Un modèle d’embryon de poisson zèbre pour In Vivo visualisation et analyse Intravitale du biomatériau associée à Staphylococcus aureus Infection

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon dont les biomatériaux influencent la susceptibilité à l’infection, comment ils influencent la progression de ces infections, et comment ils affectent le comportement des cellules immunitaires autour de ces biomatériaux in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit un nouveau modèle animal qui permet la visualisation in vivo et l’analyse intravitale des infections associées aux biomatériaux. La démonstration visuelle de cette méthode est critique car l’injection de microsphériques biomatériaux est une procédure très délicate.

Pour générer une suspension à bactéries seulement, transférez d’abord quatre à cinq colonies de la souche fluorescente Staph aureus mCherry, cultivés sur des plaques tryptiques d’agriculture de système complétées par 10 microgrammes par millilitre de chloramphénicol en 10 millilitres de bouillon de systeptique complétés par du chloramphéniophol, pour une croissance dans la phase de croissance mi-logarithmique à 37 degrés Celsius avec secousses. Lorsque la culture atteint une mesure de densité optique à 620 nanomètres de 0,4 à 0,8, recueillir les bactéries par centrifugation, et laver les cellules deux fois avec un millilitre de PBS stérile par lavage. Après le deuxième lavage, resuspendre la pastille en 1,1 millilitres de PVP, et vortex la suspension bactérienne avant de mesurer la densité optique à nouveau.

Ajustez ensuite la concentration de la suspension bactérienne avec pvp selon les exigences expérimentales pour générer la suspension bactéries seulement. Pour générer une suspension de microsphère bactérienne, centrifugeuse microsphériques de polystyrène commercial, PS-10, et de résuspendre la pastille de microsphère dans la suspension bactéries seulement. Diluer la suspension de la microsphère bactérienne avec un volume de 1/2 de PVP pour atteindre une concentration appropriée de bactéries dans la suspension qui est d’environ 2/3 de celle de la suspension bactéries seulement.

Mélanger la suspension par vortex. Pour vérifier la concentration de la suspension de microsphère bactéries seulement et bactéries, ajouter 100 microlitres de chaque suspension aux puits individuels d’une plaque de 96 puits. Diluer en série 10 aliquots microlitres des suspensions dans 90 microlitres de PBS stériles dans les puits suivants, en utilisant des conseils frais pour chaque étape de dilution.

Appliquez des aliquots de 10 microlitres en double des suspensions bactériennes non diluées et diluées sur les plaques d’agar, et incubez les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, comptez les colonies pour calculer le nombre de bactéries dans les suspensions de microsphère préparées uniquement par les bactéries et les bactéries. Après avoir recueilli les embryons de poisson zèbre, jetez les embryons non transparents non viables et incubez environ 60 embryons par boîte de Pétri de 100 millilitres à 28 degrés Celsius dans un milieu E3 frais.

Après anesthésie, séquestrer les embryons gfp-positifs pour la microscopie de fluorescence. Transférez-les dans une boîte petri de 100 millilitres de milieu E3. Pour créer un moule d’injection, remplissez une boîte de Pétri de 100 millilitres d’un à 1,5 % d’agarose liquide.

Utilisez un modèle de moule en plastique pour créer des rainures dans l’agarose. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, enlever le moule, et couvrir l’agar avec e3 moyen complété avec 0,02%tricaine. Un jour trois post-fertilisation, utiliser des forceps pour briser la pointe d’une aiguille microcapillllaire en verre tiré pour obtenir des pointes avec un diamètre externe d’environ 20 micromètres sous un microscope léger avec une barre d’échelle dans l’oculaire.

L’ajustement de l’ouverture de la pointe de l’aiguille est pratique pour l’injection de microsphère. Le diamètre de l’ouverture doit être ajusté pour les microsphériques de différentes tailles. Ensuite, utilisez une pointe de pipette Microloader pour charger l’aiguille avec environ 20 microlitres de la microsphère bactérienne ou de la suspension bactérienne seulement, et monter l’aiguille sur un micromanipulateur relié à un microinjecteur.

Maintenant, transférez les embryons sélectionnés à la plaque d’agarose rainurée. Après avoir attendu cinq minutes pour que les embryons soient anesthésiés, aligner les embryons dans les rainures en une seule orientation pour leur injection. Réglez le microinjecteur dans les paramètres d’injection appropriés et insérez l’aiguille dans le tissu musculaire du premier embryon à un angle de 45 à 60 degrés au microscope stéréo.

Déplacez doucement l’aiguille d’avant en arrière pour ajuster la position dans le tissu au besoin, et utilisez la pédale de pied de microinjecteur pour injecter la suspension chargée. Lors de l’injection d’une suspension de microsphère bactérienne dans le tissu des embryons de poisson zèbre, l’aiguille doit être insérée doucement, mais avec une main ferme. Après une insertion réussie, un espace doit être créé pour les matériaux avant l’injection.

Lorsque tous les embryons ont été injectés, marquer les embryons pour une injection réussie au microscope à fluorescence stéréo, et maintenir les embryons dans e3 milieu sans tricaine dans les puits individuels de plaques de 48 puits avec des changements moyens quotidiens. Pour surveiller la progression de l’infection par quantification des unités formant des colonies, transférez au hasard cinq à six embryons infectés viables dans des microtubes individuels de deux millilitres peu de temps après l’injection, et lavez doucement les embryons avec du PBS stérile. Après avoir jeté les lavages, ajouter 100 microlitres de PBS stérile à chaque tube, suivi de deux à trois perles stériles de zirconia de deux millimètres de diamètre.

Ensuite, écraser les embryons dans un homogénéisateur à 3500 rpm pendant 30 secondes, et la culture de l’homogénéité comme démontré. Placez une boîte petri de 100 millimètres contenant e3 moyen complété avec 0,02% tricaine sur un stade de microscope à fluorescence stéréo, et ajouter 500 microlitres de 2% méthylcellulose dans la boîte de Petri. Pour surveiller l’évolution de l’infection par microscopie par fluorescence, équipez les filtres fluorescents et à champ lumineux appropriés, alignez horizontalement les embryons infectés anesthésiés dans une tache de méthylcellulose dans une boîte de Pétri.

Utilisez le filtre à champ lumineux pour mettre en lumière le tissu injecté endommagé lors d’un grossissement de 160 x. Réglez la profondeur de la pile Z à 10 micromètres et la taille de l’étape à cinq micromètres pour permettre l’enregistrement de trois images consécutives. Puis imagez les embryons individuels dans des réglages optimisés identiques à un grossissement 160x.

Utilisez le plugin ObjectJ dans ImageJ pour analyser les images. L’injection intramusculaire de Staph aureus déclenche une infection dépendante de la dose chez les embryons, avec une progression viable de l’infection observée chez les embryons administrés à des doses à haut défi aux jours un et deux après l’injection. Comme démontré, il est possible d’injecter un nombre similaire de bactéries en présence ou en l’absence de microsphériques.

Typiquement, tous les embryons avec plus de 20 unités colonie-formation de Staph aureus mCherry sont positifs pour la fluorescence sous la notation microscopique, bien que la présence des microsphériques semble ne pas influencer de manière significative la progression d’infection dans les embryons contestés à faible dose. Chez les embryons à dos élevé, la notation microscopique ne démontre aucune différence dans la fréquence des embryons infectés avec ou sans microsphériques, mais la culture quantitative révèle des nombres d’unités de formation de colonies plus élevés prélevés sur des embryons dans le groupe staph aureus plus microsphère par rapport à ceux récoltés dans le groupe Staph aureus seulement à deux jours après l’injection. La présence d’un biomatériau influence à la fois la réponse des cellules immunitaires et la susceptibilité initiale à l’infection.

Par exemple, à cinq heures après l’injection, l’infiltration de macrophages en réponse à une injection staph aureus seulement est significativement plus élevée qu’en réponse à un aureus staphylocoque plus l’injection de microsphériques, tandis qu’à un jour après l’injection, les embryons avec des microsphériques présentent des niveaux significativement plus élevés d’infection à Staph aureus que les embryons sans microsphère. Il est important de se rappeler d’ajuster toujours l’ouverture de la pointe de l’aiguille à la taille des biomatériaux et d’ajuster le rapport de la concentration de bactéries dans la suspension bactéries seulement et la suspension de la microsphère bactérienne. Ce modèle embryonnaire de poisson zèbre permet la visualisation in vivo et l’analyse intravitale de la progression de l’infection et des réponses des cellules immunitaires provoquées en présence et en absence de biomatériaux.

Cette technique fournit un nouveau modèle animal entier pour le développement de biomatériaux antimicrobiens et de stratégies de traitement pour des dispositifs médicaux sûrs.