est impliqué dans la production de lymphocytes T de la voiture. Le reste des auteurs n’ont rien à divulguer.

Modèles murins syngéniques permettent de tester de thérapie et de la progression de la maladie tout en conservant un système immunitaire intact. Ceci est primordial lorsqu’il s’agit de thérapies qui interagissent avec le système immunitaire et en particulier pour les agents immunothérapeutiques.
Le protocole décrit ici a deux volets de l’essentiel, l’une est modifier génétiquement les lymphocytes T souris pour exprimer des voitures. Cela nécessite 7 jours d’initiation à la validation de la transduction. Concomitante avec la production de lymphocytes T de voiture est la mise en place de lymphome systémique chez la souris. Devrait la production de cellules T voiture échouer ou être de qualité insuffisante, il n’y a généralement pas assez de temps pour produire des cellules de remplacement avant la souris succomber au lymphome. Il est donc essentiel que chercheurs utilisant ces modèles avec précision réaliser des études de tumeur dosage et maladie de progression afin de temps avec succès la production de lymphocytes T de voiture pour l’administration thérapeutique.
Motifs typiques de faible efficacité de transduction cellulaire T comprend l’efficacité médiocre de transfection des cellules de producteur, généralement causé par la pureté du plasmide pauvres ou inexacte détermination du pH des médias de transfection. Il est recommandé de vérifier l’efficacité de transfection cellulaire producteur avant d’entreprendre le protocole complet comme pauvre transfection va limiter l’efficacité de la transduction des lymphocytes T. Les fragments de fibronectine humaine recombinante peuvent être recueillis et stockés à-20 ° C pour la réutilisation, toutefois, plusieurs résultats de gel-dégel l’efficacité réduite de transduction. Traitement rapide des rates de souris après que collection est également importante pour l’obtention de haut rendements des cellules viables de T.
Il est à noter que le protocole décrit ici utilise les cellules A20 exprimant la luciférase. C’est préférable car il permet de mesurer le fardeau tumoral systémique par imagerie de bioluminescence. Toutefois, en présence d’un système immunitaire fonctionnel, les réponses à la luciférase pourraient fausser les résultats. Nous avons déjà testé les réactions immunitaires de survie des souris au marqueur transgènes17. Il est essentiel pour répliquer les expériences clés à l’aide de cellules A20 gratuites de transgènes à valider que ceux-ci ne jouent pas un rôle important dans l’élimination de la tumeur par des cellules immunitaires.
Tandis que les agents cliniques ne peuvent être utilisés in vivo chez des souris immunodéficientes, l’utilisation de cellules de T de voiture souris contre les cellules cancéreuses de souris nous permet d’évaluer la contribution du système immunitaire à la progression de l’efficacité ou la maladie thérapeutique. Ce protocole pourrait être utilisé pour l’évaluation préclinique des voitures ciblant le lymphome à cellules B ou autres voitures avec modifications telles que la sécrétion d’IL-12 comme décrit ici. Il est à noter que bien que l’interaction entre les cellules immunitaires peut être évaluée dans des modèles murins syngéniques, ils peuvent récapituler pas avec précision l’interaction dans les humains en vivo. De particulier noter, humaine et souris voitures variera dans la structure qui peut-être avoir des conséquences en aval ; activation et cell culture des conditions optimales pour la croissance des cellules T sont différents20, distribution tissulaire de l’expression de l’antigène cible peut varier entre les humains et les souris et toxicités expérimentées peuvent être radicalement différentes. Il est donc essentiel d’utiliser ex vivo et modèles xénogéniques pour corroborer les résultats.
En résumé, les syngénique lymphodepleted et lymphoreplete modèle de lymphome récapitulent les patients avec et sans préalable chimio/radiothérapie. Ceci fournit un système modèle imiter les paramètres cliniques pour permettre l’essai d’une gamme de stratégies thérapeutiques qui sera important pour la prochaine vague de nouveaux agents d’immunothérapie.
Avec l’utilisation de pré-conditionnement, on notera que toutes les souris résolvent habituellement le lymphome. Avec jusqu'à des taux de 90 % de réponse complète chez l’homme, c’est représentant. Cependant, les défis pour la thérapie de lymphocytes CD19 voiture dépendra empêchant la fréquence élevée des rechutes observées qui sont souvent CD19. Les rechutes n’ont pas été observées dans ce modèle jusqu'à et souvent au-delà de 100 jours. Modifications pour imiter les rechutes vus la clinique pourraient aider avec les futurs défis de la thérapie de cellules CD19 voiture T.

Thérapie de T-cell receptor (voiture) antigène chimérique a montré étonnant succès clinique dans le traitement du CD19+ malignes menant à l’approbation du tisagenlecleucel pour les cas de rechute de leucémie lymphoblastique aiguë1 et axicabtagene ciloleucel pour progressive grand B-cellule lymphomes non hodgkiniens2 en 2017.
L’importance des Interactions entre le cancer et le système immunitaire en progression de la maladie et les mécanismes thérapeutiques devient de plus en plus reconnu3,4,5. Par exemple, il est bien documenté que le microenvironnement tumoral (TME) est inondé avec les facteurs qui peuvent supprimer les fonctions effectrices des cellules immunitaires6,7,8. Amorçage de cellules immunitaires endogènes et épitopes peut également être une clé dans l’éradication de la tumeur et la résistance à long terme de tumeur défi9,10. Deux de ces phénomènes ne peuvent être évaluées dans les modèles xénogéniques qui n’ont pas un système immunitaire. De même, les systèmes utilisant des protéines transgéniques ne reflètent pas exactement le défi de la rupture de tolérance immunitaire qui est requise pour des épitopes,11,12. Un modèle syngénique dont le système immunitaire entièrement fonctionnel est donc primordial pour la modélisation de ces aspects importants des traitements de progression et immunitaire de la maladie du cancer.
Une importante mise en garde de la thérapie de lymphocytes-T de voiture est que LYMPHODÉPLÉTEUR conditionnement préalable est nécessaire pour le succès thérapeutique13,14. Ceci est généralement réalisé chez des patients par l’administration d’une chimiothérapie avant la perfusion de cellules de T de voiture15,16. Comme une méthode standard, afin d’imiter les lymphodepletion utilisée dans le cadre de patients, nous administrons 5 irradiation corporelle totale de Gy (TBI) pour atteindre lymphodepletion avant l’administration de cellules de T de voiture thérapeutiques à des souris portant le lymphome à cellules B A20 systémique.
Alors que LYMPHODÉPLÉTEUR conditionnement préalable n’est pas un problème pour la majorité des patients, toxicité qui vient avec des agents chimiothérapeutiques signifie que les patients de faible ne sont pas éligibles à un traitement voiture T-cell. Pour créer un système de test qui représente les patients non éligibles pour lymphodepletion, nous avons établi un modèle de souris syngénique lymphoreplete dans lequel nous modélisons la thérapie voiture T-cellules de lymphome. Dans ce modèle, nous avons montré que la sécrétion d’IL-12 au sein de cellules de T de voiture pourrait conduire à l’éradication du lymphome établie avec un taux de réussite de ~ 25 %17. En outre, nous avons montré que les cellules immunitaires endogènes étaient impliqués dans l’éradication du cancer.
Ici nous décrivons en détail le protocole pour la production des cellules de souris de voiture T, établissant des lymphomes chez la souris syngéniques et traitement du lymphome à cellules T de voiture avec ou sans l’utilisation de LYMPHODÉPLÉTEUR le préconditionnement. Ceci peut être utilisé pour l’étude de la combinaison de cellules de T de voiture avec d’autres agents, tests de cellules de T de voiture avec autres transgènes ou d’utiliser d’autres stratégies de thérapie ou d’immunothérapie adoptive cellulaire contre le lymphome.

<table><tbody><tr><td>0,2 et micro ; filtre à seringue Appleton</td><td>Woods</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>0.45 & micro ; Filtre à seringue</td><td>Appleton Woods</td><td>FC122</td><td></td></tr><tr><td>1,5ml pilon et microtube</td><td>VWR</td><td>431-0098</td><td></td></tr><tr><td>100X pénicilline-streptomycine-glutamine (PSG)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de blasticidine</td><td>S Sigma- Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>Filtre supérieur de bouteille (0,2 & micro ; m)</td><td>Fournitures de laboratoire scientifique</td><td>FIL8192</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 711 anticorps anti-souris CD8a</td><td>BioLegend</td><td>100759</td><td>dilution de coloration de 1 sur 100. Clone 53-6.7</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 785 anti-souris CD4 Anticorps</td><td>BioLegend</td><td>100552</td><td>dilution de coloration de 1 sur 100. Clone RM4-5</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Perles de comptage cellulaire &ndash ; CountBright billes de comptage absolues</td><td>Sondes moléculaires</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>Crépine de cellule 100&mu ; m</td><td>VWR</td><td>734-0004</td><td></td></tr><tr><td>Cyclophosphamide Monohydrate</td><td>Merck</td><td>239785-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medium Eagle modifié (DMEM) - High Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6546</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-1440-03</td><td>Vendu par Sigma- Aldrich</td></tr><tr><td>Cytomètre en flux - LSR Fortessa x20</td><td>BD Biosciences</td><td>658222R1</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>Appleton Woods</td><td>HC001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES solution</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H0887&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>IL-12 p70 Souris non coated ELISA Kit</td><td>Invitrogen</td><td>88-7121-76</td><td></td></tr><tr><td>IL2, Proleukin</td><td>Novartis</td><td>PL 00101/0936</td><td></td></tr><tr><td>in vivo système d’imagerie par bioluminescence &ndash ; in vivo xtreme II système d’imagerie</td><td>Bruker</td><td>T149094</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycine Calcium Salt</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Coloration vivante/morte - Zombie Violet Kit de viabilité fixable</td><td>BioLegend</td><td>423114</td><td>Luminomètre de dilution de coloration 1 sur 100</td></tr><tr><td>- Lumistart Omega</td><td>BMG Labtech</td><td>415-301</td><td></td></tr><tr><td>Murin IFN-&gamma ; Kit ELISA</td><td>Diaclone</td><td>861.050.010</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP229540</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Platinum E lignée cellulaire</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-101</td><td>(RRID :CVCL_B488)</td></tr><tr><td>Clone purifié NA/LE Hamster Anti-Souris CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553294</td><td>&nbsp ; 37.51</td></tr><tr><td>Purifié NA/LE Hamster Anti-souris CD3&epsilon ;</td><td>BD Biosciences</td><td>553057</td><td>Clone &nbsp ; 145-2C11&nbsp ;</td></tr><tr><td>Anti-souris anti-souris purifié CD16/CD32 (bloc BD Fc de souris)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>dilution de coloration de 1 sur 100. Clone 2.4G2</td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Fragment de fibronectine humaine recombinante - Réactif RetroNectin</td><td>TaKaRa</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante IL-7 (sans porteur)</td><td>BioLegend</td><td>577806</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges</td><td>eBioscience</td><td>004-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine - EDTA solution</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T3924&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

un modèle de lymphome de b-cellule souris syngénique pour évaluation préclinique des cellules de t de voiture cd19

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

L’étonnant succès clinique de thérapie de T-cell receptor (voiture) CD19 antigène chimérique a mené à l’approbation des récepteurs d’antigènes chimérique de deux seconde génération (RAC) pour les lymphomes de leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) et-hodgkiniens (LNH). L’objectif du champ est désormais sur l’émulation de ces succès dans d’autres malignités hématologiques où on observe des taux de réponse complète moins impressionnants. Ingénierie de plus de cellules de T de voiture ou de l’administration concomitante d’autres modalités de traitement peut avec succès surmonter les obstacles à une thérapie réussie dans d’autres contextes de cancer.
Par conséquent, nous présentons un modèle dans lequel d’autres peuvent mener des essais précliniques de cellules CD19 voiture T. Résultats dans ce modèle de lymphome de B-cellule bien testé sont susceptibles d’être informative thérapie de lymphocytes-T de voiture en général.
Ce protocole permet la production reproductible de souris les cellules de T de voiture par le biais de phosphate de calcium transfection des cellules de producteur de Plat-E avec MP71 constructions rétrovirales et plasmide d’emballage pCL-Eco suivie de collecte des particules rétrovirales sécrétées et transduction par centrifugation et fragment de fibronectine humaine recombinante. Validation de transduction rétrovirale et la confirmation de la capacité des cellules de T de voiture pour tuer cible lymphome des cellules ex vivo, grâce à l’utilisation de la cytométrie en flux, luminometry et immuno-assay (ELISA), est également décrite.
Protocoles d’essai voiture T cells in vivo dans lymphoreplete et souris syngénique lymphodepleted, portant des lymphomes établie, systémiques sont décrites. Une activité anticancéreuse est surveillée par in vivo bioluminescence et maladie la progression. Nous montrons les résultats typiques de l’éradication de lymphome à cellules B établie lors de l’utilisation de 1er ou 2ème génération voitures en combinaison avec LYMPHODÉPLÉTEUR le préconditionnement et une minorité de souris atteinte des rémissions à long terme lors de l’utilisation de voiture T cellules exprimant IL-12 chez la souris lymphoreplete.
Ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer des cellules de T de voiture CD19 avec différente modification supplémentaire, combinaisons de cellules de T de voiture et d’autres agents thérapeutiques ou adaptés pour l’utilisation de cellules de T de voiture contre des antigènes cibles différents.

Pour la transduction de rendement élevé de lymphocytes T, il est nécessaire d’obtenir des particules rétrovirales fraîches. Transfection de la lignée cellulaire de Plat-E avec pCL-Eco producteur plasmide et plasmide rétrovirus pMP71 donne lieu à la sécrétion des particules rétrovirales dans la cellule surnageante. Quand un gène marqueur fluorescent, tels que mCherry, est codé dans le rétrovirus, transfection réussie peut être confirmée par microscopie de fluorescence (Figure 1). Surnageant contenant le virus des cellules transfectées de Plat-E sert à transduce NKT via 2 tours d’essorage-fection sur des plaques de revêtement fragment la fibronectine. L’efficacité de la transduction peut être déterminée en 4 jours après la transduction par cytométrie en flux. Avec succès transduits cellules expriment le gène marqueur encodé dans le rétrovirus (Figure 2). Efficacité de transduction varie de ~ 50-90 % d’efficacité avec les récepteurs de la première génération de ~ 10 à 40 % avec voiture construit à proximité de la capacité de l’emballage rétrovirale. Tandis que l’expression du gène marqueur montre transduction retroviral réussie, il est primordial de montrer la fonctionnalité des cellules de T de voiture à engager avec les cellules de cet antigène cible explicite sur leur surface. Lignées de cellules de cible modifiées à la luciférase express peuvent être utilisées dans les essais de la luciférase pour tester le degré de cellule-tuer par les cellules de T de voiture directement (Figure 3 a). La libération de cytokines effectrices des cellules T de voiture sur co-culture avec des cellules cibles, déterminés par ELISA, peut également être utilisée comme une mesure indirecte de la cytotoxicité des cellules T de voiture (Figure 3 b et 3C).
Cellules de T de voiture produites dans le présent protocole peuvent être évaluées chez des souris lymphoreplete en établissant le lymphome systémique de A20 avec une dose de 100 mg/kg de cyclophosphamide (injectée intraveineuse), 1 jour avant l’injection IV de 5 x 105 cellules A20 (Figure 4). Injection d’IP avec la luciférine et image capture à l’aide d’un imageur de bioluminescence in vivo peut être utilisée pour surveiller la charge tumorale en utilisant un temps de retour sur investissement et l’exposition constant tout au long de la (Figure 5 a-C). Cellules de T de voiture modifiées d’IL-12 express sont capables d’éradiquer le lymphome systémique avec LYMPHODÉPLÉTEUR pré conditionnement donnant la survie sans maladie dans environ 25 % des souris (Figure 5). LYMPHODÉPLÉTEUR préconditionnement, réalisé par 5 Gy TBI 1 jour avant l’administration IV de cellules de T de voiture, améliore significativement la greffe (Figure 6). Dans ce modèle, première génération voiture NKT est capables d’éradiquer systémique A20 lymphome, typiquement induisant la survie sans maladie à 100 % des souris (Figure 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig1.jpg"> Figure 1. Confirmation de la transfection réussie des cellules Plat E. Plat-E des cellules transfectées avec retroviral construction de voiture et de pMP71 et de pcl-Eco Emballages vecteur l’ADN de plasmide. Transfection réussie est illustrée par l’expression du gène marqueur fluorescent mCherry. A) au microscope à fond clair, B) microscopie en fluorescence et C) images fusionnées sont affichées. Grossissement = 50 X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig2.jpg"> Figure 2. Déterminer l’efficacité de la transduction par cytométrie. Cytométrie en flux est utilisée pour déterminer l’efficacité de la transduction des cellules T de la souris sur la transduction de post jour 4, à l’aide de Zombie UV live/dead, mCherry, BV711 et BV785 pour la détection de la vivre, CAR construire, les cellules CD4 et CD8, respectivement. Des résultats représentatifs de A) Non-transduites, B) mCherry.αmCD19.mCD3z et C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 sont affichés avec blocage de 1) 2 maillots de corps) vivent les cellules 3) CD4 et CD8 4) et 5) évaluation des cellules positives mCherry exprimant la voiture. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig3.jpg"> Figure 3. Validation de l’activité des lymphocytes T voiture. ΑmCD19 voiture NKT est cultivés conjointement avec les cellules de lymphome A20 modifiées à la luciférase express (1 x 10,4: 1 x 104) pendant 16 h dans une plaque de fond U 96 puits. Après la co-culture, cellules étaient granulées et surnageant ont été recueilli. A) des cellules ont été remises en suspension dans du PBS et luminometry a été utilisé pour évaluer la viabilité des cellules cibles. Surnageant de culture mixte a été évaluée pour la présence d’IFNγ (B) et d’IL-12 (C). Le ratio de cellules de T de voiture pour cibler les cellules et durée de la période de co-culture doivent être optimisés pour chaque voiture, construire et cibler la lignée cellulaire. Traitement de PMA et ionomycine peut servir de témoin positif pour confirmer la qualité des cellules T et les cellules de leur capacité à répondre. Barres d’erreur afficher SD. statistique analyse a été réalisée à l’aide d’ANOVA à. p &lt; 0,001). Ce chiffre a été modifié par17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig4.jpg"> Figure 4. Instituant l’A20 lymphome sans lymphodepletion. Cyclophosphamide peut augmenter l’efficacité de l’induction de lymphome sans causer de lymphodepletion. A) numération globulaire de souris BALB/c 6-8 semaines après l’accouchement IV de 100 mg/kg de cyclophosphamide. Barres d’erreur afficher SD B) charge de lymphome de souris BALB/c 6-8-semaines après livraison IV de 100 mg/kg de cyclophosphamide ou de sérum physiologique le jour -1 et IV des cellules de 5 x 105 A20 au jour 0, mesurée à l’aide d’un luminomètre. C) survie des souris en B). Barres d’erreur afficher SD. statistique analyse a été réalisée à l’aide de 2-way ANOVA. ** p &lt; 0,01, *** p &lt; 0,001). Ce chiffre a été modifié par Kueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig4large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig5.jpg"> Figure 5. Suivi de charge de lymphome et de survie. Souris porteuses A20 lymphome exprimant la luciférase reçoivent 100 µL (IP) des injections intrapéritonéales de luciférine de 30 mg/mL et ont été photographiés à l’aide d’une bioluminescence in vivo , système d’imagerie. A) souris ont été exposées pendant 1 min sur la face ventrale et immédiatement capotés à image dorsale pour ramasser des masses tumorales sur les deux côtés du corps (B). C) des résultats représentatifs de la charge de lymphome de souris BALB/c recevoir diverses cellules de T de voiture de αmCD19 sans lymphodepletion. Barres d’erreur afficher SEM. D) les taux de survie des souris mêmes. Ce chiffre a été modifié par Kueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig5large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig6.jpg"> Figure 6. Effets de lymphodepletion. A) numération globulaire de souris BALB/c 6-8-semaines après avoir reçu 5 Gy TBI à un débit de dose de 0,02 Gy/min ; barres d’erreur afficher SD. statistiques analyse de variance bidirectionnelle. p &lt; 0,05, ** p &lt; 0,01, *** p &lt; 0,001. B) CD8 et surveillance des CD4+ + T de voiture des cellules dans le sang périphérique de souris par cytométrie de flux pour l’administration mCherry marqueur génétique 7 jours post. Barres d’erreur afficher SD Ce chiffre a été modifié par Kueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig6large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58492/58492fig7.jpg"> Figure 7. L’activité des cellules de T voiture avec LYMPHODÉPLÉTEUR le préconditionnement. Résultats typiques montrant l’effet de 5 Gy TBI le jour avant l’administration de lymphocytes-T de voiture. A) affichages graphiques imagerie et (B) de l’imagerie des souris après 100 µL (IP) des injections intrapéritonéales de luciférine de 30 mg/mL à l’aide d’une bioluminescence in vivo , système d’imagerie. Barres d’erreur afficher SEM. C) la survie des souris mêmes. Ce chiffre a été mis à jour le fromKueberuwa et al. 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58492/58492fig7large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous présentons ici un protocole pour la production et les essais précliniques de cellules de T de voiture CD19 murines par transduction rétrovirale et utilisation comme thérapie contre établie syngénique A20 lymphome B chez la souris BALB/c avec ou sans LYMPHODÉPLÉTEUR pré conditionnement.

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Cette méthode peut nous aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie immunitaire à cellules T de la RCA, telles que la modification génétique des cellules T de la RCA et la combinaison avec d’autres thérapies immunitaires. Le principal avantage de cette technique est que permet des comparaisons entre le Lympho rempli et les paramètres lympho épuisés. Ceci nous permet de voir le rôle des cellules immunitaires endogènes dans la progression de la maladie et leur interaction avec les T-cells.The thérapeutiques de CAR.L’implication de cette technique comme 10 à la thérapie sur le diagnostic de la tumeur pleine parce que les leçons apprises dans ce modèle peuvent être directement traduites à la maison de sucrerie avec d’autres cibles telles que CEA. Pour commencer cette procédure. Tout d’abord, préparez tous les supports et cellules nécessaires tels qu’ils sont décrits dans le protocole texte. Le premier jour à des plats de culture complets DMEM à 15 centimètres carrés. Graines 7,5 millions de platine E-Cells dans ces plats et incuber pendant la nuit à 37

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Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure d'activation de CD40-et à l'expansion des cellules B murines à partir de splénocytes de souris C57BL / 6, qui peut être utilisé comme un modèle de cellule présentatrice d'antigène (APC) pour étudier l'induction de l'immunité.

Modèle murin de CD40-activation des cellules B

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